の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Summary

施肥のための手順

Abstract

初期の開発を脊椎動物に母性遺伝の分子の寄与を研究することは、しばしば時間と母性効果変異動物を生成するために必要な費用によって妨げられている。さらに、例えば、 アフリカツメガエルやゼブラフィッシュなどの生物の遺伝子機能を過剰発現または抑制する手法の多くは、十分にそのようなWntシグナル伝達などの重要な母体のシグナル伝達経路を標的に失敗する。 アフリカツメガエルでは、培養卵母細胞での遺伝子機能を操作し、その後それらを肥やすことはある程度までこれらの問題を改善することができます。卵母細胞は、手動で、ドナーの卵巣の組織からdefolliculated必要に応じて注射したり、文化の中で処理し、成熟を誘導するためにプロゲステロンによって刺激されています。それらはホストの卵管を通じて転と変更し、受精に必要なゼリーのコートを取得される、すると次に、卵母細胞は、排卵ホスト女性のカエルの体腔内に導入されています。結果として得られる胚は、その後、目的のステージに上げ、あらゆる実験的摂動の影響について分析することができる。このホストベースの転送方式は、初期の開発の基本的なメカニズムを暴くのに非常に有効であったと他の脊椎動物のモデル生物では利用できない実験的な幅広い可能性を可能にしました。

Protocol

1。卵巣組織の外科的切除

1. 実験のサイズに応じて400〜800 mLの間で、、卵母細胞の培養液の新鮮なバッチ（材料OCM）を準備する。フェノールレッドは濃い赤色（5N NaOHを6または非常に小さい滴）に変わるまで、7.6から7.8にpHを調整する。 pH電極は、メディアを汚染する可能性があるため、別々のチューブにpHをチェックするために少量を注ぐ。 OCMは、18℃で保存し、一週間以内に使用する必要があります。
2. 〜2Lバッファ麻酔液（材料）3〜5人の女性と場所いずれかを選択します。我々は、当日または手術前に飼育したカエルを使用しないようにしてください。カエルは麻酔薬に屈している間に、70％EtOHで外科領域を消毒し、手術器具を準備。
3. 250℃でホットビーズ滅菌器で20秒浸漬することにより手術器具を滅菌℃に以下の楽器は手にしてください：メスハンドル（＃3）とブレード（＃10または11）、デュモン鉗子、ボンアイリスハサミ（カーブまたは直線）、ハルゼーやオルセン-ヘーガルマイクロニードルホルダー、及び縫合糸のいくつかのペア。滅菌ペトリ皿上または無菌に保つために縫合糸パッケージの内側に滅菌器具を置きます。開始する前に所望の配向でニードルホルダーの針をつかみます。ハンドルがスイッチング楽器なしで縫合糸をトリムするために使用できるはさみブレードを、含んでいるため私たちは、オルセン-ヘーガル針ホルダーを好む。
4. 10分後、麻酔の外科的平面が達成されていることを確認してください。麻酔カエルが移動停止し、つま先のピンチに反応しないときや引っくり返されている。麻酔は、操作を実行するのに十分な時間を超えている15分を、持続させるべき。ドン適切な外科的な服装。これは個人的な好みと動物実験のガイドラインに応じて、清潔な手袋（非ラテックス）、研究室コート、そして外科用マスクを含めることができます。
5. 無菌操作に関する注意：カエルの皮膚の分泌物は無菌操作が可能な限り続けて実行する必要がありますが、一般的に、手術中に汚染の発生率を減少させる抗菌ペプチドが含まれています。外科用ドレープを使用することができますが、制度的IACUCsが必要とされないことがあり、多くのメリットが得られないことがあります。手は楽器、縫合材料または切開部位の無菌先端に触れないでください使用される一般的に"先端技術"、。楽器は、楽器を（そのようなペトリ皿や縫合糸のパッケージなど）を置くためのベンチ上に維持されるべきである（ビーズ滅菌器で）皮膚の以下の切開、及び無菌区域をresterilizedすることができます。制度的要件が大幅に異なる可能性があるので、あなたの機関のガイドラインに従ってくださいと前に行う手術に適切な命令を受ける。
6. 麻酔からカエルとワイプ湿った手術で背側横臥位の場所を削除します。注意してください。皮膚は、希釈povidineのヨウ素（1:20）またはクロルヘキシジン（0.75％）で洗浄によって洗浄することができます。しかし、これらは両生類のデリケートな肌を傷つけるので、商業的な外科手術スクラブ、石鹸、70％イソプロピルアルコールを避ける。
7. 正中線の外側腹部、下部の皮膚に切開 - メスまたは小さなアイリスのはさみを使用して、小さな（1.5 CM 1）を作る。同じカエルの後続の切開は、よく互いに間隔をおいて、別の側面で実行する必要があります。切開は正中線に平行または垂直にすることができます。
8. 二段階の皮膚と腹部筋肉の切開を行います。皮膚をカットした後、筋層と鉗子との周囲の白い色の筋膜を持ち上げて育った筋肉の切開を行います。はさみを使用して、一迅速なカットがきれいな傷のエッジを残して体腔を公開するようにしようとすると、まっすぐ下にカット。ちょうど筋膜が切断された場合、それはリトラクトされると、より困難に縫合することになります。筋肉を持ち上げると、誤ってすべての内部の臓器を傷つける防ぐことができます。また、筋層内の任意の目に見えるリンパ心臓や血管を切断しないようにしてください。その卵巣が容易に通過プルできるように切開のハサミで長さを延長する。
9. 切開が行われた後卵巣がはっきりと見えるはずです。卵巣を調達するために、鉗子でつかんで、卵巣の組織を外部化。組織の所望の量が削除され、体壁のレベルでオフにトリミングされます。これは感染症や他の合併症の原因となっている可能性として、体腔空洞に戻すティッシュを詰め込むしないでください。
10. すぐに解剖顕微鏡下で卵巣の小片を観察し、その品質をテストするためにいくつかの卵母細胞をdefolliculate。彼らはしっかりと均一な大きさと配色のはずです。彼らが許容される場合、卵巣組織の所望の量を削除し、切開して縫合。 90ミリメートルのシャーレを満たすのに十分では通常、ほとんどの実験で十分です。卵母細胞は疑わしい品質のものである場合には、カエルを縫合し、別の女性と繰り返す。
11. 第一筋肉や筋膜層を縫合で切開を閉じます。 nを挿入だけでなく、筋膜の層を通過することを確認しながら、切開の外側数ミリをeedle。ちょうど筋肉を通して縫合糸は、組織の涙と緩むことがあります。切開の反対側に下から針を挿入するための鉗子を使用してください。放すとを介してすべての方法を引っ張らないように注意しながら、身体の外から針を再度把握し、尾のままの数インチかそこらになるまでを通して縫合糸を引き出します。
12. 縫合のシンプルな中断パターンで傷口を閉じてください。我々は外科医の正方形の結び目（サンゴ礁の結び目）を作るために基本的な楽器のネクタイを使用してください。ループ針ホルダーの周り縫合糸の長い方の端は、尾をつかんで手前ループを介してプルして締めます。ループして、もう一度を通じてプル、この時間はあなたから離れニードルホルダーを引き出します。第三投（最初と同じ方向で）セキュリティを強化するために使用することができます。短い尾を残して、縫合糸をトリミングし、離れて筋肉に数ミリメートルを別の縫合を行います。二つの縫合糸は、小さな縫合には十分ですが、大きいものは3つの。スキン層に対して、この手順を繰り返します。基本的な縫合テクニックのビデオのデモは、YouTube上で利用可能です - "楽器のネクタイ"を検索し、基本的なテクニックは同じですが、あるから選択にかなりの数。
13. 脱イオン水でメスを洗い流すとクール（18 ° C）水で満たされた回復のバケツに彼女を置く。ラボにいる間、カエルはクロラミンを除去するAmquelで処理水道水に保持されます。数分ごとに、静かに水からカエルを持ち上げ、桂平または麻酔からの回復を示す目に隆起運動、を探します。
14. 注：女性は、操作の数の後に良い卵を生産し続けるだろうが、サバイバル手術は、卵巣の組織を得るために必ずしも必要ではありません。生存の手術を実行すると、また使用される動物の数を削減します。脊椎動物の生存の手術方法、術後ケアとモニタリングをし、個々で許容される手術の数については、動物のケアユニットのガイドラインに従ってください。

2。培養とDefolliculating卵母細胞

1. 手術終了直後は、90 mm ​​ディッシュあたり5〜6個を使用して、小さな断片（〜2 cm ^2）を、新鮮なOCMのストアに卵巣を分割します。卵巣の個々の葉は、オープンカットフラット化し、正方形の小片に切断されています。これらは、クリーンなOCMで洗浄し、培養用の皿に置かれます。フラット化と卵巣を割ると文化の中で、その寿命を延長し、defolliculationが容易になります。
2. OCMの小さな皿に葉を移動し、手動で300から500卵母細胞をdefolliculate。滅菌、ファイアーポリッシュピペットを用いて卵母細胞を移す。私たちは、綿栓した品種を使用すると、文化の汚染を最小限に抑えるために不可欠であることを発見した。 18で卵を保管° 100から150までのグループで8 mLのOCMのC（培地皿（ファルコン1007）で）。練習すれば、あなたは1-2時間で十分な卵母細胞をdefolliculateすることができるはずです。彼らは受精可能になるされていないので、Collagenased卵母細胞は、ホストの転送には適していません。
3. 方法をDefolliculating。私たちは、スミスらに説明した基本的な方法は、次の時計製作の鉗子（ファイン科学のツール、5Sデュモン＃4Sまたは＃）、、（1991）を使用してdefolliculate。鉗子の一組を（あなたの利き手で）を使用して、卵胞が卵巣（茎）に接続されている場所の近くに完全に成長した段階VIの卵母細胞を囲む卵胞膜結合組織の層を把握する。鉗子の他のペアで、最初のペアに隣接して卵巣を把握する。軽く卵母細胞全体に引いて、卵胞のレイヤーを開いて引き裂く。ゆっくりと組織の外卵母細胞をいじめる。成功defolliculated卵母細胞は卵母細胞は、単に卵胞の層を除去せずにオフ引っ張らと目に見える血管を欠いているとなるよりもfloppierです。
4. 注：満たすためのヒントについては、ぎりぎり、鉗子の先端に非常に軽い圧力を維持するために不可欠です。きつく引っ張ると初心者の間で共通であり、そのまま卵胞で引っ張られている卵母細胞になります。 defolliculating専用に鉗子の良いペアをしてください。ヒントは、正確に満たす必要がありますし、 アフリカツメガエルの胚（図1）からの外植片を作るための鉗子より少しblunterでなければなりません。
5. プロゲステロンと中止実験で約20成熟率が悪い場合我々は日常的に成熟した試験（室温で6-7時間後に<50％）。
6. この時点で、卵母細胞は、オリゴ、モルホリノまたはmRNAのマイクロインジェクションのように、操作し、必要に応じて培養することができる。注射の手順は、実験室ごとに異なりますので、ここでそれらについて説明しません。卵母細胞は、OCMの週まで維持されますが、それは分離の96時間以内に移転のためにそれらを使用するのが最適ですので、一般的に健康状態が低下することができます。
7. わずか5〜6グループ（対照を含む）の重要な染料の制限に起因し、単一の女性に転送することができることに留意してください、それに応じて実験を計画しています。

"> 3。卵成熟が望まれるホストの女性の刺激

1. オリゴの枯渇の救助を行う場合、〜24〜48時間オリゴ後にmRNAを（通常はRNAの50から300 PG）注入する。オリゴは、この時点で劣化しているだろうと注入されたRNAには影響を与えません。
2. 前の転送を実行するために夕方に、培地中皿で8 mLのOCM（最後のプロゲステロン濃度は〜2μmである）の卵母細胞にプロゲステロンワーキング溶液16μL（エタノールさ1mm）を追加します。卵成熟を可能にするために18で10〜12時間℃でインキュベートする。
3. 産卵を誘発するためにhCGのカエルあたり1000台で3〜5人の女性を注入する。我々の実験では、卵母細胞の成熟とhCG注射が同時期に行われている場合は、ホスト（例えば、午後10時-10 AM）に、移植前に約12時間、よりよく動作するようです。 RTまたは18℃で一晩の女性にしておきます。

4。準備と卵母細胞の生体染色色素の染色

1. 転送の朝に、〜45から60"が設定して手順を実行することができます。この時点で、成熟した卵母細胞は、mRNAのノックダウンまたはタンパク質の発現の効果を後で分析するために凍結することができます。また、卵母細胞が感染すると良好な成熟率が（> 50％）があったことをしていないことを確認してください。感染した卵母細胞は、受精させることはありません。重要な染料を（材料）解凍し、5分間最大速度で回転する。
2. 15'のために揺動し、卵母細胞の料理とインキュベートするための適切な生体染色色素（S）80μLを添加することにより、色別の実験群を。この時間の間に、ホストの女性を選択して、麻酔を開始します。徐々に正常または軽度の絞りと豊富な卵を作り出すものの卵を産卵されたカエルを選択してください。ホストからの卵は良い品質でなければならない。卵や砕いた卵の文字列を敷設している女性を避けてください。
3. 新鮮なOCMの大皿、洗って、転送する前にそれらを取っておくために簡単に渦に着色された卵を移す。
4. 卵母細胞を移植に使用する卵母細胞を（〜1.5 mm）を収容するのに十分なだけの広口径で滅菌パスツールピペットを準備します。ダイヤモンド鉛筆でピペットのスコアを獲得し、きれいに壊れる。エッジが滑らかになるまでの開口部が閉じられて溶かすように注意しながら、研磨を発射。

5。卵母細胞の移植を実行する

1. 私はパートで説明されているようではなく、卵巣を除去すると、操作卵母細胞をピペットで体腔内に導入されているものの、卵母細胞の移植は、同じ外科的処置を使用しています。理想的には、転送手順は、可能な限り迅速に実施すべきであると切開の大きさはできるだけ小さくすべきです。
2. パートで説明したようにI.メイクと切開ホスト女性をAnesthesize、パートで説明したように手術器具を準備I.切開は小さくなるが、転送ピペット（図2A）の内径に合わせて十分な大きさである必要があることができる。
3. 卵母細胞を移植する、把握及び昇格筋肉や筋膜のいずれかのフラップを鉗子でと上記で調製したパスツールピペットを用いて実験的な卵母細胞を導入する。渦巻卵母細胞の皿が中心にそれらを収集し、できるだけ多くとして吸うように。導入されてから余分な液体を防止し、切開にピペットの先端を挿入し、徐々に卵母細胞は、体の空洞（図2B）にトリクル充電にできるように卵母細胞がピペットの先端に解決することができます。すべての卵母細胞が転送されるまで繰り返します。あなたが縫合し始めている、または卵母細胞は切開からこぼれするまで、いつでも、筋層を解放しないでください。
4. 卵母細胞が転送された後、鉗子で切開の両側をつかみ、それらを一堂に、卵母細胞が体腔内に定着できるようになります。第一結び目が（図2C）結ばれるまで、筋肉や筋膜に上向きのテンションを保つように注意しながら、説明するように縫合を開始。これは、外追放されてから卵母細胞に保持され、切開の縁が均等に癒すことができます。筋肉/筋膜層内の別の縫合を追加してから、皮膚を縫合。
5. 脱イオン水でメスを洗い流すと冷却（18℃）Amquel処理水で満たされた回復のバケツに彼女を置く。上記のように麻酔からの彼女の回復を監視します。彼女は手術後、通常、産卵を開始する必要があります。
6. 通常のプロシージャを使用して、男性のカエルから精巣を取得します。必要になるまでOCMまたはL15で睾丸を保管してください。転送実験を受精するときに我々は、新鮮な精巣を好む。

6。卵子と体外受精の回復

1. 腹膜繊毛は、体腔の前で卵管の開口部に転送卵を（とホストの通常の体腔卵）駆動します。着色された卵は、通常の圧搾することにより、転送後の2-3時間を開始する回復することができます。メスは産卵が停止するまで卵は30分ごとかそこらを取得することができます。
2. SPEで受精させる4分間のrmサスペンション（〜4 mlの1X MMRで）。洪水と0.1 × MMRで広範囲にすすいでください。卵は通常、有効化する必要がありますし、受精後に開裂〜1.5〜2時間に開始されます。転送された卵は、少し後のホストの卵よりも頻繁に切断するでしょう。
3. 別の皿に普通のと並べ替えの胚のようなシステインとゼリーのコートを取り除く。これは、実験のニーズに応じて、どの段階でも行うことができます。後期胞胚段階で様々な4細胞期の周りの色と最も困難を識別するために、それは通常、最も簡単。文化クリーン0.1X MMRで低密度（培地シャーレあたり<50）で卵。この点から、胚が扱われ、正常に操作することができます。
4. 今後数日間にわたって合併症のための動物施設とモニターにカエルを返します。
5. 代替の施肥法、高塩バッファーで産卵
   1. カエルは麻酔から回復した後は、〜1L高塩MMR（1.2倍）に彼女を置く。女性は約4-6時間のためにバッファに卵を産むことができます。 1.2倍MMRを排出し、きれいな皿に色の卵を並べ、残りの卵をしごき出し、すべての可能な液体を取り除く。
   2. 0.3X MMRで広範囲に洗浄し、卵が（10分）アクティブにするまで0.3X MMR /精子懸濁液を最小量で受精させる。上記のように0.1 × MMRと文化との洪水。多くの卵がドナーの卵母細胞と同じステージでまたは卵の損害賠償の手動式の場合、必要​​に応じている場合は、このオプションは便利です。

Discussion

転送が成功するには、受精し、卵母細胞の> 50％（図3）の正常な切断になります。一般的に転送卵母細胞の間に30〜60パーセントは、神経胚の段階を過ぎても存続します。我々は通常、表現型を視覚化するだけでなく、分析のいくつかのタイプ（その場で、RT - PCR）のための十分な胚が得られる実験群あたり75から150卵母細胞を、転送する。実質的により多くの卵母細胞を注入すると、大幅に収率を高めるためにいないようです。また、グループごとに少なくとも30卵母細胞は、少なくともいくつかは、原腸陥入によってそれを作ることを保証するために転送する必要があります。染料は、特定の状況に悪影響を与えるかもしれないが重要な染料は、一般的に、ここで説明する濃度と条件の下で胚には影響しません。古典的には、ニュートラルレッドは、強いタングステンベースの光源にさらされると光毒性の特性を有することが報告されている。最近では、ミールとヒースマン（2008）は胚を低温でインキュベートしている場合はビスマルクブラウンは、いくつかの毒性作用を持つことができることが報告されている。このような過度に卵母細胞を死んで、温度と照明の極端を避けることではないなどの基本的な予防策は生体染色色素の副作用の可能性を排除する必要があります。

メソッドの成功または失敗の最大の決定要因は、ドナーの卵母細胞の品質とホスト女性です。卵母細胞の特定のバッチがうまく受精するかどうかを決定するための確実な方法はありません。閉鎖の卵母細胞の割合が高いと卵巣は避けるべきである。また、我々はおそらく吸収が発生していることを示し、大きく血管形成である卵巣と貧しい成功を収めている。卵母細胞は、感染や損傷した場合、受精されません° C、可能な限り18で保持され、そうでなければ卵母細胞のように健康な状態に維持する必要があります。またdefolliculatorはより経験ですと、短い時間枠内で卵母細胞の多数を分離し、注入できるときに良い結果が達成されていることを、私たちの研究室では、表示されます。それは与えられたカエルが良いホストを作ることが確実になることはないものの同様に、、健康な卵を持つホストを選択するために注意すべきである。 defolliculatingと同様に、外科医のスキルは、プロシージャの成功に影響を持っています。ホストがanesthesizedている時間の長さを最小にすることは効率的な回収と受精に不可欠だ。

様々な手続きの全体的なタイミングは、成功した卵母細胞の移入実験に不可欠です。一般的に、短い時間の卵母細胞を培養で維持される、より良い胚の全体的な施肥と健康になります。アンチセンスオリゴを用いたmRNAのノックダウン実験のために、卵母細胞は、オリゴの標的mRNAと売上高の最大の枯渇を可能にするためのオリゴ注射後、少なくとも24時間培養する必要があります。したがって、卵母細胞は、できるだけ早くdefolliculatedと同じ日に注射する必要があります。典型的な実験は、成熟と刺激女性の火曜の夜に、そして水曜日の朝に転送に続いて、卵母細胞の分離と注射で月曜日に開始する可能性があります。標的RNAの代謝回転が低速であるか、豊富な母親のタンパク質がある場合は、培養期間は、48あるいは72時間に拡張することができます。私たちは、卵母細胞をプロゲステロンで処理の12時間内に転送されている最高の成功を持っている。過成熟卵母細胞は悪化し、一般的に悪い受精し始める。我々は一般的にプロゲステロンを追加し、〜18℃で一晩保持した卵母細胞とカエルの両方で、転送を実行する前に12時間程度hCGのと女性を注入する。

ホストベースの転送方式が最初に労働集約的であるが、基本的に必要なスキルは、それほど苦労せずに取得することができます。このメソッドの最も一般的な用途は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを​​注入して、特定の母性mRNAの枯渇した卵母細胞を受精することです。このようなmRNAの過剰発現や薬物治療など、他の操作も行うことができます。これらは、しばしばにより卵に対する胚で発現が増加または差動機能への注入、以下の受精と比較して異なる結果を持つことができます。 E -カドヘリンの過剰発現（。ヒースマンら 、1991）と紫外線照射（Holwill ら、1987;。ElinsonとPasceri、1989）は二つの興味深い例である。私たちの研究室からの予備的な結果はまた、注入されたインテグラーゼまたはmeganucleasesを使用してトランスジェネシスの手法は、同様に卵母細胞でより効率的に作業ができることを示唆している。

ホストの転送技術は、前後の受精の段階の両方で実験することができますので、他の生物に、あるいはアフリカツメガエルにおける受精後のイベントでのみ見ることによって不可能な洞察を提供することができます。開発と難しさと脊椎動物で母性効果の変異の生成のコストで母親のシグナル伝達経路の重要性を考えると、このメソッドは、初期の開発の研究に有用なツールを維持する可能性があります。

7。代表的な再sults

図1。 defolliculating良い（上）と悪い（底部）鉗子の例。

図2。ホストの女性への培養卵母細胞の転送 （A）小切開は、ホストのカエルの下腹部で作られています。筋層は、卵母細胞の導入を可能にするためにわずかに上昇する。 （B）卵母細胞は、極めて重要な染めと切開して体腔内に配置されます。筋層内の初期の縫合の（C）完了。

図3。ゼリーコートの除去に続く割るの例として、8 - 16 -細胞の段階で転送される卵母細胞、。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	Invitrogen	11415-064
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1x Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P-0781
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl2
10 mM MgCl2
150 mM HEPES
adjust to pH 7.6-7.8
Store at 4°C
Anesthetic solution
1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A-5040
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly
Progesterone stocks
10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol
Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution
Store at -20°C
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
Blue: 0.1% Nile Blue A	Aldrich	121479-5G
Red: 0.25% Neutral Red	Sigma-Aldrich	N-6634
Brown: 1% Bismarck Brown	Sigma-Aldrich	B-2759
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.