ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris Published: February 25, 2010 doi: 10.3791/1862

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maria Weidner¹, Marcus Taupp¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון באמצעות שמרים methylotrophic

Abstract

ביטוי החלבון על pastoris Pichia חיידקים אוקריוטים לארח מציעה את האפשרות לייצר כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי במערכת ביטוי מהירה וקלה לשימוש.

בתור מיקרואורגניזם חד תאיים P. pastoris קל לתפעל גדל במהירות על מדיה זולה בצפיפויות גבוהות התא. להיות eukaryote, פ pastoris הוא מסוגל לבצע רבים שלאחר translational שינויים שבוצעו על ידי התאים האיקריוטים גבוהה את החלבונים רקומביננטי שהושגו לעבור קיפול חלבונים, עיבוד פרוטאוליטי, היווצרות קשר דיסולפיד glycosylation ו [1].

כפי שמרים פ methylotrophic pastoris מסוגל חילוף חומרים מתנול כמקור פחמן הבלעדי. האמרגן חזק מונואמין אלכוהול, AOX1, מוסדר בחוזקה המושרה על ידי מתנול הוא משמש הביטוי של הגן של עניין. לפיכך, הביטוי של חלבון זר יכול להיגרם על ידי הוספת מתנול עד בינוני הצמיחה [2, 3].

יתרון חשוב נוסף הוא הפרשת חלבון רקומביננטי לתוך מדיום גידול, תוך שימוש ברצף אות למקד את החלבון זרים מסלול הפרשה של pastoris פ. רק עם רמות נמוכות של חלבון אנדוגני המופרש לתקשורת על ידי שמרים עצמו ולא חלבונים להוסיף התקשורת, חלבון Heterologous בונה את רוב החלבון הכולל במדיום ומקל על הצעדים הבאים טיהור חלבון [3, 4].

וקטור משמש כאן (pPICZαA) מכיל את מקדם AOX1 לביטוי מוסדר היטב מתנול-Induced, של הגן של ריבית; האות α-factor עבור הפרשת הפרשת חלבון רקומביננטי, גן עמידות Zeocin לבחירה בשני E. coli ו Pichia ו פפטיד C-מסוף המכיל את c-myc epitope ו (6xHis) polyhistidine תג זיהוי וטיהור של חלבון רקומביננטי. אנחנו גם מראים ניתוח כתם המערבי של חלבון רקומביננטי באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד myc-HRP הכרה epitope c-myc על וקטור האב.

Protocol

ביטוי של חלבונים רקומביננטי ב pastoris שמרים methylotrophic Pichia

לפני שאתם מתחילים בפרוטוקול זה אתה צריך הגן העניין שלך משובטים באותה מסגרת בתוך פ הורה pastoris וקטור אותו רצף לבדוק הכניסה הנכונה של הגן של עניין וקטור.

שלב I: יצירת תאים שמרים electrocompetent, לינאריזציה של לבנות ושל והפיכתו פ pastoris

לגבי שלב זה יהיה עליך לקבל את התקשורת הבאים וצלחות בהישג יד:

• YPDS צלחות
• 600 מ"ל בינוני YPD
• קר כקרח מים סטריליים
• 1 סורביטול M
• Amicon Ultra-4 התקן מסנן צנטריפוגלי
• Microcon YM-30 יחידת מסנן צנטריפוגלי
• 0.2 ס"מ electroporation קובט
• 15 מ"ל שפופרת זכוכית סטרילית
• סטרילי זכוכית פיפטה פסטר
• YPDS צלחות המכילות Zeocin

חלק 1: הכנת בתאי שמרים electrocompetent

1. ארבעה ימים לפני פס השינוי נועד החוצה פ תאים pastoris על צלחת YPDS ללא Zeocin ולתת להם לגדל 30 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים או עד מושבות טופס יחיד.
2. יומיים לפני השינוי נועד לגדול 5 מ"ל של פ 'שלך זן pastoris במדיום YPD בתוך צינור פלקון 50 מ"ל ב 30 ° C במשך הלילה. מניחים את הצינור פלקון בבקבוק כדי לתקן את זה ב שייקר.
3. היום לפני 500 מ"ל לחסן טרנספורמציה של המדיום YPD טרי בבקבוק 2 ליטר עם 0.25 מ"ל של התרבות לילה ולתת לגדול בין לילה שוב שייקר ב 30 ° C ל OD ₆₀₀ = 1.3-1.5.
   הערה: לדלל מדגם לפני מדידה על ספקטרופוטומטר, כך אתה מקבל תוצאה מדויקת.
4. יום של שינוי יש קר כקרח מים סטריליים ו 1 M סורביטול בהישג יד. צנטריפוגה התאים XG ב 1500 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend גלולה עם 500 מ"ל מים קרים כקרח סטרילית.
5. צנטריפוגה התאים שוב לשלב 4. Resuspend גלולה עם 250 מ"ל מים קרים כקרח סטרילית.
6. צנטריפוגה התאים שוב כמו בשלב 4. Resuspend את הכדור ב 20 מ"ל של קר כקרח M 1 סורביטול.
7. צנטריפוגה התאים שוב כמו בשלב 4. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של M 1 קר כקרח סורביטול לנפח סופי של 1.5 מ"ל ~. חנות תאים על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
   הערה: אנו מכינים תאים electrocompetent יותר מאשר הצורך לאחסן אותם aliquots של μl 80 צינורות microcentrifuge ב -80 ° C. אנו משתמשים בתאים מאוחסן לא יותר מחודש אחד.

חלק 2: לינאריזציה וריכוז של לבנות pPICZαA

לשינוי linearize וקטור המכיל גן העניין שלך על ידי הגבלת לעכל. אנו משתמשים PmeI האנזים. אתרי הגבלה אחרים אפשריים. אתה צריך לוודא כי הכנס אינו מכיל אתר הגבלה ברצונך להשתמש כדי linearize וקטור שלך. עבור והפיכתו פ pastoris תצטרך 50-20 מיקרוגרם של ה-DNA לינארית במים סטריליים 5-10 μl.

כמו כן linearize, לרכז ולהעביר את וקטור רגיל (לא להוסיף) אל פ ' pastoris. וקטור הורה מבלי להכניס את הוא פקד לביטוי רקע תאיים ומאפשר לך לפרש את תוצאות הביטוי שלך.

1. הפשירי כל ריאגנטים על הקרח, לשלב את ריאגנטים הבאים בקצרה צנטריפוגות צינור לקבל את כל נוזל לתחתית, לחץ על צינור ספין שוב:
   • x מים סטריליים μl
   • 5.0 μl NEBuffer 10X 4
   • 0.5 μl 100x BSA
   • עד DNA 2 מיקרוגרם וקטור (~ 100 ng / μl)
   • 2.0 PME μl אני אנזים לערבב
   → 50 μl התגובה הכולל נפח
   הערה: כדי לקבל מספיק DNA לינארית וקטור להכין את התערובת מעל 3 או 4 פעמים צינורות נפרדים לשלב את פתרונות כאשר ריכוז ה-DNA מתעכל באמצעות מכשיר אולטרה Amicon צנטריפוגלי.
2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות החום להשבית את תמהיל האנזים ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
3. בינתיים טרום לשטוף התקן Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי עם 1 מ"ל מים מילי-Q, לסובב את הצינור ב XG 4000 במשך 6-8 דקות וזורקים את הזרימה דרך.
   הערה: לא מאפשרים הממברנה להתייבש רטוב פעם. אם אינך משתמש במכשיר לאחר טרום שטיפה, להשאיר מים על הממברנה עד שההתקן נמצא בשימוש.
4. מעבירים את הפתרון חום מומת משלב 2 ל יחידת טרום שטפה מסנן צנטריפוגלי Amicon, לסובב את הצינור ב XG 4000 במשך 6-8 דקות וזורקים את הזרימה דרך.
   הערה: אם יש לך מוכן יותר מאחד לערבב לינאריזציה, לשלב את כל הפתרונות לאחת יחידת מסנן צנטריפוגלי Amicon.
5. צנטריפוגה עד סכום של פתרון הסינון Amicon מצטמצם בערך 100 ~ 150 & mu, יב הוסף 1.5 מ"ל של מים סטריליים כדי שפופרת הריק מלמעלה והעברת הפתרון הצינור Amicon וחזור על צעד צנטריפוגה. לשטוף בפעם השנייה עם 1.5 מ"ל מים סטריליים וזורקים לזרום שוב. הקטנת נפח הסופי μl 150 ~. השלבים כביסה להסיר את המלח שנותר מן המאגר כדי למנוע קימור כאשר פועם התאים.
   הערה: אנו משתמשים הרוטור דלי מתנדנד לשלב צנטריפוגה, פשוט המקום Amicon כתרים צנטריפוגלי יחידת מסנן צינור פלקון 50 מ"ל כדי להחזיקו במקום במהלך צנטריפוגה. Amicon מכשירים לסנן ולשמור 50 μl של פתרון לסנן גם לאחר צנטריפוגה המורחבת.
6. ריכוז נוסף של הכנת ה-DNA להעביר את פתרון ה-DNA הנותרים מהמכשיר Amicon מסנן Microcon מראש ושטף YM-30 יחידת מסנן צנטריפוגלי ולשטוף את הצינור Amicon μl עם 50 נוספות של מים סטריליים כדי לשחזר את כל ה-DNA. צנטריפוגה צנטריפוגלי יחידת Microcon סנן microcentrifuge בבית XG 10,000 עד המסנן הוא עדיין מכוסה עם מעט נוזל. רק ספין לזמן קצר ולבדוק בכל רגע אם רק כמות קטנה של נוזל נשאר על המסנן. כדי לשחזר את פתרון ה-DNA שלך, המקום הפוך מסנן למטה צינור microcentrifuge ספין חדש בשלב צנטריפוגה השני XG 1000 במשך 3 דקות. הנפח הסופי לא יעלה על 10-15 μl בסך הכל, אחרת ה-DNA שלך יכול להיות מדולל מדי צעד את השינוי.
   הערה: לא ספין המכשיר לסנן יותר מדי זמן ולתת לו להתייבש לחלוטין לא למנוע הפסד מדגם פוטנציאליים. אם הקרום שלך יבש, מוסיפים מים סטריליים 10-15 μl על הממברנה, להתסיס בעדינות למשך 30 שניות להתאושש הדנ"א שלכם כפי שתואר לעיל.

חלק 3: טרנספורמציה לתוך P. pastoris ידי electroporation

1. ה-DNA לינארית ומרוכז pPICZαA המכיל להכניס שלך מוכן כעת והפיכתו פ electrocompetent pastoris תאים (ראה שלב I, חלק 2). כ -15 דקות לפני השינוי להכין את ריאגנטים הבא והתקנים: למלא צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של M 1 סורביטול ולמקם אותו על קרח; במקום 0.2 ס"מ electroporation קובט על קרח; תווית זכוכית סטרילית 15 מ"ל צינור ויש לי סטרילית זכוכית פיפטה פסטר בהישג יד.
2. העברת 80 μl של תאים משלב I, חלק 2.7 ל קובט קר כקרח electroporation 0.2 ס"מ. מוסיפים את פתרון מרוכז לינארית pPICZαA דנ"א צעד אני, חלק 3.6 ומערבבים ידי הזזת קצה פיפטה מצד לצד אל על קובט electroporation.
   הערה: בעת הוספת ה-DNA רק לדחוף פיפטה לעצור את הראשון. לאחר ערבוב עם ה-DNA בתאים לדחוף פיפטה כדי לעצור את השני לאט להסיר קובט.
3. דגירה קובט עם התאים על הקרח במשך 5 דקות.
4. נגבו את החלק החיצוני של קובט עם רקמה והדופק את התאים על פי הפרמטרים של שמרים (Saccharomyces cerevisiae) כפי שהוצע על ידי היצרן של המכשיר electroporation הספציפי שבשימוש כרגע.
   הערה: אנו משתמשים Bio-Rad GenePulser עם התנאים הבאים:
   • טעינה מתח (V): 1500;
   • קיבול (μF): 25;
   • התנגדות (Ω): 200.
   שימוש 0.2 ס"מ electroporation קובט, פרוטוקול מייצר אורך הפולס של ~ 10 ms עם כוח שדה של ~ 7500 V / ס"מ.
5. מיד להוסיף 1 מ"ל של קר כקרח M 1 סורביטול כדי קובט. העברת התוכן קובט לצינור 15 מ"ל סטרילי באמצעות זכוכית סטרילית פיפטה פסטר.
6. תן דגירה צינור ב 30 מעלות צלזיוס ללא רעד במשך 1.5 שעות.
7. הוספת 5-7 חרוזי זכוכית מעוקר על ארבע צלחות YPDS שכותרתו המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​Zeocin. מורחים 250 μl של תמהיל electroporation מהצינור זכוכית 15 מ"ל על כל צלחת. לנער את הצלחת אופקית שווה להפיץ את התאים. בואו צלחת יבשה למשך 15 דקות ולאחר מכן להסיר את החרוזים מן אגר על ידי היפוך לצלחת.
   הערה: אנו משתמשים 100 מיקרוגרם / מ"ל Zeocin כדי לבחור עבור transformants בעת שימוש זן GS115 Pichia. תנאי הבחירה עשויה להשתנות אם אתה משתמש אחר זן Pichia.
8. דגירה צלחות במהופך עבור 2 עד 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס עד טופס מושבות. עטפו את צלחות פלסטיק שחור למנוע השפלה של Zeocin רגיש לאור. כמות של פחות אנטיביוטיקה הצלחות יכול לגרום שיבוטים חיובי כוזב.
9. לאחר מושבות נוצרו, לאסוף 12 מושבות ולטהר אותם פסים שיבוטים על צלחות YPDS טרי המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Zeocin.

שלב II: ביטוי חלבון pastoris Pichia

לגבי שלב זה יהיה עליך לקבל את התקשורת הבא, צלחות ריאגנטים בהישג יד:

• BMGY בינוני
• גליצרול, מעוקר
• BMMY בינוני
• מתנול, מעוקר
• ה-DNA EPICENTRE שמרים ערכת טיהור

אתהגם הצורך צלוחיות הבאים:

• בקבוק 250 מ"ל, autoclaved
• בקבוק 1 ליטר מבולבל, autoclaved
• כוס 200 מ"ל, autoclaved

חלק 1: ביטוי חלבון pastoris Pichia

כל הפעולות הבאות מבוצעות גם עבור וקטור הבקרה טרנספורמציה (עם לא להכניס).

1. פיק מושבה אחת מן המושבות Pichia מטוהרים משלב I, חלק 3.9 ו לחסן ב BMGY 25 מ"ל בבקבוק 250 מ"ל סטרילי. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס חממה רועד (250-300 סל"ד) עד התרבות מגיע OD ₆₀₀ = 2-6 (כ 16-18 שעות).
   הערה: לדלל מדגם לפני מדידה על ספקטרופוטומטר, כך אתה מקבל תוצאה מדויקת. התאים תהיה צמיחה יומן שלב.
2. כאשר התאים הגיעו OD המתאים ₆₀₀ להכין מלאי גליצרול. העברת 800 μl של התרבות התא 25 מ"ל ל בקבוקון 2 קורנינג מ"ל cyrogenic ולהוסיף 200 μl של גליצרול מעוקרים. להקפיא את המניות גליצרול ולאחסן ב -80 ° C.
3. עבור טיהור DNA שמרים, העברת 1.5 מ"ל של התרבות התא 25 מ"ל לצינור microcentrifuge. קציר התאים על ידי centrifuging XG ב 1300 במשך דקה 1 בטמפרטורת החדר. תאים אלה משמשים לניתוח integrants Pichia להכפיל לבדוק אם הגן של עניין יש משולב לתוך הגנום Pichia (ראה שלב II, part2). חנות התא גלולה על 4 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
4. מעבירים את שאר תרבות 25 מ"ל כדי צינור פלקון 50 מ"ל ו לקצור את התאים על ידי centrifuging XG ב 3000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. למזוג supernatant והמקום צינורות במהופך על רקמה להסיר כל התקשורת שיורית. כדי לשטוף את התא גלולה resuspend אותו BMMY 20 מ"ל להסיר בינוני BMGY הנותרים, כמו גליצרול מן המדיום BMGY יכול לעכב את הביטוי מאוחר יותר. צנטריפוגה שוב XG 3000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר למזוג supernatant.
5. Resuspend תא גלולה ל OD ₆₀₀ של 1.0 במדיום BMMY לגרום הביטוי (בערך 100-200 מ"ל) ולהעביר את התרבות בבקבוק 1 ליטר מבולבל. מכסים את הבקבוק עם כוס 200 מ"ל ולחזור חממה להמשך צמיחה בקצב של 30 ° C.
   הערה: חשוב שהטמפרטורה לא תעלה על 30 ° C. אם הטמפרטורה של נעה החממה שלך, לקבוע את הטמפרטורה ב 28 ° C. אוורור הולם הוא גם פרמטר חשוב לביטוי יעיל במהלך אינדוקציה מתנול (כאשר גרימת הביטוי, לא יעלה על נפח תרבות> 10-30% מנפח הבקבוק הכולל שלך). אנו ממליצים בחום על שימוש צלוחיות מבולבל, כפי שהם מציגים יותר חמצן בתקשורת ובתרבות.
6. הוסף מתנול טהור מעוקרים לריכוז סופי של מתנול 0.5% כל 24 שעות כדי לשמור על אינדוקציה.
7. בנקודות זמן מסוימות לאחר תחילת העברת מ"ל 1 ביטוי של התרבות אל צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 1300 עבור 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את supernatant אל צינור microcentrifuge נפרד 1.5 מ"ל. חנות כדורי supernatant של התא ב -80 ° C עד לניתוח נוסף. הדגימות מנקודות זמן שונות ינותחו כדי לקבוע את פרק הזמן האופטימלי עבור ביטוי חלבון לאחר אינדוקציה.
   הערה: אנו בוחרים 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 36 ח ו 48h את נקודות הזמן לקחת דגימות. צמיחה נוספת של עד 4 ימים אפשרי. נקודות זמן אופטימלי להשתנות בין חלבונים הביע שונים.
8. ניתוח supernatants וכדוריות תא ביטוי החלבון על ידי Coomassie מוכתם SDS-PAGE ומערב כתם (לא תיארו בפרוטוקול זה).

חלק 2: ה-DNA שמרים טיהור ניתוח PCR של integrant Pichia

ריאגנטים כל הדרוש הצעד DNA טיהור שמרים של התרבות Pichia ב BMGY כלולים ערכת שמרים MasterPure טיהור דנ"א EPICENTRE.
הערה: בניתוח זה מבוצע נוספים כדי לקבוע אם יש גן עניין להשתלב בגנום Pichia. התא גלולה מן המדגם 1.5 מ"ל נלקח מתרבות ב BMGY (ראה שלב II, חלק 1.3) משמש.

בצע את ההוראות של ידני MasterPure Epicentre DNA שמרים טיהור ולהפעיל PCR עם ה-DNA שמרים עם פריימרים ספציפיים להכניס את. ניתוח 3 μl של מוצר ה-PCR על ג'ל המכיל agarose 1 ברומיד ethidium μl. כלול 1 Kb ⁺ סמן גודל באחד גם לפרש את גודל להכניס שלך לדמיין את ה-DNA באמצעות תחנת תיעוד ג'ל.

חלבון רקומביננטי יכול להיות מנותח על ידי ניתוח כתם המערבי. טיהור חלבון יכול להתבצע על ידי טיהור תג שלו על שרף מתכת טעונים (לא תיארו בפרוטוקול זה).

נספח א ', רשימה של מתכונים

שלב I:

1. YPD בינוני:
   כדי להכין 600 מ"לשל המדיום YPD (תמצית שמרים בינוני Peptone דקסטרוז) להמיס 5 גרם תמצית שמרים 12 גרם peptone ב 540 מ"ל מים. החיטוי במשך 20 דקות על מחזור נוזלי.
   בינתיים להכין 70 מ"ל של דקסטרוז 20% ו-מסנן לחטא לפני השימוש.
   תנו פתרון autoclaved מגניב ~ 60 ° C ולהוסיף 60 מ"ל של דקסטרוז פילטר מעוקרים 20%.
2. YPDS (+ Zeocin) הצלחות:
   כדי להכין 500 מ"ל של YPDS + אגר Zeocin (תמצית שמרים Peptone בינוני דקסטרוז עם סורביטול) להמיס 5 גרם שמרים תמצית, 91.1 גרם סורביטול ו 10 peptone גרם 450 מ"ל מים. מוסיפים 10 גרם של אגר ובר ומערבבים החיטוי מגנטי במשך 20 דקות על מחזור נוזלי.
   בינתיים להכין 60 מ"ל של דקסטרוז 20% ו-מסנן לחטא לפני השימוש.
   תנו פתרון autoclaved מגניב ~ 60 ° C, להוסיף 50 מ"ל של דקסטרוז פילטר מעוקרים 20%.
   יוצקים כמה צלחות לפני הוספת אנטיביוטי צלחות YPDS ללא Zeocin. ואז להוסיף 500 Zeocin μl של 100 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות לקבל ריכוז סופי של Zeocin מיקרוגרם / ml 100 של אגר. בואו לבחוש בצלחת מגנטי בעת הוספת אנטיביוטיקה ולתת ומערבבים כ 2 דקות נוספות שווה לערבב.
   יוצקים מדיה לתוך צלחות פטרי ולכסות עם פלסטיק שחור. בואו צלחות יבש על הספסל הלילה. חנות לוחות YPD המכיל Zeocin ב 4 ° C. חיי המדף הוא שבוע עד שבועיים.
   הערה: את הכיסוי עם הפלסטיק נחוץ משום Zeocin רגיש לאור.

שלב II:

1. BMGY (שנאגרו גליצרול מורכבת בינוני) ו BMMY (שנאגרו מתנול מורכבת בינוני):
   ממיסים עבור כל 8 גרם בינוני של תמצית שמרים 16 גרם peptone במים 560 מ"ל. החיטוי במשך 20 דקות על מחזור נוזלי.
   בינתיים מכינים את הפתרונות הבאים:
   • 1 פוספט M חיץ אשלגן, 6.0 pH:
   שלב 24 מ"ל של 1M K ₂ HPO ₄ ו - 156 מ"ל של 1M K ₂ HPO ₄ ולוודא כי ה-pH = 6.0 (אם ה-pH צריך להיות מותאם, להשתמש חומצה זרחתית או KOH). סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר. חיי המדף של פתרון זה הוא יותר מאשר שנה אחת.
   • YNB 10X (13.4% חנקן שמרים בסיס עם אמוניום סולפט ללא חומצות אמינו):
   ממיסים 26.8 גרם שמרים בסיס חנקן (YNB) עם אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו 200 מ"ל מים מסנן לעקר. מחממים את הפתרון לפזר YNB לחלוטין במים. חנות ב 4 ° C. חיי המדף של פתרון זה הוא כשנה. הערה: לחילופין, להשתמש 3.4 גרם של YNB ללא אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו להוסיף 10 גרם של אמוניום סולפט.
   • 500X ב '(0.02% ביוטין):
   להמיס 10 מ"ג ביוטין ב 50 מ"ל מים מסנן לעקר. חנות ב 4 ° C. חיי המדף של פתרון זה הוא כשנה.
   • M 10X (5% מתנול):
   מערבבים 5 מ"ל של מתנול עם 95 מ"ל מים. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. חיי המדף של פתרון זה הוא כחודשיים.
   • GY 10X (10% גליצרול):
   מערבבים 10 מ"ל של גליצרול עם 90 מ"ל מים. סנן לעקר. אחסן בטמפרטורת החדר. חיי המדף של פתרון זה הוא יותר מאשר שנה אחת.
   תנו פתרון autoclaved להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את הדברים הבאים ומערבבים היטב:
   • 80 מ"ל 1 פוספט M חיץ אשלגן, 6.0 pH;
   • YNB 10X 80 מ"ל
   • 0.16 מ"ל B 500X
   • GY 10X 80 מ"ל
   להכנת BMMY, להוסיף 80 מ"ל M גליצרול 10X במקום.
   חנות המדיה 4 ° C. חיי המדף של פתרון זה הוא כחודשיים.

נציג תוצאות

באיור 1. דימוי זה כתם המערבי מראה ארבעה חלבונים הביע (שכותרתו 1605, 0537, 1228 ו 1682) לאחר 24 שעות של הביטוי. הנוגדן משמש immunoblotting היה נוגדן c-myc-HRP. הנתיב השני (שכותרתו N) הוא פקד שלילי היתה עמוסה supernatant מתאי כי אינם מבטאים חלבון רקומביננטי כי הם הפכו עם ההורה (רגיל) וקטור.

Discussion

ביטוי חלבון באמצעות pastoris methylotrophic Pichia שמרים כמערכת המארחת מתואר בפרוטוקול זה. חלבון יכול להיות מופרש לתוך המדיום בהתאם וקטור שיבוט בשימוש. הפרשת חלבון רקומביננטי הופך את טיהור הבאים קל. עם זאת, התנאים המוצג יכול להיות מותאם במיוחד הביטוי של חלבונים שונים ושינויים בתנאים פעמים הביטוי עלול לגרום רמות חלבון מוגברת. וקטור להשתמש בפרוטוקול זה יש את התכונה של epitope c-myc ו נוגדן לכך epitope ניתן לרכוש. זה מאפשר ניתוח של חלבונים אשר יש נוגדנים לא זמין עדיין. התכונה התג שלו וקטור של ההורה מאפשר טיהור חלבון על שרף מתכת chelating ויש גם נוגדן עבור המקטע תג שלו של וקטור זמין.

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, ביטוי החלבון pastoris Pichia הוא רב שלבי, תהליך אשר צריך להיות מתוכנן היטב ומוכן. זמן של שבועיים עד שלושה שבועות נדרש לבצע את כל השלבים אך למעט שיבוט של לבנות את עם הגן של עניין. הבסיס לשינוי מוצלח תוך פ pastoris גבוה יעיל שינוי המוסמכת שמרים תאים מבנה לינארית אשר יכול להשתלב בגנום שמרים. ניתוח המערבי כתם וטיהור שלו תג הם יישומים כדי לקבוע את רמת הביטוי של חלבון רקומביננטי הם השלבים הבאים יש לבצע לאחר פרוטוקול זה.