Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

Published: May 6, 2010 doi: 10.3791/1869
Automatic Translation
*1, *2,3,4,5, *2, 6, 2, 3,6, 1, 2,7,8
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University, 5Department of Applied Mathematics, Harvard University, 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Hi-C metoden tillåter objektiva, genomet hela identifiering av kromatin interaktioner (1). Hi-C par närhet ligation och massivt parallella sekvensering. Den resulterande data kan användas för att studera genomiska arkitektur på flera skalor: första resultaten identifierade funktioner som kromosom territorier, segregering av öppna och slutna kromatin och kromatinstrukturen på megabase skala.

Abstract

Den tredimensionella vikning av kromosomer compartmentalizes genomet och och kan ge avlägsna funktionella element, såsom initiativtagare och medel, i nära rumslig närhet 2-6. Dechiffrera relationen mellan kromosom organisation och arvsmassan verksamhet kommer stödet att förstå genomiska processer som transkription och replikation. Dock är lite känt om hur kromosomerna gånger. Mikroskopi kan inte skilja stort antal loci samtidigt eller vid hög upplösning. Hittills krävs detektion av kromosomala interaktioner med Capture kromosom konformation (3C) och senare anpassningar valet av en uppsättning mål loci, vilket gör analyser över hela arvsmassan omöjligt 7-10.

Vi utvecklade Hi-C, en förlängning av 3C som kan identifiera långväga interaktioner i en opartisk, genomet hela mode. I Hi-C celler fixeras med formaldehyd, vilket gör att interagera loci att vara bundna till varandra med hjälp av kovalenta DNA-protein tvärbindningar. När DNA därefter är fragmenterad med en begränsning enzym, förblir dessa loci länkade. En biotinylerad rester ingår som 5 'överhäng fylls i. Därefter trubbig slut ligatur utförs under späd villkor som gynnar ligation händelser mellan tvärbunden DNA-fragment. Detta resulterar i en genomet hela bibliotek av ligation produkter, motsvarande par fragment som ursprungligen var i nära anslutning till varandra i kärnan. Varje ligatur produkt är märkt med biotin på platsen för korsningen. Biblioteket är klippt och korsningar dras ned med streptavidin pärlor. Det renade korsningar kan därefter analyseras med en hög genomströmning sequencer, vilket resulterar i en katalog av samverkande fragment.

Direkt analys av den resulterande kontakt matrisen visar många drag av genomiska organisationen, såsom förekomsten av kromosom territorier och förmånliga sammanslutning av små gen-rika kromosomer. Korrelationsanalys kan tillämpas på kontakten matris, som visar att det mänskliga genomet är uppdelade i två fack: ett mindre tätt packade fack som innehåller öppna, tillgängliga och aktiva kromatin och en tätare fack som innehåller slutna, otillgängliga, och inaktiva kromatin regioner. Slutligen avslöjade ensemble analys av kontakt matris, tillsammans med teoretiska härledningar och beräkningsmetoder simuleringar, att vid megabase skala Hi-C avslöjar funktioner förenlig med en fraktal globule konformation.

Protocol

Denna metod användes i forskningen redovisas i Lieberman-Aiden et al. 326 Science, 289-293 (2009) .

I. crosslinking, matsmältning, Märkning av DNA-ändar, och Blunt slut Ligation

  1. Hi-C börjar med crosslinking av celler, som är en röd tråd bland alla 3C-baserade metoder. Till att börja växa mellan 2 x 10 7 och 2,5 x 10 7 däggdjursceller, varken anhängare eller i suspension, och Crosslink cellerna. (För detaljer om broarna av celler, se: 11
  2. Lyse cellerna i 550 l lysisbuffer (500 l 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630 och 50 l proteashämmare) med hjälp av en homogeniseringsapparat. Snurra kromatin vid 5000 rpm och tvätta pellets två gånger med 500 l 1x NEBuffer 2.
  3. Resuspendera kromatin i 1x NEBuffer 2, uppmätt i 5 numrerade rör och tillsätt 1x NEBuffer 2 till en slutlig volym på 362 l. Tillsätt 38 l 1% SDS, blanda försiktigt och inkubera vid 65 ° C i 10 minuter. Placera rören tillbaka på isen direkt efter inkubation.
  4. Släck SDS genom att tillsätta 44 l Triton X-100 och blanda noga. Digest kromatinet genom att lägga till 400 enheter av HindIII och inkubera vid 37 ° C över natten vid rotation.
  5. Nästa steg är Hi-C specifika och inkluderar märkning DNA slutar med biotin och utför trubbig slut ligation av tvärbunden fragment. Detta steg kommer att tillåta ligering korsningar som skall renas senare. Rör 1 bör inte genomgå biotinylation steg och bör istället hållas åtskilda och fungera som en 3C kontroll för att säkerställa att matsmältningen, och ligation förhållandena var optimala.
  6. För att fylla i överhängen begränsning fragment och markera DNA slutar med biotin i de återstående 4 rör, tillsätt 1,5 l 10 mM dATP, 1,5 l 10 mM dGTP, 1,5 l 10 mM dTTP, 37,5 l 0,4 mM biotin-14-dCTP och 10 l 5U/μl Klenow att rören 2-5. Blanda försiktigt och inkubera i 45 minuter vid 37 ° C.
  7. Placera rören på is. För att inaktivera enzymer, lägga till 86 l 10% SDS att rören 1-5. Inkubera rören vid 65 ° C i exakt 30 minuter och lägg dem på is direkt efteråt.
  8. Den ligatur utförs under extremt späd villkor för att gynna ligation händelser mellan tvärbunden fragment. Arbeta på is, tillsätt 7,61 blanda ml ligation [745 l 10% Triton X-100, 745 l 10x ligation buffert (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mm MgCl 2, 100 mm DTT), 80 l 10 mg / ml BSA , 80 l 100 mM ATP och 5,96 ml vatten] för att var och en av fem numrerade 15 ml rör. Överför varje rötas kromatin blandningen till en motsvarande 15 ml rör.
  9. För regelbunden 3C ligation, tillsätt 10 l 1U/μl T4 DNA-ligas för att tub 1. För trubbig-end Hi-C ligation, tillsätt 50 l 1U/μl T4 DNA-ligas för att rören 2-5. Blanda genom att vända rören och inkubera alla 5 rör för 4 timmar vid 16 ° C.
  10. Antipyridinantikropp ombytta och protein bryts ned genom tillsats av 50 l 10 mg / ml proteinas K per rör och inkubera rören över natten vid 65 ° C. Lägg till ytterligare 50 l 10 mg / ml proteinas K per rör nästa dag och fortsätta inkubation vid 65 ° C i ytterligare 2 timmar.
  11. Kyl reaktionsblandningarna till rumstemperatur och överföra dem till fem 50 ml koniska rör. Rena DNA i dessa rör genom att utföra en fenol extraktion. Tillsätt 10 ml fenol pH 8,0 och skaka i 2 minuter. Spin rören i 10 minuter vid 3500 rpm och försiktigt överföra så mycket av vattenfas som möjligt till ett nytt 50 ml rör.
  12. Upprepa extraktionen med hjälp av fenol pH 8,0: kloroform (1:1) och fällningen DNA med etanol. (Mer information om DNA-rening, se: 11
  13. Efter centrifugering av etanol utfällda DNA, lös upp varje DNA pelleten i 450 l 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Överför DNA-blandningen till ett 1,7 ml centrifugrör.
  14. En ny omgång rening sker genom att göra 2 fenol: kloroform extraktioner. Tillsätt 500 l fenol pH 8,0: kloroform (1:1) och skaka i 1 minut. Centrifugera rören i 5 minuter vid 14.000 rpm och överföra vattenfasen till ett nytt rör. Efter den andra utvinning, fällning DNA genom att tillsätta 0,1 x volym NaOAc, 2x volym på 100% etanol och inkubera 30 minuter vid -80 ° C.
  15. Efter spinning ner fälls DNA, tvätta varje DNA-pellets med 70% etanol och återsuspendera varje DNA pelleten i 25 l 1x TE. Förnedra någon RNA som kan finnas genom att tillsätta 1 l 1 mg / ml RNAse A per rör och inkubera rören i 30 minuter vid 37 ° C. Pool Hi-C-innehållet i tuber 2-5, fortfarande hålla rör 1 separat som en 3C kontroll.
  16. Nu är ett bra tillfälle att undersöka Hi-C-märkning och ligering effektivitet. Dessa kontroller är utmärkta indikatorer på om en Hi-C-bibliotek kommer att bli framgångsrik.
    1. Att kontrollera kvaliteten och kvantiteten av bibliotek, kör 2 l och 6 l alikvoter av 1:10 utspädningar från både 3C och Hi-C-bibliotek på en 0,8% agarosgel. (Se Figur 2A)
    2. Hi-C-märkning och Hi-C ligation effektivitet kontrolleras av ett PCR smälta analys. Lyckad fylla i och ligation en HindIII plats (AAGCTT) skapar en plats för restriktionsenzymanalys NheI (GCTAGC). En särskild ligatur produkt bildas från två närliggande begränsning fragment förstärks med PCR (som i 3C 11 med 0,2 l av varje bibliotek som mall. PCR-produkterna därefter kokas med HindIII, NheI eller både och. Efter att ha kört prover på en 2% gel kan det relativa antalet 3C och Hi-C händelser ligation beräknas genom att kvantifiera intensiteten i snitt och uncut banden (se figur 2B).
  17. Några brottstycken inte har knyts ihop: att undvika att dra ner dem senare, ta bort biotin från dessa unligated slutar med exonuclease aktivitet T4 DNA-polymeras.
    1. Biotin-14-dCTP till icke-knyts ihop DNA slutar tas bort med exonuclease aktivitet T4 DNA-polymeras. Blanda 5 mikrogram av Hi-C-bibliotek med 1 l 10 mg / ml BSA, 10 l 10x NEBuffer 2, 1 l 10 mM dATP, 1 l 10 mM dGTP och 5 enheter T4 DNA-polymeras i en total volym på 100 l och inkubera blandningen vid 12 ° C i 2 timmar. Om möjligt är flera 5 mikrogram reaktioner utförs.
    2. Reaktionen stoppas genom att tillsätta 2 l 0,5 M EDTA pH 8,0.
    3. Att rena DNA, en fenol pH 8,0: kloroform (1:1) utvinning sker följt av etanol nederbörd.
    4. Supernatanten tas bort och DNA pellets är suspenderade och samlas i en total volym av 100 l vatten.

II. Klippning och storlek Urval

  1. För att göra biotinylerad DNA som lämpar sig för hög genomströmning sekvensering, måste DNA klippt till en storlek på 300-500 baspar med en Covaris S2 instrument (duty cycle 5, intensitet 5, cykler / brista 200, tid 60 sek under 4 cykler) .
  2. Att reparera klippt DNA ändar, lägg 14 l 10x ligation buffert, 14 l 2,5 mM dNTP mix, 5 l T4 DNA-polymeras, 5 l T4 polynucleotide kinas, 1 l Klenow DNA-polymeras och 1 l vatten. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.
  3. Efter inkubation, använd en Qiagen MinElute kolumn för att rena DNA enligt tillverkarens rekommendationer. Eluera DNA två gånger med 15 l 1x Tris-Low-EDTA (TLE: 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Sedan bifoga en dATP till 3 "ändar i slutet reparerade-DNA genom att lägga till 5 l 10x NEBuffer2, 10 l 1 mM dATP, 2 l vatten och 3 l Klenow (exo-). Inkubera reaktionen i 30 minuter vid 37 ° C.
  4. För att inaktivera Klenow fragment, inkubera de reaktioner i 20 minuter vid 65 ° C och därefter sval reaktionerna på is. Med hjälp av en speedvac, minska reaktionsvolym till 20 l.
  5. Därefter laddar DNA i en 1,5% agarosgel med 1X TAE och köra i 3,5 timmar vid 80-90V. Efter färgning av gelen med SYBR grön, visualisera DNA på en DarkReader. Punktskatter DNA-fragment mellan 300 och 500 par bas och rena dem med en Qiagen gel utvinning kit med 2-4 kolumner beroende på vikten av gelen. Eluera DNA med 50 l 1x TLE.
  6. Kombinera eluat från Qiaquick kolumner och få den slutliga volymen upp till 300 l med 1x TLE. Slutligen bestämma DNA-koncentration med Quant-IT-analysen med qubit fluorometer och beräkna den totala mängden DNA.

III. Biotin pull-down och parade slut Sequencing

  1. I detta avsnitt i protokollet, är ligation korsningar renas från DNA poolen, vilket möjliggör effektiv identifiering av interagerande kromatin fragment av parade slut sekvensering. Utför alla efterföljande steg i rören DNA LoBind.
  2. Förbered pärlor för biotin pull-down genom att tvätta 150 l återsuspenderad magnetiska streptavidin pärlor två gånger med 400 l Tween buffert (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween).
    Dessa och kommande tvättar består av fem steg:
    1. Lägg buffert för att kulorna
    2. Överför blandningen till ett nytt rör
    3. Rotera provet i 3 minuter vid rumstemperatur
    4. Reclaim kulorna med hjälp av en magnetisk partikel koncentrator
    5. Avlägsna supernatanten
  3. Resuspendera pärlor i 300 l 2x Nej Tween buffert (2x NTB: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) och kombinera med 300 l Hi-C-DNA. Låt biotin märkt Hi-C-DNA för att binda till streptavidin pärlor genom inkubering av blandningen i rumstemperatur i 15 minuter med rotation.
  4. Reclaim DNA bunden streptavidin pärlor med den magnetiska partiklar concentrratör och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlor i 400 l 1x NTB (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), följt av 100 l 1x ligering buffert. Resuspendera pärlor i 50 l 1x ligation buffert och överför blandningen till ett nytt rör.
  5. För att förbereda DNA för Illumina Paired End-sekvensering, ta den totala mängden DNA som används som input för biotin pull-down, som beräknades tidigare i steg 2,6, och dela det med 20 för att uppskatta mängden Hi-C-DNA som har dragits ner och finns tillgänglig för ligatur. Tillsätt 6 picomoles av Illumina Paired End-adaptrar per mikrogram av Hi-C DNA tillgängliga för ligatur. Använd 1200 enheter T4 DNA-ligas för att ligate adaptrarna till DNA. Inkubera 2 timmar vid rumstemperatur.
  6. Ta bort icke-knyts ihop Paired End-adaptrar som återvinna Hi-C-DNA bunden pärlor och tvätta pärlor två gånger med 400 l 1x TB.
  7. Tvätta pärlor med 200 l 1x NTB, följt av 200 l och 50 l 1x NEBuffer 2. Efter den sista tvättningen, resuspendera pärlor i 50 l 1x NEBuffer 2 och förflyttas till en ny tub.
  8. För att fastställa antalet cykler som krävs för att generera tillräckligt med PCR-produkt för sekvensering, inrätta fyra testa PCR-reaktioner med 6, 9, 12 eller 15 cykler. (För mer information om PCR-amplifiering, se: 12 fastställa den optimala cykeln numret genom att köra PCR-reaktioner på en 5% polyakrylamidgel och färgning med Sybr Green, garanterar frånvaron av falska band och närvaron av ett utstryk mellan 400 -. 600 baspar, vilket är längden på klippt produkter efter ligering med adaptrarna.
  9. Förstärk resten av Hi-C-bibliotek-bundet streptavidin pärlor i en storskalig PCR med det optimala antalet PCR-cykler. Pool PCR-produkter från olika brunnar och återta pärlor. Håll 1% av den storskaliga PCR-produkten separat för att köras på en gel och rena resten av PCR-produkten med 1,8 x volym Ampure pärlor enligt tillverkarens rekommendationer.
  10. Eluera DNA med 50 l 1x TLE buffert och jämföra 1% av Ampure pärla renade PCR-produkten till 1% delprov av ursprungliga PCR-produkten på en 5% polyakrylamidgel, se till att få bort av PCR-primers.
    1. Vi rekommenderar också kloning 1 ìl av Hi-C-biblioteket och bestämma produkten av ca 100 kloner med Sanger-sekvensering. Detta ger dig möjlighet att bedöma det relativa antalet alignable Hi-C läser i PCR-blandningen. För typiska resultat, se figur 3B.
  11. Sekvens Hi-C-bibliotek med Illumina parade slutet sekvensering. Passa in varje ände självständigt med MAQ (http://maq.sourceforge.net/) för att identifiera samverkande kromatin fragment.

IV. Representant Hi-C Resultat

  1. Följande resultat förväntas då Hi-C-protokollet körs tekniskt väl och kan betraktas som standarderna för kvalitetskontroll.
  2. Kvalitetskontroll steg bör avslöja att både 3C och Hi-C-bibliotek drivs som ganska tight band större än 10 kb. En DNA-smear indikerar dålig ligering effektivitet. Normalt är ligation verkningsgrad något lägre i ett Hi-C-biblioteket jämfört med ett 3C mall (se Figur 2A).
  3. Hi-C-märkning och ligation effektivitet kan uppskattas genom nedbrytning av en PCR-produkt som genererats med 3C grundfärger. 3C korsningar skärs av HindIII och inte av NheI. Det omvända gäller för Hi-C korsningar. Denna PCR smälta analys visar att 70% av Hi-C amplicons skärs av NheI och inte av HindIII, bekräftar effektiv märkning av ligation korsningar (se figur 2B).
  4. Analys av sekvenserade läser ska visa som läser från både intrachromosomal och interchromosomal interaktioner, vilket indikeras av den blå och röda linjer, anpassa betydligt närmare HindIII begränsning platser jämfört med slumpmässigt genererade läser, visas i grönt (se figur 3A).
  5. I ett lyckat experiment, 55% av de läste alignable paren representerar interchromosomal interaktioner. Femton procent representerar intrachromosomal interaktioner mellan fragment mindre än 20 kb isär och 30% är intrachromosomal läser par som är mer än 20 kb mellanrum (se figur 3B). Denna fördelning kan vara provtagning före till hög kapacitet sekvensering, som en form av kvalitetskontroll, kloning och Sanger-sekvensering av ca 100 kloner är vanligen tillräcklig.
  6. Den kromatin interaktioner kan visualiseras som en heatmap, där x-och y-axeln representerar loci i genomet ordning och varje pixel representerar antalet observerade interaktioner mellan dem. Vanligtvis kommer DNA-fragment som är mycket nära varandra i den linjära arvsmassan har en tendens att interagera ofta med varandra. Detta syns i intrachromosomal heatmaps som en framstående diagonal (se figur 4A).
  7. Följande resultat visar olika sätt att analysera uppgifterna för att avslöja olika nivåer i genomet organisation. Plottning kontakten probability kontra genomisk avstånd (se figur 5a) visar att sannolikheten för kontakt minskar som en funktion av genomisk avstånd, så småningom når en platå. Vid varje distans, är intrachromosomal interaktioner, som visas i den heldragna linjen, berikad förhållande till interchromosomal interaktioner, företrädd av de streckade linjerna. Detta innebär direkt närvaro av kromosom territorier.
  8. Beräkna den observerade / förväntade antalet interchromosomal kontakter mellan alla par av kromosomer avslöjar förmånliga samband mellan viss kromosom par. Små gen-rika kromosomer interagerar företrädesvis med varandra, indikeras med klarröd färg (se figur 5B).
  9. Individuella kromosomer kan också undersökas. Den råa heatmap kan justeras med en förväntad heatmap redogöra för genomisk avståndet mellan par av loci, vilket resulterar i en observerad / förväntas heatmap. Sedan kan en korrelationsmatris tas fram genom att korrelera de rader och kolumner av de observerade / förväntas heatmaps. Använda korrelationsanalys, är det visat att det mänskliga genomet segregerar i två fack. Detta illustreras av den rutiga-mönstret i samband heatmaps (Se figur 4A-D). (För mer information om Hi-C dataanalys, se: 1.
  10. Använda Hi-C data var nya insikter i kromatin vika vid megabase skala. Den klassiska modellen av polymer kondens tyder på att kromatin förpackningar till en jämvikt globule. Plottning kontakt sannolikheten som funktion av avstånd visar att skalorna kontakt sannolikheten som en makt lag med genomisk avståndet vars lutning är cirka -1 (se figur 6A). Detta är inte förenligt med beteendet hos en jämvikt globule, men stämmer förväntningar på en alternativ struktur som kallas fraktal globule (se figur 6B).
  11. Här är två klotformiga strukturer visas. Färg motsvarar avståndet från en endpoint, från blått till cyan, grön, gul, orange och rött (se figur 6C överst). Till skillnad från jämvikt globules, fraktal globules brist förvecklingar. I en fraktal globule, loci som ligger i närheten längs konturen tenderar att vara i närheten i 3D, vilket leder till förekomsten av monokromatisk block (se figur 6C mitten). Sådana block finns inte i jämvikt globule (se figur 6C botten).

Figur 1
Figur 1. Hi-C översikt. Celler är tvärbunden med formaldehyd, vilket resulterar i kovalenta länkar mellan rumsligt närliggande kromatin segment (DNA-fragment: mörkblå, röd, proteiner, som kan förmedla sådana interaktioner, visas i ljusblått och cyan). Kromatin kokas tillsammans med en begränsning enzym (här HindIII, begränsning sajt: streckad linje, se infälld). Den resulterande klibbiga slutar fylls i med nukleotider, varav en är biotinylerad (lila prick). Ligatur utförs under extremt utspädda förhållanden gynnar intramolekylära ligation händelser, det HindIII webbplats är förlorat och en NheI plats skapas (infälld). DNA renas och klippt och biotinylerad korsningar är isolerade med streptavidin pärlor. Samverkande fragment identifieras av parade slut sekvensering.

Figur 2
Figur 2. Hi-C-bibliotek kvalitetskontroller. (A) Ökande mängder av ett 3C kontroll och en Hi-C-bibliotek löstes på en 0,8% agarosgel. Båda biblioteken drivs som en ganska tight band större än 10 kb. Typiska ligatur effektivitet i ett Hi-C-biblioteket är något lägre än vad som observerats i ett 3C mall och indikeras med cellprov i Hi-C körfält. (B) PCR smälta kontroll. En ligatur trafikplats utgörs av två närliggande fragment förstärks med standard 3C PCR-förhållanden. Hi-C ligation produkter kan särskiljas från dem som produceras i konventionella 3C bearbetning av ligering sajten. Hi-C-korsningar skärs av NheI, inte HindIII, det omvända gäller för 3C korsningar. 70% av Hi-C amplicons sänktes med NheI, bekräftar effektiv märkning av ligering korsning. Två replikat gjordes för att säkerställa tillförlitlig kvantifiering.

Figur 3
Figur 3. Hi-C läser kvalitetskontroller. (A) Läser från fragment motsvarande både intrachromosomal (blå) och interchromosomal (röd) interaktioner anpassa betydligt närmare HindIII begränsning platser jämfört med slumpmässigt genererade läsningar (grön). Både intrachromosomal läser och interchromosomal läser kurvor minskar snabbt när avståndet från HindIII webbplatsen ökar tills en platå nås på ett avstånd av ~ 500 BP. Detta motsvarar den maximala fragment storlek används för sekvensering. (B) Normalt 55% av de läste alignable paren representerar interchromosomal interaktioner. Femton procent representerar intrachromosomal interaktioner mellan fragment mindre än 20 kbisär och 30% är intrachromosomal läser par som är mer än 20 kb isär. Denna fördelning kan vara provtagning före till hög kapacitet sekvensering, som en form av kvalitetskontroll, kloning och Sanger-sekvensering av ca 100 kloner är vanligen tillräcklig.

Figur 4
Figur 4. Korrelationsanalys visar att kärnan är uppdelade i två fack. (A) heatmap motsvarande intrachromosomal interaktioner på kromosom 14. Varje pixel representerar alla interaktioner mellan en 1-Mb lokus och en annan 1-Mb locus, intensitet motsvarar det totala antalet läsningar (intervall: 0-200 läsningar). Skalstreck visas varje 10 Mb. Den heatmap uppvisar underbyggnad i form av en intensiv diagonal och en konstellation av stora block. (Kromosom 14 är acrocentric,. Den korta armen visas inte) Använda Hi-C datasetet för att beräkna den genomsnittliga kontakta sannolikheten för ett par loci vid en viss genomisk avstånd, är en förväntan matris produceras (B), motsvarande vad som skulle vara iakttagits om det inte fanns några långsiktiga strukturer. Kvoten av dessa två matriser är ett observerat / förväntat matris (C) där utarmning visas i blått och anrikning i rött [intervall: 0,2 (blå) till 5 (röd)]. Blocket Mönstret blir tydligare. Den korrelationsmatris (D) visar korrelationen [område: -1 (blå) till 1 (röd)] mellan intrachromosomal Interaktionsprofilerna av varje par av loci längs kromosom 14. Den slående rutigt mönster indikerar förekomst av två fack i kromosom.

Figur 5
Figur 5. Förekomst och organisation av kromosom territorier. (A) Sannolikheten för kontakt minskar som en funktion av genomisk avstånd på kromosom 1, så småningom når en platå på ~ 90 MB (blå). Nivån på interchromosomal kontakt (svarta streck) skiljer sig för olika kromosompar, lokus på kromosom 1 är mest benägna att interagera med lokus på kromosom 10 (grön streck) och minst benägna att interagera med lokus på kromosom 21 (röda streck). Interchromosomal interaktioner är utfiskade förhållande till intrachromosomal interaktioner. (B) Observerat / förväntade antalet interchromosomal kontakter mellan alla par av kromosomer. Rött indikerar anrikning och blått indikerar utarmning [intervall: 0,5 (blå) till 2 (röd)]. Små, gen-rika kromosomer tenderar att interagera mer med varandra.

Figur 6
Figur 6. Lokala förpackning av kromatin är förenlig med beteendet hos en fraktal globule. (A) Kontakt sannolikheten som en funktion av genomisk avstånd, i genomsnitt över hela arvsmassan (blå). En framstående strömmen lag skalning ses mellan 500KB och 7Mb (skuggade området) med en lutning på -1,08 (passar visas i cyan). (B) Simulering resultat för kontakt sannolikheten som funktion av avstånd för jämvikt (röd) och fraktala (blå) fettkulor. Lutningen för en fraktal globule är mycket nära -1 (cyan), vilket bekräftar vår nya teoretiska förutsägelse 1. Lutningen för en jämvikt globule är -3 / 2, vilket motsvarar tidigare teoretiska förväntningar. Lutningen för fraktal globule liknar den lutningen som observerats i Hi-C-resultat, medan lutningen för en jämvikt globule inte syns i Hi-C data. (C) Top: En ovikt polymerkedja, 4000 monomerer lång. Färg motsvarar avståndet från en endpoint, från blått till cyan, grönt, gult, orange och rött Mitten:. Typiska exempel på en fraktal globule hämtade från vår ensemble. Fractal globules saknar förvecklingar. Loci som ligger i närheten längs konturen tenderar att vara i närheten i 3D, vilket leder till förekomsten av stora enfärgade block som är synliga på ytan och i tvärsnitt Botten:. En jämvikt globule. Strukturen är mycket intrasslad, loci som ligger i närheten längs konturen (liknande färg) behöver inte vara i närheten i 3D.

Discussion

Vi presenterar en metod för att studera den 3-dimensionella strukturen av genomet genom att kartlägga kromatin interaktioner i en opartisk, Genomvid sätt. De mest kritiska experimentella steget vad som skiljer denna teknik bortsett från tidigare arbeten - är införlivandet av biotinylerad nukleotider vid begränsningen ändarna av tvärbunden fragment innan trubbig slut ligatur. Utföra detta steg framgångsrikt möjliggör djup sekvensering av alla ligation korsningar, och ger Hi-C dess omfattning och styrka.

Antalet läsningar i slutändan kommer att avgöra upplösningen av interaktionen kartor. Här är en 1 Mb interaktion kartan för den mänskliga arvsmassan presenteras med hjälp av ~ 30 miljoner alignable läser. För att öka "all-purpose" upplösning med en faktor n, måste antalet läsningar ökas med en faktor n 2.

Hi-C tekniken kan lätt kombineras med andra tekniker, såsom hybrid capture efter bibliotek generationen (för att rikta specifika delar av genomet) och kromatin immunoprecipitation efter ligatur (att undersöka kromatinet miljön i områden associerade med specifika proteiner).

Disclosures

En preliminär patent på Hi-C-metoden (nr 61/100, 151) är under översyn.

Acknowledgments

Vi tackar A. Kosmrlj för diskussioner och kod, AP Aiden, XR Bao, M. Brenner, D. galor, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout , L. Wood, och K. Zeldovich för diskussioner, och L. Gaffney och B. Wong för hjälp med visualisering.

Med stöd av en Fannie och John Hertz Foundation examen gemenskap, en National Defense Science and Engineering examen gemenskap, en NSF examen gemenskap, National Space Biomedical Research Institute, och ge nej. T32 HG002295 från National Human Genome Research Institute (NHGRI) (EL), i2b2 (Informatik för att integrera biologi och sängen), NIH-stödda Center for Biomedical Computing vid Brigham and Women s Hospital (LAM), bidrag nr. HG003143 från NHGRI och en Keck stiftelsen framstående unga forskare Award (JD). Raw och kartlagt Hi-C sekvens data har deponerats vid GEO-databasen ( www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ), anslutning nr. GSE18199. Ytterligare visualiseringar finns på http://hic.umassmed.edu .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease inhibitors Sigma-Aldrich P8340-5ml Step 1.2
biotin-14-dCTP Invitrogen 19518-018 Step 1.6
Klenow New England Biolabs M0210 Steps 1.6 and 2.2
T4 DNA ligase Invitrogen 15224 Step 1.9
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203 Steps 1.17 and 2.2
10x ligation buffer New England Biolabs B0202 Steps 2.2 and 3.4
T4 PNK New England Biolabs M0201 Step 2.2
Klenow (exo-) New England Biolabs M0212 Step 2.3
Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads Invitrogen 650.01 Step 3.2
T4 DNA ligase HC Enzymatics L603-HC-L Step 3.5
Phusion HF mastermix New England Biolabs F531 Step 3.8
Ampure beads Beckman Coulter Inc. A2915 Step 3.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  2. Kosak, S. T., Groudine, M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).
  3. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (2007).
  4. Dekker, J. Gene Regulation in the Third Dimension. Science. 319, 1793-1794 (2008).
  5. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).
  6. Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. Gene regulation through nuclear organization. Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).
  7. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  8. Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).
  9. Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).
  10. Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).
  11. Miele, A., Dekker, J. Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C). Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).
  12. Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads. Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).

Tags

Cellbiologi kromosom konformation fånga kromatinstrukturen Illumina Paired End-sekvensering polymer fysik.
Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Berkum, N. L., Lieberman-Aiden,… More

van Berkum, N. L., Lieberman-Aiden, E., Williams, L., Imakaev, M., Gnirke, A., Mirny, L. A., Dekker, J., Lander, E. S. Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.. J. Vis. Exp. (39), e1869, doi:10.3791/1869 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter