Summary
Het protocol beschrijft het gebruik van de eiwitexpressie methylotrofe gist
Abstract
Eiwitexpressie in de microbiële eukaryotische gastheer Pichia pastoris biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudig te gebruiken expressie systeem.
Als een eencellige micro-organisme P. pastoris is gemakkelijk te manipuleren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Omdat een eukaryoot, P. pastoris is in staat om vele van de post-translationele modificaties uitgevoerd door hogere eukaryotische cellen en de verkregen recombinante eiwitten ondergaan het vouwen van eiwitten, proteolytische verwerking, disulfidebinding vorming en glycosylatie [1].
Als een methylotrofe gist P. pastoris is in staat van metaboliserende methanol als enige koolstofbron. De sterke promotor voor alcohol oxidase, AOX1, wordt strak gereguleerd en veroorzaakt door methanol en het wordt gebruikt voor de expressie van het gen van belang. Bijgevolg kan de expressie van het vreemde eiwit geïnduceerd worden door het toevoegen van methanol aan het groeimedium [2, 3].
Een ander belangrijk voordeel is de afscheiding van het recombinante eiwit in het groeimedium, met behulp van een signaalsequentie voor de vreemde eiwitten te richten op de secretieroute van P. pastoris. Met slechts lage niveaus van endogene eiwit afgescheiden aan de media door de gist zelf en geen toegevoegde eiwitten aan de media, een heteroloog eiwit bouwt het grootste deel van de totale hoeveelheid eiwit in het medium en faciliteert volgende eiwit zuiveringsstappen [3, 4].
De hier gebruikte vector (pPICZαA) bevat de AOX1 promotor voor strak geregeld, methanol-geïnduceerde expressie van het gen van belang, de α-factor secretie signaal voor secretie van het recombinante eiwit, een Zeocin resistentiegen voor selectie in zowel E. coli en Pichia en een C-terminale peptide met de c-myc epitoop en een polyhistidine (6xHis) tag voor detectie en zuivering van een recombinant eiwit. We laten ook zien western blot-analyse van het recombinante eiwit met behulp van de specifieke anti-myc-HRP antilichaam dat de c-myc epitoop op de bovenliggende vector.
Protocol
Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris
Voordat u begint met dit protocol moet u uw gen van belang gekloond in frame in een P. pastoris ouder vector en hebben gesequenced om te controleren of voor het correct inbrengen van het gen van interesse in de vector.
Stap I: Het genereren van elektrocompetente gistcellen, linearisatie van de constructie en transformatie naar P. pastoris
Voor deze stap moet u de volgende media en platen bij de hand hebt:
- YPDS platen
- 600 ml YPD medium
- ijs-koud steriel water
- 1 M sorbitol
- Amicon Ultra-4 Centrifugaal Filter Device
- Microcontroller YM-30 centrifugaalfilter Unit
- 0,2 cm elektroporatie cuvette
- 15 ml steriele glazen buis
- steriele glazen Pasteur pipet
- YPDS platen met Zeocin
Deel 1: Voorbereiding van elektrocompetente gistcellen
- Vier dagen voor de beoogde transformatie streep uit P. pastoris cellen op een YPDS plaat zonder Zeocin en laat ze een 30 ° C te groeien gedurende 1-2 dagen of tot enkele kolonies te vormen.
- Twee dagen voor de gewenste transformatie te groeien 5 ml van uw P. pastoris stam in YPD medium in een 50 ml Falcon buis bij 30 ° C gedurende de nacht. Plaats de Falcon tube in een fles op te lossen in de shaker.
- De dag voor de transformatie enten 500 ml vers YPD medium in een 2 liter fles met 0,25 ml van de cultuur en 's nachts te laten groeien' s nachts weer in een shaker bij 30 ° C tot een OD 600 = 1.3 tot 1.5.
Let op: verdunnen uw monster voor de meting van de spectrofotometer, zodat je een nauwkeurig resultaat. - De dag van de transformatie hebben ijskoud steriel water en 1 M sorbitol bij de hand. Centrifugeer de cellen bij 1500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 500 ml ijskoud, steriel water.
- Weer Centrifugeer de cellen als stap 4. Resuspendeer de pellet met 250 ml ijskoud, steriel water.
- Weer Centrifugeer de cellen zoals in stap 4. Resuspendeer de pellet in 20 ml ijskoude 1 M sorbitol.
- Weer Centrifugeer de cellen zoals in stap 4. Resuspendeer de pellet in een ml ijskoude 1 M sorbitol tot een eindvolume van ~ 1,5 ml. Bewaar de cellen op ijs of bij 4 ° C tot verder gebruik.
Let op: wij bereiden meer elektrocompetente cellen dan nodig is en ze in hoeveelheden van 80 ul in microcentrifugebuizen bewaren bij -80 ° C. We gebruiken de opgeslagen cellen niet langer dan een maand.
Deel 2: Linearisatie en de concentratie van de pPICZαA bouwen
Voor transformatie lineariseren de vector met uw gen van belang door de beperking te verteren. We maken gebruik van het enzym PmeI. Andere beperking sites zijn mogelijk. Je moet ervoor zorgen dat uw plaats niet in de beperking site die u wilt gebruiken om uw vector lineariseren bevatten. Voor omzetting in P. pastoris moet u 5-20 ug van gelineariseerde DNA 5-10 ul steriel water.
Ook lineariseren, concentreren en overdracht van de vlakte vector (zonder insert) in de P. pastoris. De ouder vector zonder de insert is een controle voor achtergrond intracellulaire expressie en kunt u uw interpreteren uitdrukking resultaten.
- Dooi alle reagentia op het ijs, combineren de volgende reagentia en kort centrifugeer de buis om alle vloeistof op de bodem, tikt u op de buis en draai weer:
- x pi steriel water
- 5,0 ul 10X NEBuffer 4
- 0,5 ul 100X BSA
- tot 2 ug vector DNA (~ 100 ng / ul)
- 2,0 ul PME I enzym mix
Opmerking: om voldoende gelineariseerde vector DNA te verkrijgen voor te bereiden de bovenstaande mix 3 of 4 keer in aparte buizen en de oplossingen als het concentreren van de geknipte DNA via Amicon ultracentrifugaalmolen apparaat te combineren. - Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur en warmte van het enzym mix bij 65 ° C gedurende 20 minuten te inactiveren.
- In de tussentijd voorspoelen een Amicon Ultra-4 centrifugaalfilter apparaat met 1 ml Milli-Q water, draai de buis bij 4000 xg gedurende 6-8 minuten en gooi de doorstromen.
Let op: niet toestaan dat de membraan te drogen een keer nat. Als u geen gebruik maakt van het apparaat na het voorspoelen, laat het water op het membraan totdat het apparaat wordt gebruikt. - Breng de hitte-geïnactiveerd oplossing van stap 2 om de pre-gespoeld Amicon centrifugaalfilter Unit, draai de buis bij 4000 xg gedurende 6-8 minuten en gooi de doorstromen.
Let op: als u bereid meer dan een linearisatie mix, alle oplossingen te combineren in een Amicon Centrifugaal Filter Unit. - Centrifugeer totdat het bedrag van de oplossing op de Amicon filter wordt teruggebracht tot ongeveer 100 ~ 150 & mU; l. Voeg nog een 1,5 ml steriel water om de lege buis van boven en breng de oplossing voor de Amicon buis en herhaal de centrifugatie stap. Was een tweede keer met 1,5 ml steriel water en gooi stromen weer. Verminder het uiteindelijke volume tot ~ 150 pl. Het wassen stappen verwijdert u het overgebleven zout uit de buffer om te voorkomen dat overkoepelende wanneer het pulseren van de cellen.
Let op: we gebruiken een swingende emmer rotor voor de centrifuge stap, gewoon de afgetopte Amicon centrifugaalfilter apparaat in een 50 ml Falcon buis te zijn plaats te houden tijdens het centrifugeren. Amicon filter apparaten behouden 50 ul van de oplossing op het filter, zelfs na uitgebreid centrifugeren. - Voor verdere concentratie van het DNA voorbereiding overdracht van de resterende DNA-oplossing uit de Amicon filter apparaat aan op een pre-gespoeld Microcon YM-30 centrifugaalfilter Unit en spoel de Amicon buis met een extra 50 pi steriel water om alle DNA te herstellen. Centrifugeer de Microcon centrifugaalfilter Unit in een microcentrifuge bij 10.000 xg totdat het filter is nog enigszins bedekt met vloeistof. Alleen draaien voor een korte tijd en controleer elke minuut al was het maar een kleine hoeveelheid vloeistof op het filter. Om te herstellen van uw DNA-oplossing, plaats het filter ondersteboven in een nieuwe microcentrifugebuis en de spin in een tweede centrifugatie stap voor stap 1000 xg gedurende 3 minuten. Het uiteindelijke volume mag niet groter zijn dan 10-15 ui in totaal, anders wordt je DNA kan ook worden verdund voor de transformatie stap.
Let op: niet draaien van het filter apparaat te lang en laat het niet volledig droog is om potentiële monster verlies te voorkomen. Als je membraan droog is, voeg 10-15 ul steriel water op het membraan, schud zachtjes gedurende 30 seconden en herstellen van uw DNA zoals hierboven beschreven.
Deel 3: Transformatie naar P. pastoris door elektroporatie
- De gelineariseerde en geconcentreerd pPICZαA DNA met uw insert is nu klaar voor transformatie in de elektrocompetente P. pastoris cellen (zie stap I, deel 2). Ongeveer 15 minuten voor de transformatie de voorbereiding van de volgende reagentia en apparaten: vul een microcentrifugebuis met 1 ml van 1 M sorbitol en plaats het op ijs, plaats een 0,2 cm elektroporatie cuvette op het ijs, het etiket van een steriele 15 ml glazen buis en hebben een steriele glas Pasteur pipet bij de hand.
- Overdracht 80 ul van de cellen uit stap I, deel 2,7 tot een ijskoude 0,2 cm elektroporatie cuvette. Voeg de geconcentreerde gelineariseerde pPICZαA DNA-oplossing uit stap I, deel 3.6 en meng door het verplaatsen van de pipetpunt van links naar rechts in de elektroporatie cuvette.
Let op: bij het toevoegen van het DNA alleen pipet druk om de eerste stop. Na het mengen van het DNA met de cellen druk pipet tot de tweede stop en langzaam uit de cuvette. - Incubeer de cuvet met de cellen op ijs gedurende 5 minuten.
- Veeg de buitenkant van de kuvet met een tissue en pols van de cellen op basis van de parameters voor de gist (Saccharomyces cerevisiae), zoals voorgesteld door de fabrikant van de specifieke elektroporatie apparaat wordt gebruikt.
Let op: wij gebruik van een Bio-Rad GenePulser met de volgende voorwaarden:- Laadspanning (V): 1500;
- Capaciteit (uF): 25;
- Weerstand (Ω): 200.
- Onmiddellijk voeg 1 ml ijskoude 1 M sorbitol tot de cuvet. Breng de cuvet inhoud naar een steriele 15 ml buis met behulp van de steriele glazen Pasteur pipet.
- Laat de buis incubeer bij 30 ° C zonder schudden gedurende 1,5 uur.
- Voeg 5-7 gesteriliseerd glazen kralen op de vier labels YPDS platen met 100 ug / ml Zeocin. Verspreid 250 ul van de elektroporatie mix van de 15 ml glazen buis op elk bord. Schud de plaat horizontaal gelijkmatig verspreid de cellen. Laat de plaat drogen gedurende 15 minuten en dan de kralen uit de agar door het omkeren van de plaat.
Let op: we gebruiken 100 pg / mL Zeocin te selecteren op transformanten bij het gebruik van de GS115 Pichia stam. De selectie voorwaarden kunnen variëren als u gebruik maakt van een andere stam Pichia. - Incubeer de platen ondersteboven voor 2 tot 3 dagen bij 30 ° C tot de kolonies te vormen. Wikkel de platen in een zwart plastic om afbraak van de lichtgevoelige Zeocin te voorkomen. Minder hoeveelheid antibioticum in de platen kan leiden tot vals-positieve klonen.
- Na de kolonies hebben gevormd, pak 12 kolonies en zuivert hen door strepen van de klonen op verse YPDS platen met 100 ug / ml Zeocin.
Stap II: Eiwitexpressie in Pichia pastoris
Voor deze stap moet u de volgende media, borden en reagentia bij de hand hebt:
- BMGY medium
- glycerol, gesteriliseerd
- BMMY medium
- methanol, gesteriliseerd
- EPICENTRUM Gist DNA-zuivering kit
UOok het volgende nodig kolven:
- Kolf van 250 ml, geautoclaveerd
- 1 L verbijsterd kolf, geautoclaveerd
- 200 ml beker, geautoclaveerd
Deel 1: Eiwitexpressie in Pichia pastoris
Alle van de volgende stappen zijn ook uitgevoerd voor de getransformeerde controle vector (zonder insert).
- Kies een kolonie van de gezuiverde Pichia kolonies van stap I, deel 3.9 en enten in 25 ml BMGY in een steriele kolf van 250 ml. Groeien bij 30 ° C in een incubator schudden (250-300 rpm), totdat cultuur bereikt een OD 600 = 2-6 (ongeveer 16-18 uur).
Let op: verdunnen uw monster voor de meting van de spectrofotometer, zodat je een nauwkeurig resultaat. De cellen worden in log-fase groei. - Wanneer de cellen hebben bereikt de juiste OD 600 voor te bereiden een glycerol stock. Overdracht 800 ui van de 25 ml celkweek tot een 2 ml Corning cyrogenic flacon en voeg 200 ul van gesteriliseerd glycerol. Bevriezing van de glycerol voorraad en op te slaan bij -80 ° C.
- Voor gist DNA-zuivering, overdracht 1,5 ml van de 25 ml celkweek tot een microcentrifugebuis. Oogst de cellen door centrifugeren bij 1300 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Deze cellen worden gebruikt voor het analyseren van Pichia integranten om dubbel te controleren of het gen van belang is geïntegreerd in het Pichia genoom (zie stap II, part2). Bewaar de celpellet bij 4 ° C tot verdere analyse.
- Breng de rest van de 25 ml cultuur om een 50 ml Falcon buis en oogsten van de cellen door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer supernatant en plaats de buizen ondersteboven op een tissue om eventueel resterende media te verwijderen. Te wassen de cel pellet opnieuw in suspensie in 20 ml BMMY om alle resterende BMGY medium te verwijderen, zoals glycerol uit de BMGY medium kan de latere uitdrukking te remmen. Centrifugeer opnieuw bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en giet het supernatant.
- Resuspendeer celpellet tot een OD 600 van 1,0 in BMMY middellange tot expressie te induceren (ongeveer 100-200 ml) en breng de cultuur in een 1 liter fles verbijsterd. Dek de kolf met een 200 ml beker en terug te keren naar incubator naar groei voort te zetten bij 30 ° C.
Let op: het is belangrijk dat de temperatuur niet hoger is dan 30 ° C. Als de temperatuur van uw incubator fluctueert, stelt u de temperatuur op 28 ° C. Voldoende beluchting is ook een belangrijke parameter voor een efficiënte expressie tijdens de methanol inductie (bij het opwekken van expressie, nooit hoger zijn dan een cultuur volume> 10-30% van uw totale fles volume). Wij raden het gebruik van flessen verbijsterd, omdat ze meer zuurstof te introduceren in de cultuur media. - Voeg gesteriliseerde zuivere methanol tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% methanol elke 24 uur om inductie te behouden.
- Op bepaalde tijdstippen na het begin van de uitdrukking breng 1 ml van de cultuur een 1,5 mL microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 1300 xg gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenstaande om een aparte 1,5 mL microcentrifugebuis. Bewaar het supernatant en cel pellets bij -80 ° C tot verdere analyse. De monsters van verschillende tijdstippen zal worden geanalyseerd om de optimale periode voor de proteïne-expressie tot stand na inductie.
Let op: wij kiezen voor 6u, 12u, 24u, 36u en 48u als de tijdstippen voor het nemen van de monsters. Verdere groei tot 4 dagen is mogelijk. De optimale tijdstippen variëren tussen de verschillende expressie gebrachte eiwitten. - Analyseer de bovenstaande vloeistoffen en celpellets voor eiwit expressie door Coomassie-gekleurde SDS-PAGE en western blot (niet beschreven in dit protocol).
Deel 2: Gist DNA-zuivering en PCR-analyse van het Pichia gaaf
Alle reagentia die nodig zijn voor de gist DNA-zuivering stap van het Pichia cultuur in BMGY zijn opgenomen in de MasterPure gist DNA Purification Kit van EPICENTRUM.
Let op: deze analyse is extra en wordt uitgevoerd om te bepalen of het gen van belang is geïntegreerd in het Pichia genoom. De cel pellet uit een 1,5 ml monster genomen uit de cultuur in BMGY (zie stap II, onderdeel 1.3) wordt gebruikt.
Volg de instructies van de Epicentre MasterPure Gist DNA-zuivering handleiding en uitvoeren van een PCR met de gist DNA met specifieke primers voor de insert. Analyseer 3 pi van uw PCR-product op een agarosegel met 1 pl ethidiumbromide. Onder andere een 1 Kb + size marker in een goed aan de grootte van uw plaatsen te interpreteren en het DNA met behulp van een gel documentatie station te visualiseren.
Het recombinante eiwit kan worden geanalyseerd door western blot-analyse. Eiwitzuivering kunnen worden uitgevoerd door His-tag zuivering op metaal-geladen hars (niet beschreven in dit protocol).
Bijlage, lijst van recepten
Stap I:
- YPD medium:
Voor te bereiden 600 mlvan YPD medium (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) los 5 g gistextract en 12 g pepton in 540 ml water. Autoclaaf gedurende 20 minuten op vloeistof cyclus.
In de tussentijd bereiden 70 ml van 20% dextrose en filter-gesteriliseerd voor gebruik.
Laat de autoclaaf oplossing afkoelen tot ~ 60 ° C en voeg 60 ml van een filter gesteriliseerde 20% dextrose. - YPDS (+ Zeocin) platen:
Tot 500 ml YPDS + Zeocin agar (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium met sorbitol) los 5 g gistextract, 91,1 g sorbitol en 10 g pepton in 450 ml water te bereiden. Voeg 10 g agar en een magnetische roerstaaf en autoclaaf gedurende 20 minuten op vloeistof cyclus.
In de tussentijd bereiden 60 ml van 20% dextrose en filter-gesteriliseerd voor gebruik.
Laat de autoclaaf oplossing afkoelen tot ~ 60 ° C, voeg 50 ml van een filter gesteriliseerde 20% dextrose.
Giet een paar platen voor het toevoegen van het antibioticum voor YPDS platen zonder Zeocin. Voeg vervolgens 500 pi Zeocin van een 100 mg / ml stockoplossing aan een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml Zeocin te verkrijgen in de agar. Laat roeren op een magnetische plaat bij het toevoegen van het antibioticum en roer gedurende een extra 2 minuten om even te laten mixen.
Giet media in petrischalen en bedek met zwarte kunststof. Laat platen drogen op bankje 's nachts. Store YPD platen met Zeocin bij 4 ° C. De houdbaarheid is een tot twee weken.
Let op: de dekking met de plastic is nodig omdat Zeocin is lichtgevoelig.
Stap II:
- BMGY (gebufferde glycerol-complex Medium) en BMMY (gebufferd Methanol-complex Medium):
Los voor elk medium 8 g gistextract en 16 g pepton in 560 ml water. Autoclaaf gedurende 20 minuten op vloeistof cyclus.
In de tussentijd de voorbereiding van de volgende oplossingen:- 1 M kalium fosfaatbuffer, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% yeast nitrogen base met ammoniumsulfaat zonder aminozuren):
- 500X B (0,02% Biotine):
- 10X M (5% methanol):
- 10X GY (10% glycerol):
Laat de autoclaaf oplossing afkoelen tot kamertemperatuur, dan is de volgende toe te voegen en meng goed:- 80 ml 1 M kalium fosfaatbuffer, pH 6,0;
- 80 ml 10X YNB
- 0,16 mL 500X B
- 80 ml 10X GY
Bewaar media bij 4 ° C. De houdbaarheid van deze oplossing is ongeveer twee maanden.
Representatieve resultaten
Figuur 1. Deze western blot beeld toont vier tot expressie gebrachte eiwitten (aangeduid als 1605, 0537, 1228 en 1682) na 24 uur van meningsuiting. Het antilichaam wordt gebruikt voor immunoblotting was een c-myc-HRP antilichaam. De tweede baan (met het label N) is een negatieve controle en was geladen met supernatans van cellen die niet tot expressie een recombinant eiwit omdat ze getransformeerd met de ouder (gewone) vector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwitexpressie het gebruik van de methylotrofe gist Pichia pastoris als host systeem is beschreven in dit protocol. Het eiwit kan worden uitgescheiden in het medium afhankelijk van de gebruikte kloneringsvector. De afscheiding van het recombinante eiwit maakt de daaropvolgende zuivering eenvoudiger. Kan echter de getoonde voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de expressie van verschillende eiwitten en veranderingen in de voorwaarden en expressie tijden kan leiden tot verhoogde eiwit-niveaus. De vector die in dit protocol heeft de functie van een c-myc epitoop en een antilichaam voor deze epitoop kan worden gekocht. Hierdoor kan de analyse van eiwitten waarvoor er geen antistoffen nog niet beschikbaar. Het His-tag-functie van de ouder vector vergemakkelijkt de eiwitzuivering op metaal-chelerende hars en er is ook een antilichaam voor de His-tag deel van de vector aanwezig.
Zoals beschreven in dit protocol, eiwitexpressie in Pichia pastoris is een meerstaps-proces dat moet goed worden gepland en voorbereid. Een tijd van twee tot drie weken nodig om alle stappen uit te voeren, maar met uitzondering van het klonen van het construct met het gen van belang. De basis voor een succesvolle transformatie naar P. pastoris zijn hoog transformatie efficiënt bevoegde gistcellen en een gelineariseerde constructie die kan integreren in de gist genoom. Western blot analyse en His-tag zuivering zijn applicaties op het niveau van recombinant eiwit expressie te bepalen en zijn de volgende stappen uit te voeren na dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds, en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) bedanken voor de ondersteuning van dit werk. MT werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
