Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Published: May 6, 2010 doi: 10.3791/1869
Automatic Translation
*1, *2,3,4,5, *2, 6, 2, 3,6, 1, 2,7,8
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University, 5Department of Applied Mathematics, Harvard University, 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Abstract

De drie-dimensionale vouwen van chromosomen compartmentalizes het genoom en en kan brengen verre functionele elementen, zoals promotors en enhancers, in nauwe ruimtelijke nabijheid 2-6. Het ontcijferen van de relatie tussen de organisatie en de chromosoom genoom activiteit zal helpen bij het begrijpen genomische processen, zoals transcriptie en replicatie. Er is echter weinig bekend over hoe chromosomen vouwen. Microscopie is niet in staat om grote aantallen loci gelijktijdig of met een hoge resolutie te onderscheiden. Tot op heden, de detectie van chromosomale interacties met behulp van chromosoom exterieur capture (3C) en de latere aanpassingen nodig zijn de keuze van een set van target loci, het maken van genoom-brede studies onmogelijk 7-10.

We ontwikkelden Hi-C, een uitbreiding van 3C die in staat is de identificatie van long range interacties in een onpartijdige, genoom-brede manier. In Hi-C worden de cellen gefixeerd met formaldehyde, waardoor interactie loci te zijn met elkaar verbonden door middel van covalente DNA-eiwit cross-links. Wanneer het DNA vervolgens wordt gefragmenteerd met een restrictie-enzym, blijven deze loci gekoppeld. Een gebiotinyleerde residu wordt opgenomen als de 5 'overhang zijn ingevuld Next, stomp-end ligatie wordt uitgevoerd onder omstandigheden die ligatie te verdunnen gebeurtenissen tussen cross-linked DNA-fragmenten voor. Dit resulteert in een genoom-brede bibliotheek van ligatieproducten, wat overeenkomt met paren van fragmenten die oorspronkelijk werden dicht bij elkaar in de kern. Elk ligatie product is voorzien van biotine op de plaats van de kruising. De bibliotheek is geschoren, en de knooppunten zijn-afgebroken met streptavidine kralen. De gezuiverde knooppunten kan vervolgens worden geanalyseerd met behulp van een high-throughput sequencer, wat resulteert in een catalogus van op elkaar inwerkende fragmenten.

Directe analyse van de resulterende contact matrix toont vele functies van de genomische organisatie, zoals de aanwezigheid van chromosoom gebieden en de preferentiële vereniging van kleine gen-rijke chromosomen. Correlatie analyse kan worden toegepast op de contact matrix, waaruit blijkt dat het menselijk genoom is gescheiden in twee compartimenten: een minder dicht op elkaar gepakt compartiment met open, toegankelijk en actieve chromatine en een meer dichte compartiment met gesloten, ontoegankelijke, en inactieve chromatine regio's. Tot slot, ensemble analyse van het contact matrix, in combinatie met theoretische afleidingen en computationele simulaties bleek dat op de schaal van megabase Hi-C heeft in overeenstemming met een fractal globule conformatie onthult.

Protocol

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Lieberman-Aiden et al.., Science 326, 289-293 (2009) .

I. Verknopen, Spijsvertering, markeren van DNA Ends, en Blunt-end Ligatie

  1. Hi-C begint met verknoping van cellen, die is een rode draad tussen alle 3C-gebaseerde methoden. Om te beginnen, groeien tussen de 2 x 10 7 en 2,5 x 10 7 cellen van zoogdieren, ofwel aanhanger of in suspensie, en verknopen van de cellen. (Voor meer informatie over verknoping van cellen, zie: 11
  2. Lyseren van de cellen in 550 ul lysisbuffer (500 ul 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630 en 50 ul proteaseremmers) met behulp van een homogenisator. Draai de chromatine bij 5.000 toeren per minuut en twee keer was de pellet met 500 ul 1x NEBuffer 2.
  3. Resuspendeer de chromatine in 1x NEBuffer 2, aliquot in 5 genummerde buizen en voeg 1x NEBuffer 2 tot een eindvolume van 362 ui. Voeg 38 ul 1% SDS, meng zorgvuldig en bij 65 ° C incubeer gedurende 10 minuten. Plaats de buisjes weer op het ijs onmiddellijk na incubatie.
  4. Quench de SDS door de toevoeging van 44 ul Triton X-100 en meng voorzichtig. Digest het chromatine door het toevoegen van 400 eenheden van HindlII en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht tijdens het draaien.
  5. De volgende stappen zijn Hi-C en bevatten specifieke markering van de DNA-uiteinden met biotine en het uitvoeren van bot-end ligatie van verknoopt fragmenten. Deze stap zal ligatie kruispunten om later te worden gezuiverd. Buis 1 mag niet onderworpen aan de biotinylatie stap en moeten in plaats daarvan gescheiden worden gehouden en dienen als een 3C controle om ervoor te zorgen dat de spijsvertering, en ligatie omstandigheden waren optimaal.
  6. In te vullen restrictiefragment overhangen en markeer de DNA-uiteinden met biotine in de resterende vier buizen, voeg 1,5 pl 10 mM dATP, 1,5 ul 10 mM dGTP, 1,5 ul 10 mM dTTP, 37,5 ul 0,4 mM biotine-14-dCTP, en 10 pi 5U/μl Klenow de buis 2-5. Meng zorgvuldig en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
  7. Plaats de buisjes op ijs. Om de enzymen te inactiveren, voeg 86 ul 10% SDS aan buizen 1-5. Incubeer de buizen op 65 ° C gedurende precies 30 minuten en leg ze op het ijs onmiddellijk daarna.
  8. De ligatie wordt uitgevoerd onder extreem verdunde voorwaarden om ligatie gebeurtenissen tussen verknoopt fragmenten voor. Werken op het ijs, voeg 7,61 ml ligatie mix [745 ul 10% Triton X-100, 745 pl 10x ligatie buffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT), 80 pl 10 mg / ml BSA , 80 ui 100 mM ATP en 5,96 ml water] om elk van de vijf genummerde 15 ml buizen. Breng elke verteerd chromatine mengsel tot een overeenkomstige 15 ml buis.
  9. Voor reguliere 3C ligatie, voeg 10 ul 1U/μl T4 DNA-ligase aan buis 1. Voor stompe einde van Hi-C ligatie, voeg 50 ul 1U/μl T4 DNA-ligase aan buizen 2-5. Meng door de buizen en alle 5 buizen voor 4 uur bij 16 ° C. incubeer
  10. Crosslinks worden omgekeerd en eiwit wordt afgebroken door het toevoegen van 50 pi 10 mg / ml proteinase K per buis en het incuberen van de buisjes overnacht bij 65 ° C. Voeg een extra 50 ui 10 mg / ml proteinase K per buis de komende dagen en blijven de incubatie bij 65 ° C gedurende nog eens 2 uur.
  11. Koel de reactiemengsels tot kamertemperatuur en over te brengen naar vijf 50 ml conische buizen. Zuiveren het DNA in deze buizen door het uitvoeren van een fenol-extractie. Voeg 10 ml fenol pH 8,0 en vortex gedurende 2 minuten. Spin de buizen gedurende 10 minuten bij 3500 rpm en voorzichtig als een groot deel van de waterige fase als mogelijk over te dragen aan een nieuwe 50 ml buis.
  12. Herhaal de extractie met behulp van fenol pH 8.0: chloroform (1:1) en het neerslaan van de DNA met behulp van ethanol. (Voor meer informatie over DNA-zuivering, zie: 11
  13. Na centrifugeren van de ethanol neergeslagen DNA, te ontbinden elk DNA pellet in 450 ui 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Breng het DNA mengsel in een 1,7 ml centrifugebuis.
  14. Een nieuwe ronde van zuivering wordt uitgevoerd door het doen van 2 fenol: chloroform extracties. Voeg 500 ul fenol pH 8.0: chloroform (1:1) en vortex gedurende 1 minuut. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 14.000 rpm en de overdracht van de waterige fase naar een nieuwe buis. Na de tweede extractie, neerslag het DNA door het toevoegen van 0.1x volume van NaOAc, 2x volume van 100% ethanol en incubeer 30 minuten bij -80 ° C.
  15. Na het stoppen met draaien van de neergeslagen DNA, wassen elk DNA pellet met 70% ethanol en resuspendeer elk DNA pellet in 25 ul 1x TE. Degraderen alle RNA die kunnen aanwezig zijn door het toevoegen van 1 pi 1 mg / ml RNAse A per buis en het incuberen van de buizen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Het zwembad van het Hi-C inhoud van buizen 2-5, nog steeds het houden van een aparte buis als een 3C controle.
  16. Nu is een goede gelegenheid om de Hi-C-markering en ligatie efficiency te onderzoeken. Deze controles zijn uitstekende indicatoren voor de vraag of een Hi-C bibliotheek gaat om succesvol te zijn.
    1. Om te controleren de kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken, run 2 pl en 6 pl fracties van 1:10 verdunningen van zowel 3C-en Hi-C bibliotheken op een 0,8% agarose gel. (Zie Figuur 2A)
    2. Hi-C markering en Hi-C ligatie efficiëntie wordt gecontroleerd door een PCR-test te verteren. Succesvolle fill-in en ligatie van een Hindlll site (AAGCTT) creëert een site voor het restrictie-enzym Nhel (GCTAGC). Een bijzonder ligatieproduct gevormd uit twee nabijgelegen restrictiefragmenten wordt aangevuld met PCR (zoals in 3C 11 met gebruik van 0,2 ul van elke bibliotheek als sjabloon. De PCR-producten worden vervolgens verteerd met HindIII, Nhel of beide. Na het draaien van de monsters op een 2% gel , kan het relatieve aantal van 3C en Hi-C ligatie gebeurtenissen worden geschat door het kwantificeren van de intensiteit van de gesneden en ongesneden bands (zie figuur 2B).
  17. Enkele fragmenten zullen niet zijn afgebonden: om te voorkomen dat trekken ze naar beneden later, verwijder biotine uit deze unligated eindigt met behulp van de exonuclease activiteit van T4 DNA polymerase.
    1. Biotine-14-dCTP bij niet-geligeerde DNA-uiteinden is verwijderd met de exonuclease activiteit van T4 DNA polymerase. Meng 5 ug van Hi-C-bibliotheek met 1 pi 10 mg / ml BSA, 10 pl 10x NEBuffer 2, 1 ui 10 mM dATP, 1 ui 10 mM dGTP en 5 eenheden T4 DNA-polymerase in een totaal volume van 100 ul en incubeer de mengsel bij 12 ° C gedurende 2 uur. Indien mogelijk, meerdere 5 microgram reacties uitgevoerd.
    2. De reactie wordt gestopt door toevoeging van 2 pi 0,5 M EDTA pH 8,0.
    3. Chloroform (1:1) extractie wordt gedaan, gevolgd door ethanol neerslag: aan het DNA, een fenol pH 8,0 te zuiveren.
    4. Het supernatant wordt verwijderd en het DNA-pellets worden geresuspendeerd en samengevoegd in een totaal volume van 100 pi water.

II. Knippen en grootte Selectie

  1. Om de gebiotinyleerde DNA geschikt is voor high-throughput sequencing, moet het DNA worden geschoren tot een grootte van 300-500 baseparen met een Covaris S2 instrument (duty cycle 5, intensiteit 5, cycli / burst 200, tijd 60 sec gedurende 4 cycli) .
  2. Voor reparatie van de geschoren DNA-uiteinden, voeg 14 ul 10x ligatiebuffer, 14 ul 2,5 mM dNTP mix, 5 ul T4 DNA-polymerase, 5 ul T4 polynucleotide kinase, een ui Klenow DNA-polymerase en een ui water. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Na de incubatie, gebruik dan een Qiagen MinElute kolom aan het DNA te zuiveren volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Twee keer Elueer het DNA met 15 ul 1x Tris-Low-EDTA (TLE: 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Dan, voeg een dATP om een ​​einde aan de drie 'van de end-DNA gerepareerd door het toevoegen van 5 pi 10x NEBuffer2, 10 ul 1 mM dATP, 2 pi water en 3 pl Klenow (exo-). Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  4. Om inactiveren van de Klenowfragment, incubeer de reacties gedurende 20 minuten bij 65 ° C en vervolgens koel de reacties op het ijs. Met behulp van een speedvac, verminderen de reactie volumes tot 20 pl.
  5. Vervolgens laadt u het DNA in een 1,5% agarose gel met 1X TAE en lopen gedurende 3,5 uur bij 80-90V. Na het kleuren van de gel met SYBR groen, visualiseren het DNA op een DarkReader. Accijnzen DNA-fragmenten tussen de 300 en 500 basenparen en zuiveren ze met een Qiagen gel extractie kit met 2-4 kolommen, afhankelijk van het gewicht van de gel. Elueer het DNA met 50 pi 1x TLE.
  6. Combineer de eluaten van de QIAquick kolommen en breng het uiteindelijke volume tot 300 ul met 1x TLE. Tot slot bepaalt de DNA-concentratie met de Quant-iT test met behulp van de qubit fluorometer en bereken het totale bedrag van het DNA.

III. Biotine Pull-down en Gepaarde-end Sequencing

  1. In dit deel van het protocol, zijn ligatie knooppunten gezuiverd van de DNA-pool, waardoor efficiënte identificatie van interagerende chromatine fragmenten door gepaarde-end sequencing. Voer alle volgende stappen in DNA LoBind buizen.
  2. Bereid je kralen voor biotine pull-down door het wassen van 150 ul geresuspendeerd twee keer magnetische streptavidine korrels met 400 ul Tween Buffer (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween).
    Deze en toekomstige wast bestaat uit vijf stappen:
    1. Voeg buffer om de kralen
    2. Breng het mengsel naar een nieuwe buis
    3. Draai het monster gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur
    4. Reclaim the kralen met behulp van een magnetisch deeltje concentrator
    5. Verwijder het supernatant
  3. Resuspendeer de kralen in 300 ul 2x Nee Tween Buffer (2x NTB: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) en te combineren met 300 ul Hi-C DNA. Laat de biotine gelabelde Hi-C-DNA naar de streptavidine parels te binden door het incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met rotatie.
  4. Reclaim the DNA gebonden streptavidine kralen met de magnetische deeltjes Concentrator, en verwijder het supernatant. Was de kralen in 400 ul 1x NTB (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), gevolgd door 100 ul 1x ligatie buffer. Resuspendeer de parels in 50 pl 1x ligatie buffer en breng het mengsel naar een nieuwe buis.
  5. Ter voorbereiding op het DNA voor Illumina Gekoppeld Einde sequencing, neemt de totale hoeveelheid DNA worden gebruikt als input voor de biotine pull-down, die eerder in stap 2.6 berekend, en deel dit door 20 om het bedrag van Hi-C DNA dat is schatting is afgebroken en is beschikbaar voor ligatie. Voeg 6 picomol van Illumina Gekoppelde Einde adapters per ug van Hi-C DNA beschikbaar voor ligatie. Gebruik 1.200 eenheden T4 DNA-ligase aan de adapters ligeren aan het DNA. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder niet-geligeerde Gekoppeld Einde adapters door het terugwinnen van de Hi-C DNA gebonden kralen en het wassen van de bolletjes twee keer met 400 ul 1x TB.
  7. Was de korrels met 200 ul 1x NTB, gevolgd door 200 ul en vervolgens 50 ui 1x NEBuffer 2. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de parels in 50 pl 1x NEBuffer 2 en overbrengen naar een nieuwe buis.
  8. Voor het bepalen van het aantal cycli nodig om voldoende PCR product te genereren voor sequencing, opgezet vier-test PCR-reacties met 6, 9, 12 of 15 cycli. (Voor details van de PCR-amplificatie, zie: 12 Bepaal het optimale cyclus nummer door het uitvoeren van de PCR-reacties op een 5% polyacrylamide gel en kleuring met SYBR Green, zodat de afwezigheid van valse bands en de aanwezigheid van een uitstrijkje tussen de 400 -. 600 baseparen, dat is de lengte van de geschoren producten na ligatie aan de adapters.
  9. Versterken de rest van de Hi-C-library gebonden streptavidine kralen in een grootschalig PCR met het optimale aantal PCR-cycli. Het zwembad van het PCR-producten van de afzonderlijke putten en terug te vorderen van de kralen. Houd 1% van de grootschalige PCR product apart te lopen op een gel en de rest van de PCR-product te zuiveren met 1.8x volume Ampure kralen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  10. Elueer het DNA met 50 pi 1x TLE buffer en vergelijk 1% van de Ampure kraal gezuiverd PCR product aan de 1% van de oorspronkelijke hoeveelheid PCR-product op een 5% polyacrylamide gel, zodat de succesvolle verwijdering van de PCR-primers.
    1. Wij bevelen ook het klonen 1 pl van de Hi-C bibliotheek en het bepalen van het product van ongeveer 100 klonen met behulp van Sanger-sequencing. Dit zal u toelaten om het relatieve aantal van de alignable Hi-C leest in het PCR-mengsel te beoordelen. Voor typische resultaten, zie Figuur 3B.
  11. Volgorde van de Hi-C-bibliotheek met Illumina gepaarde einde sequencing. Lijn elk uiteinde onafhankelijk van elkaar met behulp van MAQ (http://maq.sourceforge.net/) om de interactie chromatine fragmenten te identificeren.

IV. Vertegenwoordiger van Hi-C resultaten

  1. De volgende resultaten worden verwacht wanneer de Hi-C protocol is technisch goed uitgevoerd en kan worden beschouwd als kwaliteitscontrole.
  2. Kwaliteitscontrole stappen moeten tonen aan dat zowel 3C en Hi-C-bibliotheken als vrij strak bands die groter zijn dan 10 kb lopen. Een DNA-uitstrijkje duidt op slechte ligatie efficiency. Typisch, ligatie rendement is iets lager in een Hi-C bibliotheek ten opzichte van een 3C sjabloon (zie Figuur 2A).
  3. Hi-C-markering en ligatie efficiëntie kan worden geschat door digestie van een PCR-product gegenereerd met behulp van 3C primers. 3C knooppunten worden gesneden door HindIII en niet door Nhel. Het omgekeerde geldt voor Hi-C knooppunten. Deze PCR-test verteren blijkt dat 70% van de Hi-C amplicons worden doorsneden door Nhel en niet door HindIII, bevestigt een efficiënte markering van ligatie knooppunten (zie figuur 2B).
  4. Analyse van de sequentie leest moet blijken dat leest van zowel intrachromosomale en interchromosomal interacties, aangegeven door de blauwe en rode lijnen, sluiten veel dichter bij HindIII restrictieplaatsen in vergelijking met de willekeurig gegenereerde leest, in het groen weergegeven (zie Figuur 3A).
  5. In een geslaagd experiment, 55% van de alignable lezen paren vertegenwoordigen interchromosomal interacties. Vijftien procent vertegenwoordigen intrachromosomale interacties tussen de fragmenten kleiner dan 20 kb uit elkaar en 30% zijn intrachromosomale gelezen paren die meer dan 20 kb van elkaar (zie Figuur 3B). Deze verdeling kan voorafgaand aan de high-throughput sequencing worden bemonsterd, als een vorm van kwaliteitscontrole, kloneren en Sanger-sequencing van ongeveer 100 klonen is meestal voldoende.
  6. De chromatine interacties kunnen worden gevisualiseerd als een heatmap, waar de x-en y-assen vertegenwoordigen loci in genomische orde en elke pixel staat voor het aantal waargenomen interacties tussen hen. Meestal zal DNA-fragmenten die zeer dicht bij elkaar in de lineaire genoom hebben de neiging om regelmatig met elkaar. Dit wordt gezien in de intrachromosomale heatmaps als een prominent diagonaal (zie figuur 4A).
  7. De volgende resultaten tonen verschillende manieren van het analyseren van de data op verschillende niveaus van het genoom organisatie te onthullen. Het plotten van de contact probability versus genomische afstand (zie figuur 5A) blijkt dat de kans op contact afneemt als een functie van de genomische afstand, uiteindelijk het bereiken van een plateau. Bij elke afstand zijn intrachromosomale interacties, getoond in de vaste lijn, verrijkt ten opzichte van interchromosomal interacties, vertegenwoordigd door de stippellijnen. Dit impliceert direct de aanwezigheid van chromosoom gebieden.
  8. De berekening van de waargenomen / verwachte aantal interchromosomal contacten tussen alle paren van chromosomen onthult preferentiële associatie tussen bepaalde chromosoom paren. Kleine gen-rijke chromosomen bij voorkeur met elkaar omgaan, aangegeven door de heldere rode kleur (zie figuur 5B).
  9. Individuele chromosomen kan ook worden onderzocht. De ruwe heatmap kan worden ingesteld met behulp van een naar verwachting heatmap om rekening te houden de genomische afstand tussen paren van loci, wat resulteert in een waargenomen / verwachte heatmap. Dan kan een correlatiematrix worden geproduceerd door het correleren van de rijen en kolommen van de waargenomen / verwachte heatmaps. Met behulp van correlatieanalyse, wordt aangetoond dat het menselijk genoom segregeert in twee compartimenten. Dit wordt geïllustreerd door de plaid-patroon in de correlatie heatmaps (zie figuur 4A-D). (Voor details van de Hi-C data-analyse, zie: 1.
  10. Met behulp van Hi-C data, werden nieuwe inzichten verkregen in de chromatine vouwen op de megabase schaal. Het klassieke model van polymeer condensatie suggereert dat chromatine packs in een evenwicht bolletje. Plotten contact waarschijnlijkheid als een functie van de afstand toont aan dat contact met kans op schalen als een power wet met genomic afstand die helling is ongeveer -1 (zie figuur 6A). Dit is niet in overeenstemming met het gedrag van een evenwicht globule, maar klopt met de verwachtingen voor een alternatieve structuur bekend als een fractal globule (zie figuur 6B).
  11. Hier worden twee bolvormige structuren getoond. Kleur komt overeen met afstand van een eindpunt, variërend van blauw naar cyaan, groen, geel, oranje en rood (zie Figuur 6C boven). In tegenstelling tot evenwicht bolletjes, fractal bolletjes gebrek aan verwikkelingen. In een fractal globule, loci die zijn in de buurt langs de contour de neiging om in de buurt in 3D, wat leidt tot de aanwezigheid van monochromatische blokken (zie figuur 6C midden). Dergelijke blokken zijn niet gevonden in het evenwicht bolletje (zie figuur 6C onderaan).

Figuur 1
Figuur 1. Hi-C overzicht. Cellen worden verknoopt met formaldehyde, wat resulteert in covalente banden tussen ruimtelijk aangrenzende chromatine segmenten (DNA-fragmenten: donker blauw, rood, eiwitten, die kunnen bemiddelen dergelijke interacties, worden getoond in licht blauw en cyaan). Chromatine wordt gedestrueerd met een restrictie-enzym (hier, HindIII, restrictie site: stippellijn, zie kader). De resulterende sticky ends worden ingevuld met nucleotiden, waarvan er een is gebiotinyleerd (paarse stip). Ligatie wordt uitgevoerd onder extreem verdunde omstandigheden gunste van intramoleculaire ligatie gebeurtenissen; de HindlII site is verloren en een Nhel site is gemaakt (inzet). DNA wordt gezuiverd en geschoren, en gebiotinyleerde knooppunten zijn geïsoleerd met behulp van streptavidine kralen. Interactie fragmenten worden geïdentificeerd door gepaarde-end sequencing.

Figuur 2
Figuur 2. Hi-C library kwaliteitscontroles. (A) Toenemende hoeveelheden van een 3C controle en een Hi-C bibliotheek werden opgelost op een 0,8% agarose gel. Beide bibliotheken draaien als een vrij strakke band groter dan 10 kb. Typische ligatie efficiëntie in een Hi-C bibliotheek is iets lager dan wat wordt waargenomen in een 3C template, en wordt aangegeven door het uitstrijkje in de Hi-C rijstroken. (B) PCR verteren controle. Een ligatie kruising gevormd door twee nabijgelegen fragmenten wordt versterkt met behulp van standaard 3C PCR-condities. Hi-C ligatie producten kunnen worden onderscheiden van die welke in de conventionele 3C door ontsluiting van de ligatie site. Hi-C knooppunten worden gesneden door Nhel, niet HindIII, het omgekeerde geldt voor 3C knooppunten. 70% van de Hi-C amplicons werden gesneden door Nhel, bevestigt een efficiënte markering van ligatie kruising. Twee repliceert werden uitgevoerd om een ​​betrouwbare kwantificering te verzekeren.

Figuur 3
Figuur 3. Hi-C te lezen kwaliteitscontroles. (A) Leest van fragmenten die overeenkomt met zowel intrachromosomale (blauw) en interchromosomal (rood) interacties af te stemmen aanzienlijk dichter bij HindIII restrictieplaatsen in vergelijking met de willekeurig gegenereerde gelezen (groen). Zowel de intrachromosomale leest en leest interchromosomal curves dalen snel als de afstand van de HindlII-plaats loopt op tot een plateau wordt bereikt op een afstand van ~ 500 bp. Dit komt overeen met de maximale grootte van fragment wordt gebruikt voor het rangschikken. (B) Typisch, 55% van de alignable lezen paren vertegenwoordigen interchromosomal interacties. Vijftien procent vertegenwoordigen intrachromosomale interacties tussen de fragmenten kleiner dan 20 kbuit elkaar en 30% zijn intrachromosomale gelezen paren die meer dan 20 kb van elkaar. Deze verdeling kan voorafgaand aan de high-throughput sequencing worden bemonsterd, als een vorm van kwaliteitscontrole, kloneren en Sanger-sequencing van ongeveer 100 klonen is meestal voldoende.

Figuur 4
Figuur 4. Correlatie analyse toont aan dat de kern is gescheiden in twee compartimenten. (A) Heatmap die overeenkomt met intrachromosomale interacties op chromosoom 14. Elke pixel vertegenwoordigt alle interacties tussen een 1-Mb locus en een 1-Mb locus; intensiteit komt overeen met het totaal aantal gelezen (bereik: 0-200 gelezen). Maatstreepjes verschijnen elke 10 Mb. De heatmap vertoont onderbouw in de vorm van een intense diagonaal en een constellatie van grote blokken. (Chromosoom 14 acrocentric is;. De korte arm wordt niet getoond) Met behulp van de Hi-C dataset om de gemiddelde kans op contact voor een paar van loci op een gegeven genomische afstand te berekenen, is een verwachting matrix geproduceerd (B) die overeenkomt met wat zou worden waargenomen als er geen lange-afstands-structuren. Het quotiënt van deze twee matrices is een waargenomen / verwachte matrix (C) waar de uitputting wordt weergegeven in blauw en verrijking in het rood [bereik: 0,2 (blauw) tot 5 (rood)]. Het blok patroon wordt steeds duidelijker. De correlatie matrix (D) illustreert de correlatie [bereik: -1 (blauw) tot 1 (rood)] tussen de intrachromosomale interactie tussen profielen van elk paar loci langs chromosoom 14. De opvallende plaid patroon duidt op de aanwezigheid van twee compartimenten in het chromosoom.

Figuur 5
Figuur 5. De aanwezigheid en de organisatie van chromosoom gebieden. (A) Kans op contact afneemt als een functie van de genomische afstand op chromosoom 1, uiteindelijk het bereiken van een plateau op ~ 90MB (blauw). Het niveau van interchromosomal contact (zwarte streepjes) verschilt voor verschillende paren chromosomen; loci op chromosoom 1 de meeste kans om te interageren met loci op chromosoom 10 (groene streepjes) en de minste kans om te interageren met loci op chromosoom 21 (rode streepjes). Interchromosomal interacties zijn ten opzichte van intrachromosomale interacties uitgeput. (B) Waargenomen / verwachte aantal interchromosomal contacten tussen alle paren van chromosomen. Rood geeft aan verrijking en blauw geeft aan uitputting [bereik: 0,5 (blauw) tot 2 (rood)]. Kleine, gen-rijke chromosomen hebben de neiging om meer met elkaar.

Figuur 6
Figuur 6. De lokale verpakking van chromatine is in overeenstemming met het gedrag van een fractal globule. (A) Contact waarschijnlijkheid als een functie van de genomische afstand, gemiddeld over het genoom (blauw). Een prominente power wet schalen wordt gezien tussen de 500kb en 7Mb (gearceerd gebied) met een helling van -1,08 (fit getoond in cyaan). (B) Simulatie resultaten voor contact waarschijnlijkheid als een functie van de afstand voor evenwicht (rood) en fractal (blauw) bolletjes. De helling van een fractal globule is bijna -1 (cyaan), bevestiging van onze nieuwe theoretische voorspelling 1. De helling van een evenwicht bolletje is -3 / 2, wat overeenkomt met eerdere theoretische verwachtingen. De helling van de fractal globule lijkt sterk op de helling waargenomen in de Hi-C resultaten, terwijl de helling voor een evenwicht bolletje wordt niet gezien in de Hi-C data. (C) Top: Een ongevouwen polymeerketen, 4000 monomeren lang. Kleur komt overeen met afstand van een eindpunt, variërend van blauw naar cyaan, groen, geel, oranje en rood Midden:. Typische voorbeeld van een fractal globule getrokken uit ons ensemble. Fractal bolletjes gebrek aan verwikkelingen. Loci die zijn in de buurt langs de contour de neiging om in de buurt in 3D, wat leidt tot de aanwezigheid van grote monochromatische blokken die zichtbaar zijn op het oppervlak en in de cross-sectie Onder:. Een evenwicht bolletje. De structuur is zeer verstrikt; loci die zijn in de buurt langs de contour (vergelijkbaar kleur) hoeft niet te worden in de omgeving in 3D.

Discussion

We presenteren een methode voor het bestuderen van de 3-dimensionale architectuur van het genoom in kaart brengen van chromatine interacties in een onpartijdige, genoom-brede manier. De meest kritische experimentele stap wat stelt deze technologie, afgezien van eerder werk - is de incorporatie van gebiotinyleerde nucleotiden aan de beperking uiteinden van verknoopt fragmenten voor stompe-end-ligatie. Het uitvoeren van deze stap met succes maakt diepe sequentie van alle ligatie knooppunten, en geeft Hi-C zijn omvang en kracht.

Het aantal gelezen zal uiteindelijk bepalen de resolutie van de interactie kaarten. Hier is een 1 Mb interactie kaart voor het menselijke genoom gepresenteerd met behulp van ~ 30 miljoen alignable leest. Om de 'all-purpose' resolutie te verhogen met een factor van n, moet het aantal gelezen worden verhoogd met een factor van n 2.

De Hi-C techniek kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere technieken, zoals hybride vast te leggen na de bibliotheek generatie (tot specifieke delen van het genoom doel) en chromatine immunoprecipitatie na ligatie (om de chromatine-omgeving van regio's in verband met specifieke eiwitten te onderzoeken).

Disclosures

Een voorlopige patent op de Hi-C-methode (no. 61/100, 151) wordt momenteel herzien.

Acknowledgments

Wij danken A. Kosmrlj voor discussies en code, AP Aiden, XR Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout , L. Wood, en K. Zeldovich voor discussies en L. Gaffney en B. Wong voor hulp bij visualisatie.

Ondersteund door een Fannie en John Hertz Stichting afgestudeerd gemeenschap, een National Defense Science and Engineering gediplomeerde gemeenschap, een NSF afgestudeerd gemeenschap, het National Space Biomedisch Onderzoeksinstituut, en het verlenen van nee. T32 HG002295 van de National Human Genome Research Institute (NHGRI) (EL); i2b2 (Informatica voor de integratie van biologie en het bed), de NIH ondersteunde Center for Biomedical Computing aan de Brigham and Women's Hospital (LAM), kennen geen. HG003143 van de NHGRI, en een Keck Foundation onderscheiden jonge geleerde award (JD). Raw en in kaart gebracht Hi-C sequence data is gedeponeerd bij het ​​GEO-database ( www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ), de toetreding niet. GSE18199. Extra visualisaties zijn beschikbaar op http://hic.umassmed.edu .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease inhibitors Sigma-Aldrich P8340-5ml Step 1.2
biotin-14-dCTP Invitrogen 19518-018 Step 1.6
Klenow New England Biolabs M0210 Steps 1.6 and 2.2
T4 DNA ligase Invitrogen 15224 Step 1.9
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203 Steps 1.17 and 2.2
10x ligation buffer New England Biolabs B0202 Steps 2.2 and 3.4
T4 PNK New England Biolabs M0201 Step 2.2
Klenow (exo-) New England Biolabs M0212 Step 2.3
Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads Invitrogen 650.01 Step 3.2
T4 DNA ligase HC Enzymatics L603-HC-L Step 3.5
Phusion HF mastermix New England Biolabs F531 Step 3.8
Ampure beads Beckman Coulter Inc. A2915 Step 3.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  2. Kosak, S. T., Groudine, M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).
  3. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (2007).
  4. Dekker, J. Gene Regulation in the Third Dimension. Science. 319, 1793-1794 (2008).
  5. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).
  6. Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. Gene regulation through nuclear organization. Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).
  7. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  8. Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).
  9. Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).
  10. Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).
  11. Miele, A., Dekker, J. Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C). Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).
  12. Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads. Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).

Tags

Cellular Biology chromosoom bouw vast te leggen chromatine structuur Illumina Gekoppelde End sequencing polymeer fysica.
Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Berkum, N. L., Lieberman-Aiden,… More

van Berkum, N. L., Lieberman-Aiden, E., Williams, L., Imakaev, M., Gnirke, A., Mirny, L. A., Dekker, J., Lander, E. S. Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.. J. Vis. Exp. (39), e1869, doi:10.3791/1869 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter