الأسلوب مرحبا – C يتيح تحديد غير منحازة ، الجينوم واسعة من التفاعلات لونين (1). مرحبا – C الأزواج القرب وربط تسلسل موازية على نطاق واسع. ويمكن استخدام البيانات الناتجة لدراسة الهندسة المعمارية الجينومية على مستويات متعددة : النتائج الأولية التي تم تحديدها ميزات مثل الأراضي الصبغي ، وفصل لونين المفتوحة والمغلقة ، وهيكل لونين على نطاق megabase.
للطي ثلاثية الأبعاد من الكروموسومات compartmentalizes والجينوم ، ويمكن تحقيق العناصر الفنية البعيدة ، مثل المروجين ومحسنات ، في القرب المكاني وثيق 2-6. سوف فك العلاقة بين المنظمة والنشاط الجينوم الكروموسوم مساعدة في فهم العمليات الجينومية ، مثل النسخ والتكرار. ومع ذلك ، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الكروموسومات أضعاف. المجهر غير قادر على التمييز بين أعداد كبيرة من مواضع في وقت واحد أو في دقة عالية. حتى الآن ، والمطلوب الكشف عن التفاعلات الكروموسومات باستخدام كروموسوم التقاط التشكل (3C) والتعديلات اللاحقة على اختيار مجموعة من مواضع الهدف ، مما يجعل دراسات الجينوم على نطاق 70-10 مستحيلا.
قمنا بتطوير مرحبا – C ، امتدادا ل3C القادرة على تحديد التفاعلات طويلة المدى بطريقة غير منحازة الجينوم واسعة. في مرحبا – C ، يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد ، مما تسبب في أن تكون ملزمة التفاعل المكاني لبعضهم البعض عن طريق الحمض النووي والبروتينات التساهمية عبر الوصلات. عندما تم تجزئة الحمض النووي لاحقا مع انزيم التقييد ، تبقى مرتبطة هذه المكاني. وأدرج رواسب biotinylated كما تمتلئ يتدلى 5 'فيها يتم تنفيذ التالي ، كليلة نهاية ربط في ظل الظروف المخففة التي تؤيد الربط بين الأحداث شظايا الحمض النووي عبر ربط. هذه النتائج في مكتبة الجينوم واسعة من منتجات الربط ، المقابلة لأزواج من الشظايا التي كانت أصلا على مقربة من بعضها البعض في النواة. ويتسم كل منتج مع ربط البيوتين في موقع التقاطع. غير المنفصمة المكتبة ، ويتم سحبها إلى أسفل وتقاطعات مع حبات streptavidin. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل التقاطعات تنقية باستخدام التسلسل الإنتاجية العالية ، مما أدى إلى كتالوج من شظايا التفاعل.
التحليل المباشر لمصفوفة الاتصال يكشف العديد من الميزات الناتجة من التنظيم الجيني ، مثل وجود كروموسوم الأراضي وجمعية تفضيلية من الكروموسومات الجينات الصغيرة الغنية بالنفط. ويمكن تطبيق تحليل الارتباط إلى مصفوفة الاتصال ، مما يدل على أن يتم الفصل في الجينوم البشري إلى قسمين : مقصورة تحتوي على أقل المكتظ بالسكان لونين مفتوحة ومتاحة ، ونشط وحجرة مغلقة تحتوي على أكثر كثافة ، والمناطق التي يتعذر الوصول إليها لونين ، ونشط. أخيرا ، كشف تحليل فرقة من المصفوفة الاتصال ، إلى جانب الاشتقاقات النظرية والمحاكاة الحاسوبية ، وأنه في نطاق megabase مرحبا – C يكشف ملامح تتفق مع التشكل كرية كسورية.
نقدم وسيلة لدراسة الهندسة المعمارية 3 الابعاد من الجينوم عن طريق تعيين لونين التفاعلات بطريقة غير منحازة الجينوم واسعة. الخطوة الأكثر أهمية التجريبية ما يميز هذه التكنولوجيا وبصرف النظر عن الأعمال السابقة — هو إدماج biotinylated النيوكليوتيدات في تقييد نهايات crosslinked شظايا حادة قبل نهاية الربط. يمكن إجراء هذه الخطوة بنجاح تسلسل العميق لجميع التقاطعات الربط ، ويعطي مرحبا – C نطاقه وقوته.
فإن عدد القراءات تحدد في نهاية المطاف إلى حل للخرائط التفاعل. هنا ، قدم التفاعل ميغابايت 1 خريطة للجينوم البشري باستخدام ~ 30000000 يقرأ alignable. من أجل زيادة دقة "لجميع الأغراض" من قبل عامل من n ، يجب زيادة عدد القراءات بعامل ن 2.
قد يكون أسلوب مرحبا – C مجتمعة بسهولة مع تقنيات أخرى ، مثل التقاط الهجين بعد جيل مكتبة (لاستهداف أجزاء معينة من الجينوم) ، وبعد ربط مناعي لونين (لدراسة البيئة لونين من المناطق المرتبطة مع بروتينات معينة).
The authors have nothing to disclose.
نشكر ألف Kosmrlj للمناقشات ورمز ؛ AP ايدن ، وباو XR ، برينر M. ، D. المهرجانات ، جوسبر دبليو ، جعفر A. ، ميلينكوف A. ، ميلي A. ، Giannoukos G. ، Nusbaum C. ، AJM Walhout ، L. الخشب ، وZeldovich كاف للمناقشات ، ولام جافني وونغ باء للمساعدة في التصور.
بدعم من فاني ماي وجون هيرتز زمالة الدراسات العليا ، وهي مؤسسة الدفاع الوطنية للعلوم والهندسة زمالة للدراسات العليا ، وهو خريج الزمالة جبهة الخلاص الوطني ، واللجنة الوطنية للفضاء معهد البحوث الطبية الحيوية ، ومنحة لا. T32 HG002295 من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية (NHGRI) (EL) ؛ i2b2 (معلوماتية لإدماج الأحياء وسريري) ، والمعاهد الوطنية للصحة التي يدعمها مركز الحوسبة الحيوية الطبية في مستشفى بريجهام ومستشفى النساء ق (LAM) ؛ منحة لا. HG003143 من NHGRI ، ومؤسسة جائزة التميز كيك الباحث الشاب (دينار). وقد تم إيداع البيانات الخام وتعيين تسلسل مرحبا – C في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية ( www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) ، أي الانضمام. GSE18199. أميبا إضافية متوفرة في http://hic.umassmed.edu .
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Protease inhibitors | Sigma | P8340-5ml | Step 1.2 | |
biotin-14-dCTP | Invitrogen | 19518-018 | Step 1.6 | |
Klenow | NEB | M0210 | Steps 1.6 and 2.2 | |
T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224 | Step 1.9 | |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | Steps 1.17 and 2.2 | |
10x ligation buffer | NEB | B0202 | Steps 2.2 and 3.4 | |
T4 PNK | NEB | M0201 | Step 2.2 | |
Klenow (exo-) | NEB | M0212 | Step 2.3 | |
Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads | Invitrogen | 650.01 | Step 3.2 | |
T4 DNA ligase HC | Enzymatics | L603-HC-L | Step 3.5 | |
Phusion HF mastermix | NEB | F531 | Step 3.8 | |
Ampure beads | Beckman Coulter | A2915 | Step 3.9 |