Summary
协议描述使用甲醇酵母蛋白的表达
Abstract
蛋白质在微生物的真核宿主毕赤酵母中的表达提供了可能产生一个快速且易于使用的表达系统的重组蛋白的高含量。
作为一种单细胞微生物体育酵母是容易操纵的，并在高细胞密度的廉价媒体迅速成长。作为真核细胞，P。酵母是能够执行许多更高的真核细胞中获得的重组蛋白进行翻译后修饰进行蛋白质折叠，蛋白加工，形成二硫键和糖基化[1 ]。
由于甲醇酵母P.酵母是甲醇作为唯一的碳源代谢。强启动醇氧化酶AOX1，严格监管和甲醇诱导和它感兴趣的基因的表达。因此，外源蛋白的表达可诱导培养基中[2加入甲醇; 3]。
另一个重要优势是重组蛋白分泌到培养基中，使用一个信号序列为目标的外源蛋白毕赤酵母的分泌途径。媒体酵母本身分泌的内源性蛋白和媒体没有添加蛋白质水平低，外源蛋白建立在介质中的总蛋白的多数，有利于蛋白质纯化步骤[3，4]。
这里所用的载体（pPICZαA）含有AOX1启动子的严格监管，甲醇诱导感兴趣的基因的表达，一个可供选择的Zeocin 抗性都大肠杆菌基因重组蛋白，分泌的α-因子的分泌信号大肠杆菌和毕赤酵母和C -末端肽含c - myc基因的抗原表位和多聚组氨酸（6xHis）检测和纯化重组蛋白的标记。我们也使用特定的抗 myc - HRP抗体承认父向量的C - myc基因的抗原表位的重组蛋白质免疫印迹分析。
Protocol
重组蛋白在甲醇毕赤酵母中的表达
在开始此协议，你应该有你感兴趣的基因在体育帧克隆酵母父载体和它测序检查的正确插入的基因载体的利益。
第一步：生成electrocompetent酵母细胞，线性的兴建和改造成体育酵母
对于这一步，你将需要有以下媒体和板：
- YPDS板
- 600毫升YPD培养基
- 冰冷的无菌水
- 1中号山梨醇
- Amicon超4离心过滤装置
- 单片机YM - 30离心式过滤器单元
- 0.2厘米电比色皿
- 15毫升无菌玻璃管
- 无菌玻璃巴斯德吸管
- YPDS板含有Zeocin
第1部分：electrocompetent酵母细胞的制备
- 4天前拟出体育的转型连胜没有Zeocin YPDS板的酵母细胞，让他们成长为1-2天，或直至形成单菌落30℃ 。
- 拟改造前两天增长5毫升您的体育酵母株50毫升猎鹰管在YPD培养基在30 ° C过夜。猎鹰管放置在一个烧瓶固定在振动筛。
- 改造前新鲜的YPD培养基接种500毫升在2公升烧瓶中，用0.25毫升过夜培养，让成长在摇床一夜之间再次在30 ° C至OD 600 = 1.3-1.5天。
注：稀释你的样品前分光光度计测量，使您得到准确的结果。 - 当天的改造，有冰冷的无菌水和1米在手山梨糖醇。离心5分钟，在1500 XG的细胞在4 ° C。冰冷，无菌水500毫升，重悬沉淀。
- 第4步，再次离心细胞。冰冷，无菌水250毫升，重悬沉淀。
- 离心机的细胞再次在第4步。重悬在冰冷的1米山梨糖醇20毫升沉淀。
- 离心机的细胞再次在第4步。在冰冷的1〜1.5毫升的最终体积山梨糖醇中号的1毫升，重悬沉淀。在冰上或保存在4 ° C，直到进一步利用细胞。
注：我们准备electrocompetent比需要的细胞，并存储在80μL离心管分装于-80 ° C。我们使用不超过一个月的存储单元格。
第2部分：线性和浓度pPICZαA构建
改造你感兴趣的基因载体酶切线性化。我们使用的酶PmeI。其他限制的网站是可能的。你必须确保你插入不包含您要使用你的载体线性化的限制，网站。对于改造成体育酵母 ，您将需要5-20微克5-10μL无菌水的线性DNA。
线性，集中和转移到P.纯向量（没有插入） 酵母 。没有插入父向量为背景的细胞内表达的控制，并允许你解释你的表达结果。
- 在冰上解冻所有试剂，结合下面的试剂，并让所有液体底部短暂离心管，自来水管和旋转一次：
- xμL无菌水
- 5.0μL10X NEBuffer 4
- 100X BSA 0.5μL
- 2微克的载体DNA（〜100毫微克/μL）
- 2.0μLPME我酶混合物
注：要获得足够的线性载体DNA准备的上述组合，在不同的管3或4次，并通过Amicon超离心设备集中消化的DNA结合的解决方案时。 - 在37 ° C孵育3小时，热灭活20分钟，在65 ° C的酶混合物。
- 的平均时间，冲洗前用1毫升Milli - Q水Amicon超4离心过滤装置，在4000 XG旋转6-8分钟管和丢弃的流量通过。
注意：不要让膜干燥一次湿。如果你不使用该设备的预冲洗后，留在膜的水，直到设备使用。 - 在4000 XG热灭活的解决方案，从第2步转移到预冲洗Amicon离心过滤单元，旋转管为6-8分钟，并丢弃流经。
注意：如果您已经准备好了一个以上的线性组合，组合成一个Amicon离心过滤单元所有的解决方案。 - 离心机，直到解决方案Amicon过滤量减少到约100〜150＆MU;湖从上面添加1.5毫升无菌水的另一个空管和传输解决方案的Amicon管和重复离心步骤。第二次用1.5毫升无菌水清洗，并通过再次丢弃流量。减少〜150μL的最终体积。洗涤步骤删除的缓冲区，以防止拱脉冲的细胞时，剩下的盐。
请注意：我们使用摆动桶转子离心步骤，只需放置在一个50毫升猎鹰管的上限Amicon离心过滤装置在离心过程中，它举行的地方。 Amicon过滤装置上，保留50μL的解决方案，即使延长离心后的过滤器。 - DNA制备的进一步集中转移Amicon过滤装置的预冲洗单片机YM - 30离心式过滤器单元，剩余的DNA溶液冲洗额外的50μL无菌水，收回所有的DNA Amicon管。直到过滤器仍然存在轻微的液体覆盖在10000 XG离心离心过滤单元在微量的单片机。只有很短的时间旋转，检查每分钟，如果只有少量的液体留在过滤器上。要恢复您的DNA溶液，放置过滤器倒挂在新的离心管和旋转3分钟，在1000 XG在第二离心步骤。最终体积不得超过总额的10-15μL，否则你的DNA可能会过于稀释的改革前进了一步。
注：不旋转过滤装置过长，请不要完全干燥，以防止潜在的样品损失。如果你的膜干燥，膜添加到10-15μL无菌水，轻轻搅拌为30秒，如上所述，恢复你的DNA。
第3部分：改造成体育酵母由电
- 线性处理和集中pPICZαA的DNA，包含您插入现在准备转变到electrocompetent体育酵母细胞（见我一步，第2部分）。改造前约15分钟准备以下试剂和设备：填写1毫升的1 M山梨醇离心管置于冰上;对冰电0.2厘米比色皿;标签无菌的15 mL玻璃试管中，并有无菌玻璃巴斯德吸管就在眼前。
- 将80μL一步，我的一部分，2.7细胞冰冷的0.2厘米电比色皿。我一步，部分3.6和混合添加，从一侧到另一侧的电比色皿的枪头集中的线性pPICZαADNA溶液。
注：加入的DNA时，只把吸管的第一站。混合后的DNA与细胞推吸管的第二站，慢慢地从试管中删除。 - 5分钟就冰细胞培养的试管。
- 的比色皿中，用纸巾擦去外面和脉冲的细胞，并根据参数的具体电正在使用的设备制造商的建议酵母（酿酒酵母）。
注：我们用用Bio - Rad公司GenePulser下列条件：- 充电电压（V）：1500;
- 电容（μF）：25;
- 电阻（Ω）：200。
- 立即加入1毫升冰冷1米，山梨糖醇试管。试管内容转移至15毫升无菌试管使用无菌玻璃巴斯德吸管。
- 在30 ° C，不晃动为1.5小时，让管孵化。
- 新增四个标记YPDS板含有100微克/毫升Zeocin 5-7灭菌的玻璃珠。传播250μL每盘15毫升的玻璃管电混合。摇板水平均匀分布的细胞。让板干燥15分钟，然后取出琼脂珠反相板。
请注意：我们使用，转化为100微克/毫升Zeocin选择使用GS115毕赤酵母株。如果您使用的是另一种毕赤酵母株，选择条件可能会有所不同。 - 直到菌落形成2至3天在30 ° C孵育板倒置。包裹在一个黑色的塑料板，以防止光敏感Zeocin退化。板块的抗生素量较少，可能会导致假阳性克隆。
- 已形成的殖民地之后，挑选12个殖民地和纯化含100微克/毫升的Zeocin的新鲜YPDS板条纹的克隆。
步骤二： 在毕赤酵母蛋白表达
对于这一步，你将需要手边有下列媒体，板和试剂：
- BMGY培养基
- 甘油，消毒
- BMMY培养基
- 甲醇，消毒
- 震中酵母DNA纯化试剂盒
您还需要以下烧瓶：
- 250 ml容量瓶中，蒸压
- 1升百思不得其解的烧瓶中，蒸压
- 200 mL烧杯中，蒸压
第1部分： 在毕赤酵母蛋白表达
以下所有步骤，也为转换后的控制向量（没有插入）。
- 接一步，我的一部分，3.9纯化毕赤酵母殖民地单个菌落，接种于25 mL BMGY，在无菌的250 mL容量瓶中。成长在30 °一个摇床（250-300转），直到文化中的C 到达一个外径600 2-6（约16-18小时）。
注：稀释你的样品前分光光度计测量，使您得到准确的结果。这些细胞会在登录阶段的增长。 - 当细胞达到相应的OD 600准备一份甘油。转移800 25 mL细胞培养液2毫升康宁cyrogenic小瓶，加200μL灭菌甘油。 '冻结在-80甘油和存储° C。
- 酵母DNA纯化，转移25 mL细胞培养的1.5毫升离心管。收获细胞，离心1分钟，在室温下于1300 XG。这些细胞用于分析毕赤酵母 integrants仔细检查，如果感兴趣的基因整合到毕赤酵母的基因组（见步骤二，第2部分）。商店细胞沉淀于4 ° C，直到进一步的分析。
- 其余的25 mL培养转移至50 mL猎鹰管和收获的细胞，离心5分钟，在室温3000 XG。倒出上清液和地方管，倒挂在组织，以消除任何残留的媒体。洗细胞的颗粒悬浮在20毫升BMMY删除任何剩余BMGY培养基，从BMGY介质甘油可以抑制以后的表达。离心机再次在3000 XG在室温下5分钟，倒出上清液。
- 悬浮细胞沉淀到一个外径600 BMMY培养基1.0诱导表达（约100-200毫升）和转让的文化，在1升百思不得其解的烧瓶。封面用200 mL烧杯烧瓶中，并返回到孵化器继续增长30 ° C。
注：重要的是，温度不超过30 ° C。如果您的孵化器波动的温度，设定温度在28 ° C。充足的曝气也是一个重要参数，在甲醇诱导高效表达（诱导表达时，从来没有超过一个文化卷>总烧瓶量的10-30％）。我们强烈建议使用百思不得其解烧瓶的，因为他们在文化传媒介绍更多的氧气。 - 到终浓度为0.5％的甲醇添加灭菌纯甲醇，每24小时保持诱导。
- 在一定的时间点启动后的表达的文化转移1毫升到1.5 mL离心管。在1300 XG为2.5分钟，在室温下离心。将上清转移至一个单独的1.5 ml离心管。商店，直到进一步的分析上清，细胞沉淀在-80 ° C。来自不同时间点的样品进行分析，以建立诱导后蛋白表达的最佳时间期限。
注意：我们选择6H，12H，24小时，36小时和48小时的时间点采取样品。长达4天的进一步增长是可能的。之间不同表达的蛋白质的最佳时间点。 - 分析蛋白表达和细胞颗粒的上清，考马斯染色的SDS - PAGE和免疫印迹（未在本协议中所述）。
第2部分：酵母DNA纯化和PCR分析毕赤酵母 integrant
BMGY 毕赤酵母培养酵母的DNA纯化步骤所需的所有试剂，包括从震中在MasterPure酵母DNA纯化试剂盒。
注：此分析是额外的执行，以确定是否感兴趣的基因已整合到毕赤酵母基因组。 BMGY文化（见步骤二，部分1.3）采取从1.5毫升样品细胞沉淀。
按照震中MasterPure酵母DNA纯化手册中的说明和运行特异性引物插入酵母DNA PCR。分析3μLPCR产物琼脂糖凝胶含有1μL溴化乙锭。包括在一个井1 KB +尺寸标记解释插入的大小和可视化的DNA，使用凝胶文档站。
可以分析重组蛋白免疫印迹分析。可以进行蛋白质纯化His - tag的净化上的带电金属树脂（未在本协议中所述）。
附录，配方清单
步骤一：
- YPD培养基 ：
要准备600毫升YPD培养基（酵母提取蛋白胨葡萄糖中等），溶于水540毫升5克酵母提取物和蛋白胨12克。高压灭菌液体周期为20分钟。
与此同时，准备70毫升20％葡萄糖和过滤器在使用前消毒。
让蒸压解决方案，酷〜60 ° C和添加60毫升20％葡萄糖过滤灭菌。 - YPDS（+ Zeocin）板 ：
要准备500毫升YPDS + Zeocin琼脂（酵母提取蛋白胨葡萄糖中等山梨醇）溶于5克酵母提取物，山梨醇和91.1克，10克，水450毫升蛋白胨。加入琼脂10克和一个磁力搅拌棒和液体循环20分钟高压灭菌。
与此同时，准备60毫升20％葡萄糖和过滤器在使用前消毒。
让蒸压解决方案，酷〜60 ° C，加入50毫升20％葡萄糖过滤灭菌。
倒入前几个板块加入YPDS板没有Zeocin抗生素。然后从100毫克/毫升原液添加500μLZeocin获得琼脂终浓度为100微克/毫升Zeocin。让旺火上一个磁板时加入抗生素，并让约增加2分钟，同样混合搅拌。
倒入培养皿中的介质，并用黑色塑料覆盖。让板在实验台上干通宵。商店YPD板含有Zeocin 4 ° C。保质期为一到两周。
注：与塑料覆盖面是必要的，因为Zeocin对光敏感。
步骤二：
- BMGY（缓冲甘油复杂介质）和BMMY（缓冲甲醇-复杂介质）：
每个中等8克酵母提取物和蛋白胨16克，560毫升的水溶解。高压灭菌液体周期为20分钟。
在平均时间，准备了以下解决方案：- 1 M磷酸钾缓冲液，pH值 6.0 ：
- 10X鼎贞（13.4％酵母氮基与无氨基酸铵硫酸）：
- 500X B（0.02％生物素）：
- 10X中号（5％甲醇）：
- 10X庚寅（10％甘油）：
让灭菌溶液冷却到室温，然后添加以下拌匀：- 80毫升1个M钾磷酸盐缓冲液，pH值6.0;
- 80毫升的10X YNB
- 0.16毫升500X乙
- 80毫升的10X的GY
店内媒体在4 ° C这种解决方案的保质期大约两个月。
代表性的成果
图1免疫印迹图像显示后24小时表达四个表达的蛋白质（标记为1605，0537，1228年，和1682）。为免疫抗体是一种c - myc基因的辣根过氧化物酶抗体。第二线（N）是一种消极的控制和与不表达的重组蛋白的细胞上清加载，因为它们与父（纯）载体转化。
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Discussion
蛋白的表达，使用甲醇毕赤酵母作为主机系统，是在本议定书。蛋白可分泌到根据使用的克隆载体介质。重组蛋白的分泌，使后续的纯化更容易。然而，所显示的条件可能要为不同的蛋白质和条件和表达时间的变化表达优化，可能导致蛋白质水平增加。在本议定书中所使用的向量有一个c - myc基因的抗原表位，并可以购买此抗原表位的抗体的功能。其中有没有抗体，这使得蛋白质的分析。父向量His - tag的功能，有利于蛋白质纯化金属螯合树脂，也有一个可用的矢量His - tag的部分抗体。
如在本议定书中所述， 在毕赤酵母中蛋白表达的是一个多步骤的过程，需要得到很好的计划和准备。需要两至三个星期的时间来执行所有步骤，但不包括感兴趣的基因构建的克隆。成功转型到体育的基础酵母是高转化效率的主管酵母细胞和一个可以融入酵母基因组的线性构造。 Western blot分析和His - tag的净化应用程序，以确定重组蛋白的表达水平，接下来的步骤执行此协议后。
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Acknowledgments
我们要感谢支持这项工作的创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和卫生研究所（CIHR）加拿大研究所，加拿大基金会。 MT是从微生物的多样性和进化（CMDE）图拉基金会资助中心的奖学金支持。
References
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