Summary
Fertilizing के लिए प्रक्रिया
Abstract
मातृ प्रभाव उत्परिवर्ती पशुओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय और खर्च से माता से विरासत में मिला अणुओं के योगदान के अध्ययन के प्रारंभिक विकास हड्डीवाला अक्सर आड़े आती है. इसके अतिरिक्त, तकनीक के कई overexpress या Xenopus और zebrafish जैसे जीवों में जीन समारोह को बाधित करने के लिए पर्याप्त महत्वपूर्ण WNT सिगनल के रूप में मातृ संकेत रास्ते, लक्ष्य असफल. Xenopus में, सुसंस्कृत oocytes में जीन समारोह से छेड़छाड़ और बाद में उन्हें fertilizing इन समस्याओं को कुछ हद तक उन्नति कर सकते हैं . Oocytes मैन्युअल रूप से दाता अंडाशय के ऊतकों से defolliculated हैं, इंजेक्शन या संस्कृति में इलाज के रूप में वांछित है, और तो प्रोजेस्टेरोन के साथ उत्तेजित करने के लिए परिपक्वता प्रेरित. अगला, oocytes एक ovulating मेजबान महिला मेंढक का शरीर गुहा में पेश कर रहे हैं, जिस वे मेजबान oviduct के माध्यम से translocated हो जाएगा और संशोधनों और जेली कोट निषेचन के लिए आवश्यक प्राप्त है. परिणामस्वरूप भ्रूण तब इच्छित मंच पर उठाया कर सकते हैं हो सकता है और किसी भी प्रयोगात्मक perturbations के प्रभाव के लिए विश्लेषण किया. यह मेजबान हस्तांतरण विधि जल्दी विकास के बुनियादी तंत्र uncovering में अत्यंत प्रभावी किया गया है और प्रयोगात्मक किसी भी अन्य हड्डीवाला मॉडल जीव में उपलब्ध नहीं है संभावनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देता है.
Protocol
1. अंडाशय ऊतक के सर्जिकल हटाना
- 400-800 एमएल प्रयोग के आकार पर निर्भर करता है के बीच; oocyte मध्यम संस्कृति के एक ताजा बैच (सामग्री OCM) तैयार करें. 7.6-7.8 पीएच समायोजित, जब तक phenol के लाल एक गहरे लाल रंग (5N NaOH के छह या तो छोटे बूंदों) बदल जाता है. एक छोटी सी राशि के लिए एक अलग ट्यूब में पीएच की जांच के बाद से पीएच इलेक्ट्रोड मीडिया दूषित हो सकता है बाहर डालो. OCM 18 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और एक सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया.
- ~ 2L बफर संवेदनाहारी समाधान (सामग्री) में 3-5 महिलाओं और एक जगह का चयन करें. हम है कि दिन या सर्जरी से पहले पर खिलाया गया मेंढ़कों का उपयोग कर से बचने की कोशिश करो. जबकि मेंढक संवेदनाहारी के सामने झुकने है, EtOH 70% के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित और शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार.
- 250 पर 20 सेकंड एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में विसर्जन के द्वारा शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित डिग्री सेल्सियस निम्नलिखित उपकरणों हाथ पर होना चाहिए: स्केलपेल (# 3) संभाल और ब्लेड (# 10 या 11), Dumont संदंश, बॉन परितारिका कैंची (वक्रित या सीधे), Halsey या ऑलसेन Hegar सूक्ष्म सुई धारक, और sutures के कई जोड़े. प्लेस एक बाँझ पेट्री डिश या सीवन बाँझ रखने के पैकेज के अंदर पर उपकरणों निष्फल. शुरुआत से पहले वांछित अभिविन्यास में सुई धारक में सुई समझ. हम ऑलसेन - Hegar सुई धारकों पसंद करते हैं क्योंकि संभाल कैंची ब्लेड, जो स्विचन उपकरणों के बिना sutures के ट्रिम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं.
- 10 मिनट के बाद जांच, कि संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान हासिल किया गया है. Anesthetized मेंढ़कों चलती बंद करो और जवाब या नहीं होगा एक पैर के अंगूठे चुटकी को खत्म कर दिया जा रहा है. संज्ञाहरण 15 मिनट, जो आपरेशन प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त समय की तुलना में अधिक है पिछले चाहिए. डॉन उपयुक्त शल्य चिकित्सा पोशाक. यह साफ दस्ताने (गैर लाटेकस), प्रयोगशाला कोट, और सर्जिकल मास्क, व्यक्तिगत पसंद और संस्थागत जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के आधार पर शामिल कर सकते हैं.
- सड़न रोकनेवाला तकनीक पर ध्यान दें: मेंढक त्वचा स्राव रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स है कि आम तौर पर सर्जरी के दौरान संदूषण की घटनाओं को कम करने के लिए, हालांकि सड़न रोकनेवाला तकनीक में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में पालन किया जाना चाहिए होते हैं. सर्जिकल पर्दे, इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन आवश्यकता नहीं जा सकता संस्थागत IACUCs द्वारा और ज्यादा लाभ प्रदान नहीं कर सकते हैं. आम तौर पर "तकनीक टिप" प्रयोग किया जाता है, जहां हाथ उपकरणों, सीवन सामग्री या चीरा साइट के बाँझ सुझावों को स्पर्श करते हैं. उपकरण (मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में) resterilized किया जा सकता है त्वचा के निम्नलिखित चीरा और एक बाँझ क्षेत्र रखने यंत्र (जैसे एक पेट्री डिश या सीवन पैकेज के रूप में) के लिए benchtop पर बनाए रखा जाना चाहिए. संस्थागत आवश्यकताओं काफी अलग कर सकते हैं, तो कृपया अपने संस्थानों के दिशा निर्देशों का पालन करें और उचित अनुदेश प्राप्त प्रदर्शन सर्जरी से पहले.
- संवेदनाहारी से मेंढक और एक नम पोंछ शल्य चिकित्सा पर पृष्ठीय लेटना में जगह निकालें. ध्यान दें. त्वचा को पतला povidine (01:20) आयोडीन या chlorhexidine (0.75%) में rinsing द्वारा साफ किया जा सकता है. हालांकि, वाणिज्यिक शल्य चिकित्सा scrubs, साबुन और 70% isopropyl शराब से बचने के लिए, के रूप में इन उभयचर की नाजुक त्वचा को नुकसान होगा.
- पेट, midline के लिए पार्श्व के निचले हिस्से में त्वचा में चीरा - एक स्केलपेल या छोटे परितारिका कैंची का प्रयोग, एक छोटी सी (1.5 सेमी 1). एक ही मेंढक पर बाद चीरों वैकल्पिक पक्षों पर किया जाना चाहिए, अच्छी तरह से एक दूसरे से दूरी. चीरों या तो समानांतर या midline को सीधा किया जा सकता है.
- दो चरणों में त्वचा और पेट की मांसपेशियों चीरों बनाओ. त्वचा को काटने के बाद, मांसपेशियों की परत और आसपास के संदंश के साथ सफेद रंग प्रावरणी उठा और उठाया मांसपेशियों में चीरा. कैंची का प्रयोग करें और सीधे नीचे में कटौती, शरीर गुहा छोड़ने स्वच्छ घाव किनारों का पर्दाफाश करने के लिए एक तेजी से कट बनाने की कोशिश. यदि सिर्फ प्रावरणी काट रहा है, इसे वापस लेना और अधिक कठिन suturing जाएगा. मांसपेशियों भारोत्तोलन में मदद मिलेगी अनजाने में किसी भी आंतरिक अंगों घायल हो गए बचने के. इसके अलावा, मांसपेशियों की परतों के भीतर किसी भी दृश्य लसीका दिल या रक्त वाहिकाओं के माध्यम से काटने से बचने की कोशिश. चीरा के कैंची के साथ लंबाई बढ़ाने इतना है कि अंडाशय आसानी से के माध्यम से खींच सकते हैं.
- अंडाशय स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है एक बार चीरा किया जाता है चाहिए. अंडाशय की खरीद करने के लिए, संदंश के साथ समझ और अंडाशय के ऊतकों अमल में लाना. ऊतक के वांछित राशि हटा दिया है और शरीर की दीवार के स्तर पर बंद छंटनी की. ऊतक वापस coelomic गुहा में सामान के रूप में यह संक्रमण या अन्य जटिलताओं का एक स्रोत हो सकता है मत करो.
- तुरंत एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक अंडाशय के छोटे टुकड़े का पालन और उनकी गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए कुछ oocytes defolliculate. वे फर्म हो सकता है और एक समान आकार और रंगाई चाहिए. अगर वे स्वीकार्य हैं, अंडाशय के ऊतकों के वांछित राशि को हटाने और चीरा टांका. एक 90 मिमी पेट्री डिश को भरने के लिए पर्याप्त आम तौर पर ज्यादातर प्रयोगों के लिए पर्याप्त है. यदि oocytes संदिग्ध गुणवत्ता के हैं, सीवन मेंढक और एक अलग महिला के साथ दोहराएँ.
- मांसपेशियों और प्रावरणी परत पहले suturing चीरा को बंद करें. पता सम्मिलित करें कुछ चीरा के लिए पार्श्व मिलीमीटर eedle, प्रावरणी परत के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से गुजारें सुनिश्चित करने. सिर्फ मांसपेशियों के माध्यम से Sutures ऊतक आंसू और ढीली आ सकता है. संदंश का प्रयोग करें नीचे से चीरा के विपरीत पक्ष पर सुई डालने में मदद करने के लिए. रिलीज और शरीर के बाहर से सुई फिर से समझ और पूंछ रहता है के कई इंच या तो जब तक के माध्यम से सिवनी खींच खींच नहीं के माध्यम से सभी तरह ख्याल रख रही.
- घाव suturing का एक सरल बाधित पैटर्न के साथ बंद करो. हम एक बुनियादी साधन टाई का उपयोग करने के लिए सर्जन वर्ग समुद्री मील (चट्टान समुद्री मील). सुई धारक के आसपास सीवन के लंबे अंत लूप, पूंछ समझ और यह पाश के माध्यम से आप की ओर खींच और कस. लूप और के माध्यम से फिर से पुल, इस समय सुई धारक आप से दूर खींच. एक तीसरा फेंक कहा कि सुरक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (पहले के रूप में एक ही दिशा में में). सीवन छाँटो, छोटी पूंछ छोड़ने और मांसपेशियों में एक और सिवनी कुछ मिलीमीटर की दूरी पर है. दो sutures के छोटे sutures के लिए पर्याप्त हैं, बड़े लोगों के लिए तीन. त्वचा की परत के लिए दोहराएँ. बुनियादी suturing तकनीक के वीडियो प्रदर्शनों यूट्यूब पर उपलब्ध हैं - "साधन टाई" के लिए खोज, वहाँ बहुत से चुनने के लिए कुछ कर रहे हैं, हालांकि बुनियादी तकनीक ही है.
- विआयनीकृत जल के साथ बंद महिला कुल्ला और उसे एक वसूली शांत (18 डिग्री सेल्सियस) पानी से भरी बाल्टी में जगह. जबकि प्रयोगशाला में, मेंढ़क नल Amquel के साथ इलाज किया chloramines हटायें पानी में रखा जाता है. हर कुछ मिनट, धीरे पानी से मेंढक लिफ्ट और gulping या आंख उभड़ा आंदोलनों, संज्ञाहरण से वसूली के संकेत के लिए देखो.
- नोट: जीवन रक्षा सर्जरी कड़ाई से अंडाशय के ऊतकों प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, हालांकि महिलाओं को आपरेशन के एक संख्या के बाद अच्छे oocytes उत्पादन जारी रहेगा. अस्तित्व सर्जरी प्रदर्शन भी प्रयुक्त जानवर की संख्या पर नीचे कट जाएगा. हड्डीवाला अस्तित्व सर्जरी विधियों, बाद सेशन देखभाल और निगरानी पर और एक व्यक्ति को अनुमति दी सर्जरी की संख्या के लिए अपने जानवरों की देखभाल यूनिट के दिशा निर्देशों का पालन सुनिश्चित करें.
2. संवर्धन और Defolliculating oocytes
- अधिकार सर्जरी के बाद समाप्त हो गया है, छोटे (~ 2 2 सेमी) टुकड़े और ताजा OCM में दुकान, 90 मिमी पकवान प्रति 5-6 टुकड़े का उपयोग करने में अंडाशय प्रतिभाग करना. अंडाशय के व्यक्तिगत lobes खुले काट रहे हैं, बाहर चपटा और वर्ग टुकड़ों में काट. ये साफ OCM में rinsed हैं और संस्कृति के लिए बर्तन में रखा जाता है. सपाट और अंडाशय विभाजित संस्कृति में अपने जीवन का विस्तार और defolliculation आसान कर देगा.
- OCM का एक छोटा सा पकवान पालि ले जाएँ और मैन्युअल रूप से 300-500 oocytes defolliculate. स्थानांतरण oocytes एक बाँझ, आग पॉलिश पिपेट का उपयोग. हमने पाया है कि किस्म के कपास - खामियों को दूर का उपयोग संस्कृतियों के प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक है. 18 की उम्र में oocytes स्टोर ° 8 एमएल OCM में 100-150 के समूह में सी (मध्यम बर्तन (1007 फाल्कन) में). अभ्यास के साथ, आप के लिए 1-2 घंटे में पर्याप्त oocytes defolliculate करने में सक्षम होना चाहिए. Collagenased oocytes मेजबान हस्तांतरण के लिए उपयुक्त के बाद से वे fertilizable नहीं हो रहे हैं नहीं कर रहे हैं.
- विधि Defolliculating. हम 'watchmakers (Dumont # 4s या # 5s, ठीक विज्ञान उपकरण) संदंश, बुनियादी स्मिथ एट अल. में वर्णित विधियों का पालन, (1991) का उपयोग defolliculate. संदंश की एक जोड़ी अपने प्रमुख हाथ में () का उपयोग, theca जहां कूप अंडाशय (डंठल) से जुड़ा हुआ है के पास एक मंच पूरी तरह से विकसित छठी oocyte के आसपास संयोजी ऊतक परत समझ. संदंश के अन्य जोड़ी के साथ, पहली जोड़ी के लिए आसन्न अंडाशय समझ. हल्के oocyte भर में खींच द्वारा कूप परत खोलने के आंसू. धीरे ऊतक के बाहर oocyte तंग. सफलतापूर्वक defolliculated oocytes floppier की तुलना में बस oocytes कूप परत को हटाने के बिना दूर खींच लिया और दृश्य रक्त वाहिकाओं से रहित हो जाएगा.
- नोट: यह आवश्यक है संदंश के सुझावों पर बहुत हल्का दबाव बनाए रखने के लिए, सुझावों को पूरा करने के लिए मुश्किल से पर्याप्त है. बहुत कसकर मनोरंजक beginners के बीच एक आम बात है और बरकरार कूप के साथ दूर खींच लिया जा रहा है oocyte में परिणाम होगा. Defolliculating के लिए संदंश की एक अच्छी जोड़ी विशेष रूप से रखें. सुझावों को ठीक से मिलने और Xenopus भ्रूण (चित्रा 1) से explants करने के लिए संदंश की तुलना में थोड़ा blunter होना चाहिए.
- हम नियमित रूप से परिपक्व परीक्षण प्रोजेस्टेरोन और गर्भपात प्रयोग के साथ के बारे में 20 यदि परिपक्वता दर गरीब है (<कमरे के तापमान पर 6-7 घंटे के बाद 50%).
- इस बिंदु पर, oocytes और चालाकी से किया जा सकता सुसंस्कृत रूप में वांछित oligo, morpholino या mRNA की microinjection जैसे. इंजेक्शन प्रक्रियाओं प्रयोगशाला प्रति बदलती हैं, तो हम उन यहाँ का वर्णन नहीं होगा. Oocytes OCM में एक सप्ताह के लिए किया जा बनाए रखा जा सकता है, लेकिन आम तौर पर स्वास्थ्य में गिरावट आती है तो यह सबसे अच्छा है उन्हें अलगाव के 96 घंटे के भीतर हस्तांतरण के लिए उपयोग.
- ध्यान रखें कि केवल पांच से छह समूहों (नियंत्रण सहित) एक एकल महिला को हस्तांतरित किया जा सकता है, महत्वपूर्ण रंजक पर सीमाओं के कारण, तो अपने प्रयोगों तदनुसार योजना है.
- यदि oligo कमी की एक बचाव प्रदर्शन, oligo बाद ~ 24-48 घंटे अपने mRNA (आमतौर पर शाही सेना के स्नातकोत्तर 5-30) इंजेक्षन. oligos इस बार के द्वारा अपमानित और इंजेक्शन शाही सेना को प्रभावित नहीं होना चाहिए.
- हस्तांतरण के प्रदर्शन से पहले शाम को, 8 मध्यम व्यंजन में एमएल OCM (अंतिम प्रोजेस्टेरोन एकाग्रता ~ 2 सुक्ष्ममापी) में oocytes प्रोजेस्टेरोन काम कर समाधान के 16 μL (EtOH में 1mm) जोड़ें. 18 साल की उम्र में 10-12 घंटे सेते ° सी oocyte परिपक्वता के लिए अनुमति देने के लिए.
- एचसीजी के मेंढक प्रति 1000 इकाइयों के साथ 3-5 महिलाओं इंजेक्षन अंडे बिछाने प्रेरित. हमारे प्रयोगों के लिए बेहतर काम अगर oocyte परिपक्वता और एचसीजी इंजेक्शन एक ही समय के आसपास किया जाता है, मेजबान (जैसे, 10 -10 AM) 12 घंटे के बारे में दाखिल करने से पहले लग रहे हैं. आरटी या 18 ° रातोंरात सी में महिलाओं को छोड़ दें.
4. तैयारी और oocytes की महत्वपूर्ण डाई धुंधला
- हस्तांतरण की सुबह में, ~ 45-60 'स्थापित करने के लिए और प्रक्रिया प्रदर्शन के लिए अनुमति देते हैं. इस बिंदु पर, परिपक्व oocytes mRNA पछाड़ना या प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रभावकारिता के बाद के विश्लेषण के लिए जमे हुए किया जा सकता है. इसके अलावा, जाँच लें कि oocytes संक्रमित नहीं बन गए हैं और वहाँ एक अच्छा परिपक्वता की दर (> 50%) थी. संक्रमित oocytes खाद नहीं होगा. पहले गला लें महत्वपूर्ण रंजक (सामग्री) और 5 मिनट के लिए अधिकतम गति से स्पिन.
- विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों रंग oocyte व्यंजन और सेते 15 'के लिए कमाल उपयुक्त महत्वपूर्ण डाई (ओं) के साथ 80 μL जोड़कर. इस समय के दौरान, एक मेजबान महिला का चयन करें और संज्ञाहरण शुरू. एक मेंढक है कि धीरे धीरे अंडे है सामान्य रूप से या एक है कि हल्के निचोड़ के साथ प्रचुर मात्रा में अंडे का उत्पादन बिछाने चुनें. मेजबान से अंडे को अच्छी गुणवत्ता का होना चाहिए. महिलाओं है कि अंडे या कुचल अंडे के तार बिछाने कर रहे हैं से बचें.
- ताजा OCM का एक बड़ा पकवान, संक्षेप में ज़ुल्फ़ धोने और उन्हें सेट अलग से पहले हस्तांतरण रंग अंडे स्थानांतरण.
- एक बाँझ पाश्चर विंदुक तैयार के साथ एक बस पर्याप्त चौड़ी oocytes रोपाई में इस्तेमाल के लिए एक oocyte (~ 1.5 मिमी) को समायोजित बोर. एक हीरे की पेंसिल के साथ विंदुक कुल और सफाई तोड़ने. आग पॉलिश जब तक किनारों चिकनी रहे हैं, देखभाल लेने पिघला करने के लिए नहीं खोल बंद कर दिया.
5. Oocyte प्रत्यारोपण प्रदर्शन
- Oocyte प्रत्यारोपण एक ही शल्य चिकित्सा के रूप में मैं भाग में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करता है, हालांकि अंडाशय हटाने के बजाय, चालाकी oocytes एक विंदुक के साथ शरीर गुहा में पेश कर रहे हैं. आदर्श रूप में, हस्तांतरण की प्रक्रिया में संभव के रूप में के रूप में तेजी से किया जाना चाहिए और चीरा के आकार संभव के रूप में छोटे रूप में रखा जाना चाहिए.
- मेजबान महिला Anesthesize और शल्य चिकित्सा उपकरणों के रूप में भाग में वर्णित मैं बनाओ और चीरा के रूप में भाग में वर्णित मैं चीरा छोटा किया जा सकता है तैयार है, लेकिन काफी बड़े हस्तांतरण विंदुक (2A चित्रा) के बोर फिट की जरूरत है.
- Oocytes प्रत्यारोपण, समझ और संदंश के साथ मांसपेशियों और प्रावरणी एक प्रालंब तरक्की और प्रयोगात्मक का उपयोग पाश्चर विंदुक ऊपर तैयार oocytes परिचय. Oocytes के पकवान भंवर उन्हें केंद्र में इकट्ठा करने के लिए और संभव के रूप में कई के रूप में में चूसना. Oocytes विंदुक के अंत में बसने के लिए पेश किया जा रहा से अतिरिक्त तरल को रोकने और चीरा में पिपेट की नोक डालने और धीरे धीरे oocytes शरीर गुहा (चित्रा 2B) में मिलने के लिए अनुमति दें. दोहराएँ जब तक सभी oocytes स्थानांतरित कर दिया गया है. किसी भी समय मांसपेशी परत जारी, जब तक आप suturing शुरू कर दिया है, या oocytes चीरा के बाहर गिर जाएगा मत करो.
- एक बार oocytes स्थानांतरित कर दिया गया है, चीरा के संदंश के साथ दोनों पक्षों समझ और उन्हें एक साथ लाने, oocytes शरीर गुहा में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है. Suturing के रूप में वर्णित है, ख्याल रख रही मांसपेशियों और प्रावरणी पर उर्ध्व तनाव रखने के लिए जब तक पहली गाँठ बंधा हुआ है (चित्रा 2C) शुरू करो. यह से बाहर निष्कासित कर दिया जा रहा है oocytes रखने और चीरा के किनारों को समान रूप से चंगा करने के लिए अनुमति देगा. परत / मांसपेशी प्रावरणी में एक और सिवनी जोड़ें और तब त्वचा सीवन.
- विआयनीकृत जल के साथ बंद महिला कुल्ला और उसे एक वसूली ठंडा (18 डिग्री सेल्सियस) Amquel इलाज पानी से भरी बाल्टी में जगह. इसके बाद के संस्करण के रूप में मॉनिटर संज्ञाहरण से उसकी वसूली. वह अंडे ऑपरेशन के बाद सामान्य बिछाने शुरू करना चाहिए.
- Testes एक नर मेंढक सामान्य प्रक्रिया का उपयोग कर से प्राप्त करते हैं. OCM या l15 में testes स्टोर जब तक जरूरत है. हम ताजा वृषण पसंद करते हैं जब हस्तांतरण प्रयोगों fertilizing.
6. Oocytes की वसूली और इन विट्रो में निषेचन
- Peritoneal cilia हस्तांतरित अंडे (और मेजबान के सामान्य coelomic अंडे) शरीर गुहा के पूर्वकाल में oviducts के उद्घाटन के लिए ड्राइव करेंगे. रंगीन अंडे सामान्य निचोड़ द्वारा स्थानांतरण के बाद 2-3 घंटे शुरुआत बरामद किया जा सकता है है. अंडे या तो हर आधे घंटे प्राप्त किया जा सकता जब तक महिला बिछाने बंद हो जाता है.
- एक विशेष में खाद4 मिनट के लिए rm निलंबन (~ 4 एमएल 1x एमएमआर में). बाढ़ और 0.1x एमएमआर के साथ बड़े पैमाने पर कुल्ला. अंडे सामान्य सक्रिय और फोड़ना ~ निषेचन के बाद 1.5-2 बजे शुरू हो जाएगा चाहिए. हस्तांतरित अंडे अक्सर फोड़ना मेजबान अंडे की तुलना में थोड़ा बाद में करेंगे.
- अलग व्यंजन में सामान्य और सॉर्ट भ्रूण के रूप में सिस्टीन साथ जेली कोट निकालें. यह किसी भी स्तर पर किया जा सकता है, प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है. यह आमतौर पर 4 सेल मंच के चारों ओर विभिन्न रंगों और देर ब्लासटुला चरणों के दौरान सबसे मुश्किल की पहचान आसान है. साफ 0.1x एमएमआर में एक कम घनत्व (<मध्यम पकवान प्रति 50) संस्कृति पर अंडे. इस बिंदु से, भ्रूण और इलाज किया जा सकता है सामान्य रूप से छेड़छाड़.
- जानवर और सुविधा के लिए अगले कुछ दिनों में जटिलताओं के लिए मॉनिटर करने के लिए मेंढक लौटें.
- वैकल्पिक निषेचन की विधि, उच्च नमक बफर में अंडा बिछाने
- बाद मेंढक संज्ञाहरण से बरामद किया है, उसे ~ 1L उच्च नमक MMR (1.2x) में जगह है. महिला के बारे में 4-6 घंटे के लिए बफर में अंडे देना करने के लिए अनुमति दें. शेष अंडे निचोड़, 1.2x एमएमआर नाली और साफ डिश में रंगीन अंडे सॉर्ट, सभी संभव तरल निकालने.
- 0.3x एमएमआर के साथ बड़े पैमाने पर धो और 0.3x निलंबन / MMR शुक्राणु के कम से कम मात्रा में खाद जब तक अंडे सक्रिय (10 मिनट). 0.1x और ऊपर के रूप में एमएमआर संस्कृति के साथ बाढ़. यह विकल्प उपयोगी है अगर कई अंडे एक ही स्तर पर या अंडे के मैनुअल अभिव्यक्ति दाता oocytes नुकसान अगर जरूरत है.
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Discussion
एक सफल निषेचन और> oocytes की 50% (चित्रा 3) के सामान्य विपाटन हस्तांतरण में परिणाम होगा. हस्तांतरित oocytes के आम तौर पर बीच 30-60% neurula चरणों पिछले बच जाएगा. हम आम तौर पर 75-150 oocytes प्रति प्रायोगिक समूह (बगल में, RT-पीसीआर) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जो विश्लेषण के कई प्रकार के के लिए पर्याप्त भ्रूण निकलेगा phenotype visualizing हस्तांतरण. काफी अधिक oocytes दाखिल बहुत पैदावार बढ़ाने के प्रतीत नहीं होता. इसके अलावा, समूह प्रति कम से कम 30 oocytes गारंटी है कि कम से कम कुछ gastrulation के माध्यम से कर के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण रंगों आम तौर पर भ्रूण सांद्रता और यहाँ वर्णित शर्तों के तहत प्रभावित नहीं करते हैं, यद्यपि कुछ स्थितियों में रंजक प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है. शास्त्रीय, निष्पक्ष लाल phototoxic गुण है जब मजबूत टंगस्टन आधारित प्रकाश स्रोतों को उजागर सूचित किया गया है. हाल ही में, मीर और Heasman (2008) को सूचित किया है कि बिस्मार्क ब्राउन कुछ विषाक्त प्रभाव है अगर भ्रूण कम तापमान पर incubated कर सकते हैं. Oocytes जरूरत से ज्यादा नहीं मर रहा है और तापमान और रोशनी की चरम सीमाओं से बचने के रूप में बुनियादी सावधानियों महत्वपूर्ण डाई पक्ष प्रभाव की संभावना को खत्म करना चाहिए.
या विधि की सफलता और विफलता में सबसे बड़ी निर्धारकों दाता oocytes की गुणवत्ता और मेजबान महिला हैं. वहाँ है कि oocytes की एक विशेष बैच अच्छी तरह से खाद जाएगा निर्धारित करने के लिए कोई आसान तरीका है. Atretic oocytes की एक उच्च अनुपात के साथ अंडाशय से बचा जाना चाहिए. इसके अलावा, हम अंडाशय है कि भारी है vascularized के साथ गरीब सफलता पड़ा है, संभवतः यह दर्शाता है कि अवशोषण घटनेवाला है. Oocytes 18 ° के रूप में सी में संभव के रूप में ज्यादा रखा जाना चाहिए और अन्यथा स्वस्थ हालत में रखा के रूप में oocytes अगर संक्रमित या क्षतिग्रस्त खाद नहीं होगा. यह भी हमारी प्रयोगशाला में प्रकट होता है, कि बेहतर परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब defolliculator अधिक अनुभवी है और अलग करने और इंजेक्षन कर सकते हैं एक छोटी समय सीमा में oocytes की बड़ी संख्या है. इसी तरह, देखभाल स्वस्थ अंडे के साथ मेजबान का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए, हालांकि यह निश्चित है कि किसी दिए गए मेंढक एक अच्छा मेजबान कर देगा नहीं है. Defolliculating के साथ के रूप में, सर्जन के कौशल भी प्रक्रिया की सफलता पर असर पड़ेगा. मेजबान anesthesized है समय की लंबाई कम से कम कुशल वसूली और निषेचन के लिए महत्वपूर्ण लगता है.
विभिन्न प्रक्रियाओं की समग्र समय सफल oocyte हस्तांतरण प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य में, कम समय oocytes संस्कृति में रखा जाता है, बेहतर समग्र स्वास्थ्य और भ्रूण का निषेचन किया जाएगा. MRNA पछाड़ना antisense oligos का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, oocytes oligo इंजेक्शन के बाद कम से कम 24 घंटे सुसंस्कृत होना चाहिए और oligo के लक्ष्य mRNA कारोबार के अधिक से अधिक रिक्तीकरण के लिए अनुमति. इस प्रकार oocytes जितनी जल्दी हो सके defolliculated होना चाहिए और उसी दिन इंजेक्शन. सोमवार को oocyte अलगाव और इंजेक्शन, परिपक्वता और मंगलवार शाम को महिलाओं की उत्तेजना और बुधवार की सुबह हस्तांतरण द्वारा पीछा के साथ एक ठेठ प्रयोग शुरू हो सकता है. यदि लक्ष्य शाही सेना कारोबार धीमा है या वहाँ प्रचुर मात्रा में मातृ प्रोटीन है, संस्कृति की अवधि 48 या 72 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है है. हम जब oocytes प्रोजेस्टेरोन के साथ इलाज के 12 घंटे के भीतर स्थानांतरित कर रहे हैं सबसे अच्छी सफलता है. और अधिक परिपक्व oocytes खराब है और आम तौर पर खराब खाद लगते हैं. हम आम तौर पर प्रोजेस्टेरोन को जोड़ने के लिए और 12 घंटे के बारे में एचसीजी के साथ महिलाओं के हस्तांतरण के प्रदर्शन से पहले दोनों oocytes और मेंढ़कों ~ ° रातोंरात सी 18 पर रखा के साथ इंजेक्षन,.
हालांकि मेजबान हस्तांतरण विधि शुरू श्रम गहन है, बुनियादी आवश्यक कौशल अधिक कठिनाई के बिना हासिल किया जा सकता है. इस विधि के लिए सबसे आम का उपयोग करने के लिए कि विशिष्ट मातृ mRNAs का antisense oligonucleotide इंजेक्शन द्वारा समाप्त किया गया oocytes खाद है. MRNA overexpression या नशीली दवाओं के उपचार के रूप में अन्य जोड़तोड़ भी किया जा सकता है. ये अक्सर अलग परिणाम इंजेक्शन के कारण वृद्धि की अभिव्यक्ति या अंडे बनाम भ्रूण में अंतर समारोह निम्नलिखित निषेचन, के साथ तुलना कर सकते हैं. ई cadherin (. Heasman एट अल, 1991) overexpression और पराबैंगनी विकिरण (Holwill एट अल, 1987;. Elinson और Pasceri, 1989) दो दिलचस्प उदाहरण हैं. हमारी प्रयोगशाला से प्रारंभिक परिणाम भी सुझाव है कि transgenesis तरीकों का उपयोग इंजेक्शन इंटिग्रेस या meganucleases oocytes में और अधिक कुशलता के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं.
मेजबान हस्तांतरण तकनीक दोनों पूर्व और बाद निषेचन चरणों में प्रयोग की अनुमति देता है और इस प्रकार या भी Xenopus में निषेचन के बाद की घटनाओं पर पूरी तरह से देख कर अन्य जीवों में संभव नहीं अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. विकास और कठिनाई की लागत और रीढ़ में मातृ प्रभाव म्यूटेशनों पैदा में मातृ संकेत दे रास्ते के महत्व को देखते हुए, इस विधि का प्रारंभिक विकास की जांच में एक उपयोगी उपकरण रहने की संभावना है.
7. प्रतिनिधि रेsults
चित्रा 1. (ऊपर) अच्छे और बुरे संदंश (नीचे) के defolliculating उदाहरण के लिए.
चित्रा 2. संवर्धित oocytes के एक मेजबान महिला में स्थानांतरण (ए) एक छोटा सा चीरा मेजबान मेंढक के पेट के निचले हिस्से में बना है. मांसपेशी परत थोड़ा ऊपर उठाया है oocytes की शुरूआत की अनुमति. (बी) oocytes महत्वपूर्ण रंगे और चीरा के माध्यम से शरीर गुहा में रखा जाता है. (सी) मांसपेशी परत में प्रारंभिक सीवन के पूरा.
चित्रा 3. विभाजन के उदाहरण चरण 8 16 सेल में स्थानांतरित oocytes, जेली कोट के हटाने के बाद .
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोगों के आयोवा IACUC समिति के विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ह्यूस्टन प्रयोगशाला का धन्यवाद सदस्यों के लिए करना चाहते हैं. अनुसंधान द्वारा समर्थित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (GM083999) DWH सम्मानित किया है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and recipes: | |||
| OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996) | |||
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | Invitrogen | 11415-064 | |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | Sigma-Aldrich | A-9418-50g | |
| 1x Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P-0781 | |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |||
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |||
| 10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998) | |||
| 1M NaCl | |||
| 20 mM KCl | |||
| 20 mM CaCl2 | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 150 mM HEPES | |||
| adjust to pH 7.6-7.8 | |||
| Store at 4°C | |||
| Anesthetic solution | |||
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |||
| Dissolve in Amquel-treated water | |||
| Make fresh weekly | |||
| Progesterone stocks | |||
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol | |||
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution | |||
| Store at -20°C | |||
| Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991) | |||
| Blue: 0.1% Nile Blue A | Aldrich | 121479-5G | |
| Red: 0.25% Neutral Red | Sigma-Aldrich | N-6634 | |
| Brown: 1% Bismarck Brown | Sigma-Aldrich | B-2759 | |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |||
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |||
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |||
| Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C. | |||
References
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- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).
