Gödsling av Xenopus oocyter Med metoden Host Transfer

Summary

Förfarande för gödsling

Abstract

Studera bidrag maternellt nedärvd molekyler till ryggradsdjur tidiga utvecklingen är ofta hämmas av den tid och kostnad som krävs för att generera mödra-effekt muterade djur. Dessutom har många av de tekniker som överuttrycker eller hämma geners funktion i organismer som Xenopus och zebrafisk inte tillräckligt rikta kritiska moderns signalvägar, som Wnt signalering. I Xenopus kan manipulera geners funktion i odlade ägg och sedan befruktar dem lindra dessa problem till viss del. Oocyter är manuellt defolliculated från givare äggstock vävnad, injiceras eller behandlas i kultur som önskat, och då stimuleras med progesteron att framkalla mognad. Därefter är de oocyter förs in i kroppen hålighet i en ägglossning värd kvinnlig groda, varpå de kommer att bli flyttad till värdens äggledare och skaffa ändringar och gelé rockar som behövs för befruktning. Den resulterande embryona kan sedan höjas till den önskade scenen och analyseras för effekterna av eventuella experimentella störningar. Detta värd-överföringsmetod har varit mycket effektiv i att avslöja grundläggande mekanismer tidig utveckling och möjliggör ett brett spektrum av experimentella möjligheter inte finns i några andra ryggradsdjur modell organism.

Protocol

1. Kirurgiskt avlägsnande av Äggstock Tissue

1. Förbered ett nytt parti äggcell odlingssubstrat (OCM, material), mellan 400-800 ml beroende på storleken av försöket. Justera pH till 7,6-7,8, tills fenolrött blir en mörkröd färg (sex eller så små droppar av 5 N NaOH). Häll ut en liten summa för att kontrollera pH-värdet i en separat tub eftersom pH-elektroden kan förorena media. OCM ska förvaras vid 18 ° C och användas inom en vecka.
2. Välj 3-5 honor och placera en i ~ buffrad 2L bedövning lösning (material). Vi försöker undvika att använda grodor som matades samma dag eller före kirurgi. Medan grodan är att ge efter för narkos, desinficera kirurgiska området med 70% EtOH och förbereda kirurgiska instrument.
3. Sterilisera kirurgiska instrument med 20 sekunders nedsänkning i en varm pärla autoklav vid 250 ° C. Följande instrument ska vara på sidan: skalpell handtag (# 3) och blad (# 10 eller 11), flera par Dumont tång, Bonn iris sax (krökt eller rak), Halsey eller Olsen-Hegar mikro nål och suturer. Placera steriliserade instrument på en steril petriskål eller på insidan av sutur-paketet för att hålla steril. Ta tag i nålen i nål i önskad riktning innan du börjar. Vi föredrar Olsen-Hegar nål innehavare sedan handtaget innehåller sax knivar, som kan användas för att trimma suturer utan att växla instrument.
4. Efter 10 minuter, kontrollera att en kirurgisk plan av anestesi har uppnåtts. Sövda grodor slutar röra sig och kommer inte att svara på en tå nypa eller vara välte. Anestesi bör pågå 15 minuter, vilket är mer än tillräckligt med tid att utföra operationer. Don lämplig kirurgisk klädsel. Detta kan inkludera rena handskar (ej latex), rockar och munskydd, beroende på personliga preferenser och institutionell djur riktlinjer vård.
5. Anmärkning om aseptisk teknik: Frog huden sekret innehåller antimikrobiella peptider som generellt minska förekomsten av föroreningar i samband med kirurgi även om aseptisk teknik bör följas så mycket som möjligt. Uppdukningsmaterial kan användas, men kan inte krävas av institutionella IACUCs och kan inte ge mycket nytta. Generellt "tip teknik" som används, där det händer vidrör den sterila tips av instrumenten, suturmaterial och anskärning webbplats. Instrument kan omsteriliseras (i sträng autoklav) efter snitt i huden, och ett sterilt område bör bibehållas på bänk för att släppa instrument (t.ex. en petriskål eller sutur paketet). Institutionella krav kan skilja sig avsevärt, så följ din institutionernas riktlinjer och få lämplig undervisning innan du utför operationer.
6. Ta bort groda från narkos och placera i dorsala VILA på en fuktig kirurgisk torka. Anm. Huden kan rengöras genom sköljning i utspädd povidine jod (1:20) eller klorhexidin (0,75%). Undvik dock att kommersiella kirurgiska buskmarker, tvål och 70% isopropylalkohol, eftersom dessa kan skada den känsliga huden på amfibier.
7. Med hjälp av en skalpell eller en liten iris sax, göra en liten (1 - 1,5 cm) snitt i huden i den nedre delen av buken, laterala med mittlinjen. Efterföljande snitt på samma grodan ska utföras på alternerande sidor, väl placerade från varandra. Snitt kan göras antingen parallellt eller vinkelrätt mot mittlinjen.
8. Gör huden och buken snitt muskler i två steg. Efter att skära i huden, lyft muskellagret och omgivande vita-färgade fascia med pincett och gör snitt i upp muskeln. Använd saxen och klippa rakt ner, försöka göra ett snabbt klipp för att exponera kroppen hålighet lämnar rent sårkanterna. Om bara fascia klipps, kommer den tillbaka och kommer att göra suturering svårare. Lyft muskeln bidrar till att undvika oavsiktligt såra någon inre organ. Försök också att undvika att skära genom någon synlig lymfa hjärta eller blodkärl i muskeln lager. Förlänga med en sax i snittet så att äggstockarna kan enkelt dras igenom.
9. Äggstock bör vara väl synliga när snittet görs. Att upphandla äggstockarna, ta tag med pincett och YTTRE äggstocken vävnad. Den önskade mängden vävnad tas bort och putsas av vid nivån av kroppen väggen. Ta inte saker vävnaden tillbaka till coelomic hålighet, eftersom detta skulle kunna vara en källa till infektion eller andra komplikationer.
10. Omedelbart observera en liten bit av äggstocken under ett dissekera mikroskop och defolliculate några ägg för att testa deras kvalitet. De bör vara fast och enhetlig storlek och färg. Om de är acceptabla, ta bort önskad mängd äggstockarna vävnad och sutur snittet. Tillräckligt för att fylla en 90 mm petriskål är oftast tillräckligt för de flesta experiment. Om oocyter är av tvivelaktig kvalitet, suturer grodan och upprepa med en annan kvinna.
11. Stäng snittet av suturering muskel och fascia lagret först. Sätt in n eedle några millimeter i sidled till snittet, och se till att passera genom fascian lagret också. Suturer bara genom att muskeln får slita vävnad och lossnar. Använd pincett för att hjälpa in nålen underifrån på motsatt sida av snittet. Släpp och åter greppa nålen från utanför kroppen och dra suturen igenom tills flera inches eller så av svansen kvar, se till att inte dra den hela vägen.
12. Stäng såret med en avbruten enkla mönster av suturering. Vi använder oss av en grundläggande rättsakt slips för att göra kirurgens torg knop (rev knop). Loop den långa änden av sutur runt nål, ta tag i svansen och dra den genom öglan mot dig och dra åt. Loop och dra igenom igen, denna gång dra nålen innehavaren bort från dig. En tredje kast kan användas för extra säkerhet (i samma riktning som den första). Trimma suturer och lämnar kort svans och göra en annan sutur i muskeln några millimeter bort. Två suturer är tillräckliga för små suturer, tre för större mängder. Upprepa för huden skikt. Videodemonstrationer grundläggande suturering tekniken finns på YouTube - sök "instrument tie", det finns en hel del att välja mellan, även om den grundläggande tekniken är densamma.
13. Skölj av de kvinnliga med avjoniserat vatten och placera henne i en återhämtning hink fylld med kallt (18 ° C) vatten. Även i labbet, är grodor förvaras i kranvatten behandlas med Amquel att ta bort kloramin. Varje par minuter, lyft försiktigt grodan ur vattnet och leta efter gulping eller ögon-svällande rörelser, tecken på återhämtning från anestesi.
14. OBS: Survival operation inte är absolut nödvändigt för att få äggstockarna vävnad, även honorna kommer att fortsätta att producera bra ägg efter ett antal operationer. Utföra överlevnad operation kommer också att skära ned på antalet djur som används. Var noga med att följa din djurskötsel enhetens riktlinjer på ryggradsdjur metoder överlevnad operation, postoperativ vård och övervakning och för antalet tillåtna operationer på en individ.

2. Odling och Defolliculating oocyter

1. Direkt efter operationen är klar, dela äggstocken i små bitar (~ 2 cm ²⁾ och förvara i färska OCM, med 5-6 stycken per 90 mm ​​maträtt. Individuell lober äggstockarna skärs öppna, planat ut och skär i fyrkantiga bitar. Dessa sköljas i rent OCM och placeras i rätter för kultur. Plattas ut och dela upp äggstockarna kommer att utvidga sina liv i kulturen och göra defolliculation lättare.
2. Flytta en lob till ett litet fat med EKR och manuellt defolliculate 300-500 ägg. Överför oocyter med en steril, brand-polerad pipett. Vi har funnit att genom att använda bomull ansluten sorten är avgörande för att minimera förorening av kulturer. Förvara oocyter vid 18 ° C i 8 ml OCM (i medium rätter (Falcon 1007)) i grupper på 100-150. Med övning bör du kunna defolliculate tillräckligt äggceller i 1-2 timmar. Collagenased oocyter är inte lämpliga för värd överlåtelse eftersom de inte kan fertilizable.
3. Defolliculating metod. Vi defolliculate med urmakare "pincett (Dumont # 4s eller # 5s, Fine Science Tools), efter den grundläggande metoder som beskrivs i Smith et al. (1991). Använda en pincett (i din dominanta hand), ta tag i teka bindväv skikt kring en fullvuxen äggcell stadium VI nära där follikeln sitter på äggstocken (stjälken). Med andra pincett, ta tag i äggstocken anslutning till det första paret. Lätt Riv upp follikeln lagret genom att dra över äggcellen. Försiktigt retas ägget ur vävnad. Framgångsrikt defolliculated oocyter är floppier än oocyter bara drog utan att ta bort follikeln lagret och kommer att sakna synliga blodkärl.
4. OBS: Det är viktigt att behålla mycket lätt tryck på tips av pincett, knappt nog för tips för att träffas. Gripande för hårt är ett vanligt bland nybörjare och kommer att resultera i äggcellen dras bort med follikeln intakt. Ha en bra pincett exklusivt för defolliculating. Tipsen bör uppfylla exakt och bör vara något trubbigare än pincett för att göra explants från Xenopus embryon (Figur 1).
5. Vi testar rutinmässigt mogna ca 20 med progesteron och avbryta experimentet om mognad räntan är låg (<50% efter 6-7 timmar i rumstemperatur).
6. Vid denna punkt kan oocyter manipuleras och odlade som önskat, såsom mikroinjektion av oligo, morpholino eller mRNA. Injektion förfaranden variera per lab, så vi kommer inte beskriva dem här. Oocyter kan pågå upp till en vecka i OCM, men i allmänhet hälsa minskar så det är bäst att använda dem för överföring inom 96 timmar efter isolering.
7. Tänk på att endast fem till sex grupper (inklusive kontroll) kan överföras till en enda hona, på grund av begränsningar av vitala färgämnen, så planera dina experiment därefter.

"> 3. Oocyte Mognad och stimulans av Prospective Host Tikar

1. Om du utför en räddning av oligo ozonlagret, injicera mRNA (vanligtvis 50-300 pg av RNA) ~ 24-48 timmar efter den oligo. Den oligos kommer att ha skadats av denna tid och bör inte påverka den injicerade RNA.
2. På kvällen innan du utför överföringen, tillsätt 16 mikroliter av progesteron arbetslösning (1 mm i EtOH) till äggceller i 8 ml OCM i medium rätter (slutlig progesteron koncentration är ~ 2 M). Inkubera 10-12 timmar vid 18 ° C för att möjliggöra äggcellen mognad.
3. Spruta 3-5 honor med 1000 enheter per groda av hCG för att inducera äggläggning. Våra experiment verkar fungera bättre om äggcellen mognad och hCG-injektionen sker ungefär samtidigt, ca 12 timmar före implantering i värden (t.ex. 22:00 -10 AM). Lämna honor vid RT eller 18 ° C över natten.

4. Upprättande och Vital Dye Infärgning av oocyter

1. På morgonen av överföringen låta ~ 45-60 "att ställa upp och utföra förfarandet. Vid denna punkt kan mogna ägg frysas för senare analys av effekten av mRNA ÖVERVÄLDIGANDE eller protein uttryck. Kontrollera också att ägg inte har blivit infekterade och att det var en bra mognad takt (> 50%). Infekterade oocyter kommer inte att befrukta. Tina viktiga färgämnen (material) och snurra på max hastighet i 5 minuter.
2. Färg de olika experimentella grupper genom att lägga till 80 mikroliter av lämplig vitala färgämnet (s) till äggcellen rätter och inkubera med gungande i 15 ". Under denna tid kan du välja en värd kvinnlig och börja anestesi. Välj en groda som sakta lägger ägg normalt eller en som producerar rikligt ägg med lätt pressas ut. Ägg från värden bör vara av god kvalitet. Undvik att honor som lägger strängar av ägg eller krossade ägg.
3. Överför färgade ägg till ett stort fat med färska OCM, snurra kortfattat att tvätta och ställ dem åt sidan innan de överförs.
4. Förbered en steril pasteurpipett med ett hål precis stort nog att rymma en äggcell (~ 1,5 mm) för användning i transplantera de oocyter. Betyg pipetten med en diamant penna och bryts. Brand polera tills kanterna är släta, noga med att inte smälta öppningen.

5. Utföra Oocyte Transplantation

1. Äggcellen transplantation använder samma kirurgiska ingrepp som beskrivs i del I, men istället för att ta bort äggstockarna, manipuleras ägg förs in i kroppen hålighet med en pipett. Helst bör förfarandet för överföringen skall utföras så snabbt som möjligt och storleken på snittet bör hållas så liten som möjligt.
2. Anesthesize värd kvinnliga och förbereda kirurgiska instrument som beskrivs i del I. Ringa och snitt som beskrivs i del I. Snittet kan vara mindre, men måste vara stor nog att passa hålet i överföringspipetten (Figur 2A).
3. Att transplantera ägg, förstå och lyfta en flik av muskler och fascia med pincett och införa den experimentella oocyter med pasteurpipett förberedda ovan. Snurra fat oocyter för att samla dem i centrum och suga upp så många som möjligt. Låt oocyter att bosätta sig i slutet av pipetten för att förhindra överflödig vätska förs och för in spetsen på pipetten i snittet och långsamt låta oocyter att sippra in i kroppen hålighet (Figur 2B). Upprepa tills alla ägg har överförts. Släpp inte muskellagret som helst, tills du har börjat suturering, eller oocyter kommer att sprida ut ur snittet.
4. När ägg har överförts, ta tag båda sidor av snittet med pincett och föra dem samman, vilket gör att oocyter att bosätta sig i kroppen hålighet. Börja suturering som beskrivs noga med att hålla upp spänningen på muskel och fascia tills den första knut är bunden (figur 2C). Detta håller ägg från att bli utvisade ut och gör kanterna på snittet att läka jämnt. Lägg till ytterligare en sutur i muskeln / fascia lager och därefter sutur i huden.
5. Skölj av de kvinnliga med avjoniserat vatten och placera henne i en återhämtning hink fylld med kyld (18 ° C) Amquel-behandlat vatten. Övervaka hennes återhämtning från anestesi enligt ovan. Hon ska börja lägga ägg normalt efter operationen.
6. Skaffa testiklar från en manlig groda med normala förfaranden. Förvara testiklarna i OCM eller L15 tills det behövs. Vi föredrar färska testiklarna när gödsling överföra experiment.

6. Återvinning av äggceller och provrörsbefruktning

1. Peritoneal Cilia kommer att driva de överförda ägg (och normal coelomic ägg i den mottagande) till öppningar i äggledarna i den främre av kroppen hålighet. Färgade ägg kan återvinnas början 2-3 timmar efter bytet av normal klämma. Ägg kan erhållas varje halvtimme eller så tills det kvinnliga slutar om.
2. Gödsla i ett sperm fjädring (i ~ 4 ml 1x MPR) i 4 minuter. Flood och skölj mycket med 0,1 x MMR. Ägg ska aktiveras normalt och kommer att börja klyva ~ 1,5-2 timmar efter befruktningen. Överfört ägg kommer ofta hålla sig något senare än värd ägg.
3. Ta bort gelé rockar med cystein som vanligt och sortera embryon i olika rätter. Detta kan göras när som helst, beroende på vilka behov av försöket. Det enklaste oftast att identifiera olika färger runt 4-cells scenen och svåraste under sen blastula stadier. Kultur äggen på en låg densitet (<50 per medelstora maträtt) i rena 0,1 x MMR. Från denna punkt kan embryon behandlas och manipuleras normalt.
4. Återgå grodorna att djuret anläggningen och övervaka för komplikationer under de närmaste dagarna.
5. Alternativa befruktning metoden, äggläggande i hög salt-buffert
   1. När grodan har återhämtat sig från anestesi, placera henne i ~ 1L hög salt MMR (1,2 x). Låt honan att lägga ägg i bufferten i ca 4-6 timmar. Pressa resterande ägg ut avloppet 1.2x MMR och sorterar färgade ägg i ren skål, ta bort alla möjliga vätska.
   2. Tvätta mycket med 0.3x MPR och gödsla i minimal volym 0.3x MMR / spermier avstängning till dess ägg aktivera (10 minuter). Flood med 0,1 x MMR och kultur som ovan. Det här alternativet är användbart om många ägg behövs på samma scen eller om manuell uttryck ägg skadar givaren oocyter.

Discussion

En lyckad överlåtelse kommer att resultera i befruktning och normala klyvning av> 50% av oocyter (Figur 3). Allmänhet mellan 30-60% av de överförda oocyter kommer att överleva förbi neurula steg. Vi överför brukar 75-150 ägg per experimentell grupp, som kommer att ge tillräckligt embryon för flera typer av analyser (in situ, RT-PCR) samt visualisera fenotyp. Implantation betydligt mer oocyter verkar inte kraftigt öka avkastningen. Dessutom bör minst 30 ägg per grupp överföras för att garantera att åtminstone några göra det genom gastrulation. Den vitala färgämnen i allmänhet inte påverkar embryon i de koncentrationer och villkor som beskrivs här, även om färgämnen kan ha negativa effekter i vissa situationer. Klassiskt har Neutral Red rapporterats ha fototoxisk egenskaper när det utsätts för starka volfram baserat ljuskällor. På senare tid har Mir och Heasman (2008) rapporterade att Bismarck Brown kan ha vissa toxiska effekter om de embryon inkuberas vid låga temperaturer. Grundläggande försiktighetsåtgärder som att inte alltför döende på ägg och undvika extrema temperaturer och belysning ska eliminera möjligheten av vitala färgämnet biverkningar.

Den största faktorerna för framgång eller misslyckande av metoden är kvaliteten av givaren äggceller och den mottagande kvinnan. Det finns ingen idiotsäker metod för att avgöra om en viss sats av oocyter befruktar bra. Äggstock med en hög andel atretic oocyter bör undvikas. Dessutom har vi haft dålig framgång med äggstocken som är mycket vaskulariserad, kanske tyder på att nedbrytningen sker. Oocyter bör hållas vid 18 ° C så mycket som möjligt och i övrigt hålls i friska skick ägg inte kommer att befrukta om infekterade eller skadade. Det visas också i vårt labb, att bättre resultat nås när defolliculator är mer erfarna och kan isolera och injicera ett stort antal ägg i en kort tid. Likaså bör man välja värdar med friska ägg, men det är aldrig säkert att en viss groda kommer att göra en god värd. Som med defolliculating har skickligheten hos kirurgen också en betydelse för framgången av förfarandet. Minimera den tid värden är anesthesized verkar avgörande för en effektiv återhämtning och gödsling.

Den övergripande tidsplanen för de olika förfarandena är avgörande för framgångsrika experiment äggcellen överföring. I allmänhet är kortare tid ägg förvaras i kulturen, desto bättre övergripande gödsling och hälsa embryon kommer att bli. För experiment mRNA ÖVERVÄLDIGANDE med antisense oligos bör oocyter odlas minst 24 timmar efter oligo injektionen för att möjliggöra maximal utarmning av målet mRNA och omsättning oligo. Således oocyter bör defolliculated så snart som möjligt och injiceras samma dag. En typisk experiment kan börja på måndag med äggcell isolering och injektion, följt av mognad och stimulering av kvinnor på tisdag kväll, och överföra på onsdag morgon. Om målet RNA omsättningen är långsam eller finns det rikligt med moderns protein, kan kulturen period förlängas till 48 eller ens 72 timmar. Vi har de bästa framgång när oocyter överförs inom 12 timmar efter behandling med progesteron. Över-mogna äggceller börja att försämras och allmänhet befrukta dåligt. Vi lägger generellt progesteron och injicera honor med hCG ca 12 timmar innan du utför överföringen, med både äggceller och grodor hålls vid ~ 18 ° C över natten.

Även om host-överföringsmetod är arbetskraftsintensiv början kan de grundläggande kunskaper som krävs kan förvärvas utan större svårigheter. Den vanligaste användningen för denna metod är att befrukta ägg som var utarmat av specifika maternella mRNA genom att antisense oligonukleotid injektion. Andra manipulationer såsom mRNA överuttryck eller läkemedelsbehandling kan också göras. Dessa kan ofta ha olika resultat jämfört med injektion efter befruktningen, på grund av ökat uttryck eller differentiell funktion i ägg kontra embryon. E-cadherin överuttryck (. Heasman et al, 1991) och ultraviolett strålning (Holwill et al, 1987;. Elinson och Pasceri, 1989) är två intressanta exempel. Preliminära resultat från våra labb tyder också på att genmodifiering metoder med injicerade integrashämmare eller meganucleases kan arbeta mer effektivt i ägg också.

Värden överföra tekniken tillåter experiment på både före och efter gödsling stadier och därmed kan ge insikter inte är möjligt i andra organismer eller till och med genom att titta enbart på efter befruktningen händelser i Xenopus. Med tanke på betydelsen av moderns signalvägar i utveckling och svårigheter och kostnader för att generera moderns effekt mutationer i ryggradsdjur, är denna metod sannolikt att förbli ett användbart verktyg i utredningen av tidiga utveckling.

7. Representant Resultat

Figur 1. Exempel på bra (överst) och dåliga (nederst) peang för defolliculating.

Figur 2. Överföring av odlade ägg i en mängd kvinnor. (A) ett litet snitt görs i nedre delen av magen i den mottagande grodan. Muskeln skiktet är förhöjda något för att möjliggöra införandet av oocyter. (B) ägg är viktiga färgade och placeras i kroppen hålrum genom snittet. (C) slutförandet av den inledande sutur i muskeln skiktet.

Figur 3. Exempel på uppdelning, överförs äggceller vid 8-16-cell stadium efter borttagning av gelé rockar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	Invitrogen	11415-064
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1x Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P-0781
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl2
10 mM MgCl2
150 mM HEPES
adjust to pH 7.6-7.8
Store at 4°C
Anesthetic solution
1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A-5040
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly
Progesterone stocks
10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol
Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution
Store at -20°C
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
Blue: 0.1% Nile Blue A	Aldrich	121479-5G
Red: 0.25% Neutral Red	Sigma-Aldrich	N-6634
Brown: 1% Bismarck Brown	Sigma-Aldrich	B-2759
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.