施肥爪蟾卵母细胞使用主机传输方法

Summary

对施肥的程序

Abstract

往往阻碍了必要的时间和费用，产生产妇效应突变动物研究母系遗传的分子脊椎动物的早期发展的贡献。此外，许多技术如爪蟾和斑马鱼的生物过表达或抑制基因功能未能充分针对危重孕产妇的信号转导通路，如Wnt信号。在非洲爪蟾 ，在培养的卵母细胞的基因功能和操纵，随后施肥可以在一定程度上改善这些问题。手动defolliculated卵母细胞是从供体卵巢组织，注射或视为文化，然后用黄体酮刺激诱导成熟。下一步，卵母细胞引入腔体内的雌蛙排卵主机，届时他们将通过主机的输卵管移位和掌握修改和果冻大衣施肥必要。由此产生的胚胎，然后将筹集到所需的阶段和任何实验扰动的影响分析。这台主机传输方法已发现早期发展的基本机制非常有效，并没有在任何其他脊椎动物模式生物的实验可能允许广泛。

Protocol

1。手术切除的卵巢组织

1. 准备一批新的卵母细胞培养液中（OCM;材料），根据实验的大小之间的400-800毫升。调整pH值至7.6-7.8，直到酚红变成深红色（5N氢氧化钠6个左右的小滴）。倒出少量检查在一个单独的管的pH值，因为pH电极可能污染媒体。 OCM应存放在18 ° C，并在一个星期内使用。
2. 〜2L的缓冲麻醉溶液（材料）中选择3-5名女性和地方之一。我们尽量避免使用，美联储在当天或手术前的青蛙。虽然青蛙是屈服于麻醉剂，用70％乙醇消毒手术区，并准备手术器械。
3. 消毒手术器械浸泡在炎热的珠灭菌20秒，在250 ° C。下列文书应手：手术刀处理（＃3）和刀片（＃10或11），杜蒙钳，波恩虹膜剪刀（弯曲或直），哈尔西或奥尔森Hegar微持针器，并缝合几双。广场上保持无菌缝合包内无菌培养皿或消毒工具。把握针持针器开始前所需的方向。我们喜欢奥尔森Hegar针持有人，因为在处理包含剪刀刀片，可用于调整缝线，而无需切换文书。
4. 10分钟后，检查已经取得了手术的麻醉平面。麻醉青蛙会停止移动，并不会响应一个脚趾捏或上缴。麻醉应持续15分钟，这是足够的时间来执行操作。唐合适的手术装束。这可以包括清洁（非乳胶）手套，实验室外套，和口罩，根据个人的喜好和机构动物照顾指引。
5. 注意无菌技术操作，青蛙的皮肤分泌物中含有抗菌肽，一般在手术过程中减少污染的发生，虽然无菌技术操作应尽可能。可用于外科窗帘，但可能并不需要的体制IACUCs和可能无法提供多少好处。一般“尖端技术”使用，其中的手做触摸仪器，缝合材料或切口部位的无菌针头。仪器可resterilized（珠灭菌）以下的皮肤切口，无菌区应保持台式放置工具（如培养皿或缝合包）。体制要求，可以显着差异，所以请按照您的机构“的指导方针，并收到相应的指令执行手术前。
6. 从麻醉中取出的青蛙和背斜卧在潮湿的手术擦拭。注。 povidine碘稀释（1:20）或洗必泰（0.75％）冲洗可以清除皮肤。然而，要避免商业外科磨砂，肥皂和70％的异丙醇，因为这些东西会损伤娇嫩的肌肤两栖动物。
7. 使用手术刀或虹膜小剪刀，一个小（1 - 1.5厘米）切口在腹部，侧中线下部的皮肤。备用双方应执行相同的青蛙的后续切口，互相间隔。切口可平行或垂直于中线。
8. 请在两个阶段的皮肤和腹部肌肉的切口。切割后的皮肤，解除肌肉层和周围的白色筋膜与钳，并提出肌肉的切口。用剪刀和剪直下，尝试作出一个迅速切断暴露体腔，留下干净的伤口边缘。如果只是筋膜被切断，它会收回，并将使缝合更加困难。解除肌肉将有助于避免无意中伤人任何内部器官。另外，尽量避免通过任何可见的淋巴结心脏或血管的肌肉层内切割。扩大与剪刀的切口长度，使卵巢可以很容易地渡过难关。
9. 一旦切口，卵巢应清晰可见。促使卵巢，抓钳和外部的卵巢组织。组织所需的金额被删除，在体壁的水平和修剪。不要东西的组织，进入体腔腔，因为这可能是感染或其他并发症的源。
10. 立即在解剖显微镜下观察卵巢的小块defolliculate几个卵母细胞，以测试他们的素质。他们应该坚定和统一的大小和着色。如果他们是可以接受的的，取出所需数量的卵巢组织，缝合切口。足以装满一个90毫米的培养皿通常足以满足大多数实验。如果存在质量问题的卵母细胞，缝合青蛙和重复使用不同的女性。
11. 关闭切口缝合肌肉和筋膜层。插入的N eedle一个外侧切口几毫米，一定要通过以及通过筋膜层。刚刚通过的肌肉缝合撕裂组织和松动。使用镊子，以帮助从下面插入切口对面针。释放和重新把握针从体内外，渡过难关，直到几英寸左右的尾巴仍然缝合，照顾，不要把它拉一路过关斩将。
12. 关闭伤口缝合模式用一个简单的中断。我们使用一个基本的仪器配合，使外科医生的平方海里（礁节）。循环各地的持针器缝合的长端，抓住尾巴，并通过循环拉向你并拧紧。循环和再次转危为安，此时远离你拉持针器。第三扔掉，可用于增加安全性（在同一方向作为第一）。修剪缝合，留短尾巴，并在另一缝合肌肉几毫米远。两个缝线足够小缝线;较大的3个。重复的皮肤层。基本缝合技术的视频演示，YouTube上搜索 - “仪器领带”，也有不少选择，但基本技术是相同的。
13. 用去离子水冲洗掉的女性，并把她放在阴凉（18℃）水填补了回收桶。虽然在实验室中，青蛙是保存在与Amquel处理，以去除氯的自来水。每隔几分钟，轻轻从水中青蛙，并期待囫囵吞枣或眼胀的动作，从麻醉中复苏的指标。
14. 注：生存手术是不是绝对必要的，以取得卵巢组织，虽然女性将继续产生良好的卵母细胞后，许多操作。执行手术的生存也将减少使用动物的数量。一定要按照动物保健单位的指导方针，在脊椎动物生存的手术方法，术后护理和监测，并允许个人手术数量。

2。培养和Defolliculating卵母细胞

1. 右后手术完成后，细分成小块（1〜2厘米^2），并存储在新鲜OCM使用5-6件，每90毫米菜卵巢。个人裂片卵巢剖开，夷为平地，并切成见方的小块。这些冲洗干净OCM，并放置在培养皿。扁平化和分裂的卵巢，将扩大在文化生活和defolliculation容易。
2. 移动叶小碟的OCM和手动defolliculate 300-500卵母细胞。使用无菌，火抛光的吸管转移卵母细胞。我们发现，用棉花堵塞各种，是尽量减少污染的文化的关键。商店的卵母细胞，在18 ° C在8毫升OCM（中期菜（猎鹰1007））在100-150组。通过练习，你应该能够defolliculate足够的卵母细胞，在1-2小时内。 Collagenased卵母细胞不适合主机的传输，因为他们不能fertilizable。
3. Defolliculating方法。我们defolliculate使用制表匠钳（杜蒙＃4S或5S，精细科学的工具），Smith 等人描述的基本方法，（1991）。使用一对钳（在你的惯用手），掌握卵泡膜的结缔组织层，周围完全成熟的阶段六，卵母细胞卵泡卵巢（柄）不远的地方。随着对其他​​钳，把握第一对相邻的卵巢。轻轻撕开拉动整个卵母细胞卵泡层。轻轻梳理出组织的卵母细胞。成功defolliculated的卵母细胞卵母细胞比简单拉不去除毛囊层，将没有可见的血管floppier。
4. 注：重要的是保持很轻的压力钳提示，提示，以满足仅够。夹持得太紧，是一种常见的初学者，并会导致卵母细胞的卵泡完好被拉。专门为defolliculating保持镊子一双好。提示应符合恰恰应略高于钳爪蟾胚胎（图1）植粗短。
5. 我们定期测试约20黄体酮和中止实验，如果成熟的成熟率差（<50％）在室温下6-7小时后。
6. 此时，卵母细胞可以被操纵和培养的需要，如寡核苷酸，吗啉或mRNA显微注射。注射程序而有所不同，实验室，所以我们不会在这里介绍这些。卵母细胞可以维持到一个星期在OCM，但一般健康的下降，所以最好是使用隔离96小时内转移。
7. 请记住，只有5至6组（包括控制），可以转移到一个单一的女性，由于重要的染料的限制，所以你的实验计划。

“> 3。卵母细胞成熟和刺激未来东道国女性

1. 如果执行寡枯竭的救援，注入约24-48小时后寡核苷酸基因的RNA（通常为50-300 PG）。寡核苷酸将有这个时间退化，不应影响注入的RNA。
2. 在执行转移前的晚上，加16μL孕酮工作液（乙醇1mm）的8毫升OCM，在中菜（最后的孕激素的浓度是1〜2微米）的卵母细胞。孵育10-12小时，18 ° C至使卵母细胞成熟。
3. 注入1000个单位的hCG青蛙3-5女性诱发产蛋。我们的实验似乎更好地工作，如果卵母细胞成熟和注射HCG大约在同一时间完成，约12个小时到主机（例如，10日下午-10上午）植入前。让女性在室温或18 ° C过夜。

4。生命的卵母细胞的制备及染料染色

1. 在上午的转移，使〜45-60“建立和执行程序。在这一点上，成熟的卵母细胞可以被冻结后的基因敲除或蛋白表达的疗效分析。同时，检查的卵母细胞没有受到感染，并有一个很好的成熟率（> 50％）。受感染的卵母细胞，将不施肥。解冻重要的染料（材料），并在5分钟最大转速旋转。
2. 颜色不同的实验组加入80μL适当重要的染料（S）的卵母细胞的菜肴，并培育15'摇摆。在这段时间内，选择一台主机和女性开始麻醉。选择了一只青蛙，慢慢地产卵正​​常或轻度挤压产生丰富的鸡蛋。从主机的鸡蛋应质量好。避免铺设的鸡蛋或粉碎鸡蛋串的女性。
3. 彩蛋传输大量的新鲜OCM，菜，漩涡简单地洗，事先放在一边转移。
4. 准备一个无菌的巴斯德吸管与孔宽度足以容纳一个用于移植的卵母细胞的卵母细胞（1〜1.5毫米）。分数与钻石铅笔吸管和打破干净。消防波兰，直到边缘平滑，注意不要融化开幕闭幕。

5。表演的卵母细胞移植

1. 卵母细胞移植使用在第I部所述的相同的手术过程中，虽然，操纵，而不是消除卵巢卵母细胞进入体腔用移液器介绍。理想的情况下，过户手续应尽快与切口的大小应保持尽可能小。
2. Anesthesize主机女性和准备手术器械，在第二部分所述一和切口部分中描述的一切口可较小，但需要足够大的移液管（图2A），以适应孔。
3. 用镊子移植的卵母细胞，掌握和提高肌肉和筋膜瓣，介绍使用巴斯德吸管准备上述实验的卵母细胞。漩涡中心收集到的卵母细胞的菜他们和尽可能多的吸。允许进入移液器年底定居的卵母细胞被引入，以防止多余的液体，切口插入吸管尖，慢慢让卵母细胞滴入到体腔（图2B）。重复，直到所有的卵母细胞已被转移。不要随时发布的肌肉层，直到你已经开始缝合，或卵母细胞，将切口溢出。
4. 后的卵母细胞已经转移，掌握与钳切口的两侧，并带他们一起，使卵母细胞进入人体腔定居。开始缝合描述的那样，照顾上的肌肉和筋膜保持向上的张力，直到第一个结绑（图2C）。这将让被驱逐出卵母细胞，将允许边缘切口愈合均匀。添加另一肌肉/筋膜层缝合，然后缝合皮肤。
5. 用去离子水冲洗掉的女性，她放置在一个充满冷却（18℃）Amquel处理过的水回收桶。上述监视她从麻醉中复苏。她应该开始铺设蛋通常在手术后。
6. 获得使用正常程序的青蛙一个男性睾丸。商店在OCM或L15睾丸，直到需要。施肥转移实验时，我们更喜欢新鲜的睾丸。

6。回收的卵母细胞体外受精

1. 腹膜纤毛将驱动器传输的蛋（和主机的正常体腔鸡蛋）在体腔的前输卵管的开口。彩蛋可以收回，转让后2-3小时开始正常挤压。蛋可每半小时左右的女性，直到停止铺设。
2. 施肥在一个SPERM悬浮液（〜4毫升1X孕产妇死亡率）为4分钟。洪水和冲洗与0.1倍的MMR广泛。鸡蛋应激活正常，将开始裂解〜1.5-2小时受精后。转蛋往往会切割略晚于主机鸡蛋。
3. 半胱氨酸的正常和排序胚胎成单独的菜肴取出果冻大衣。这是可以做到在任何阶段，根据实验的需要。它通常最容易识别周围的4细胞阶段的各种颜色和晚期囊胚阶段，在最困难的。文化的鸡蛋在一个干净的0.1倍的MMR低密度（<50％中等菜）。从这一点来说，可以被视为胚胎和操纵正常。
4. 将青蛙的动物设施和显示器在未来数天的并发症。
5. 替代的施肥方法;产蛋高盐缓冲液
   1. 青蛙从麻醉中恢复后，她到〜1L高盐MMR（1.2倍）。允许女性奠定蛋约4-6小时到缓冲区。挤压剩下的鸡蛋，排水1.2倍MMR和清洁碟的彩蛋排序;删除所有可能的液体。
   2. 洗净广泛0.3X孕产妇死亡率和受精鸡蛋，直到激活（10分钟）在最小的体积0.3X的MMR /精子悬液。洪水与0.1倍MMR和以上文化。这个选项是非常有用的，如果在同一个舞台，或者如果鸡蛋手册表达损害捐助卵母细胞所需的许多鸡蛋。

Discussion

一个成功的转移，将导致受精和正常的卵母细胞> 50％（图3）裂解。过去一般在30-60％的转让的卵母细胞存活的神经胚阶段。我们通常是75-150％实验组的卵母细胞，这将产生几种类型的分析足够的胚胎（原位RT - PCR）以及可视化的表型转移。植入大幅更多的卵母细胞似乎并不大大提高产量。此外，应至少有30％组的卵母细胞转移到保证，至少有一些通过原肠。重要的染料一般不影响这里描述的浓度和条件下的胚胎，虽然染料在某些情况下可能有不利影响。经典，中性红据报道，当暴露在强烈钨光源光毒属性。最近，和平号空间站和Heasman（2008）报道，布朗俾斯麦可以有一定的毒副作用，如果胚胎是在低温条件下孵育。基本的预防措施，如不能过分的卵母细胞死亡，并避免极端的温度和光照应消除重要的染料副作用的可能性。

在成功或失败的方法的最大的决定因素是捐助卵母细胞的质量和主机女性。有没有万无一失的方法，决定是否将施肥的卵母细胞的特定批次。应尽量避免与高比例的闭锁卵母细胞的卵巢。此外，我们曾与卵巢穷人的成功，很大程度上是吻合血管，可能表明吸收发生。应保持在18 ° C为尽可能多的卵母细胞，并保持健康状态，否则，卵母细胞会不会受精，如果感染或损坏。它也显示，在我们的实验室，获得更好的成果时defolliculator较有经验，可以隔离，并在很短的时间内注入大量的卵母细胞。同样，应选择健康的卵子中的主机，虽然这是从来没有一个给定的青蛙一定会当好东道主。 defolliculating，外科医生的技能，也关系到手术成功。最大限度地减少anesthesized主机是时间的长度似乎有效的恢复和施肥的关键。

整体的各种程序的时机是成功的卵母细胞转移实验的关键。在一般情况下，时间越短，卵母细胞在文化保存，更好的整体受精和胚胎的健康。对于基因敲除采用反义寡核苷酸的实验中，卵母细胞进行培养寡核苷酸注射后至少24小时，以便为靶mRNA的寡核苷酸的营业额最大的枯竭。因此，卵母细胞应该是defolliculated尽快注射当天。一个典型的实验可能与卵母细胞隔离，并注射成熟和刺激的女性，在周二晚上，和转让日（星期三）上午，上周一开始。如果目标RNA周转缓慢，或产妇有丰富的蛋白质，文化期可以延长至48甚至72小时。我们有最好的成功时，卵母细胞与孕激素治疗后12小时内转移。过成熟卵母细胞开始恶化，一般施肥不佳。我们一般添加孕激素和注射HCG约12个小时的女性，在执行转移之前〜18 ° C过夜保存卵母细胞和青蛙。

虽然主机的传输方法是劳动密集最初，所需的基本技能，可以获取没有太大的困难。这种方法最常见的用途是卵母细胞受精具体产妇的mRNA反义寡核苷酸注射液枯竭。也可以进行其他操作，如mRNA表达或药物治疗。这些往往可以有以下注射受精鸡蛋中对胚胎的表达增加或差分功能，由于不同的结果相比。 E - cadherin蛋白的过度表达（Heasman等 ，1991）和紫外线照射（侯力威等人，1987年。Elinson Pasceri，1989年）是两个有趣的例子。从我们的实验室初步研究结果还表明，转基因的方法，使用注入整合或meganucleases可能在卵母细胞更有效地工作，以及。

主机传输技术允许前和受精后阶段的实验，从而可以提供，甚至仅仅看在受精后爪事件不可能在其他生物的见解。鉴于产妇信号途径在发展和脊椎动物中产生的母体效应突变的难度和成本的重要性，这种方法很可能留在调查早期发展的一个有用的工具。

7。代表重sults

图1。 defolliculating好（上）和差（底部）钳。

图2。培养的卵母细胞转移到一个主机女性（一）小切口是在主机蛙的下腹部。允许引进的卵母细胞，肌肉层略有升高。 （二）卵母细胞是重要的染色和放置在腔体内，通过切口。 （三）完成初步缝合肌肉层。

图3。划分的例子，在8 - 16细胞阶段的卵母细胞转移，拆除果冻大衣。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	Invitrogen	11415-064
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1x Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P-0781
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl2
10 mM MgCl2
150 mM HEPES
adjust to pH 7.6-7.8
Store at 4°C
Anesthetic solution
1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A-5040
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly
Progesterone stocks
10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol
Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution
Store at -20°C
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
Blue: 0.1% Nile Blue A	Aldrich	121479-5G
Red: 0.25% Neutral Red	Sigma-Aldrich	N-6634
Brown: 1% Bismarck Brown	Sigma-Aldrich	B-2759
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.