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Biology

डीएनए आधारित मछली प्रजाति पहचान प्रोटोकॉल

Published: April 28, 2010 doi: 10.3791/1871

Summary

इस प्रकाशन का वर्णन कैसे Agilent मछली प्रजाति पहचान प्रणाली का उपयोग करने के लिए डीएनए निकालने और पीसीआर और RFLP विश्लेषण के प्रदर्शन के द्वारा एक मछली की प्रजातियों की पहचान है.

Abstract

हम एक तेज, सरल और सटीक डीएनए आधारित स्क्रीनिंग मछली ताजा और प्रसंस्कृत समुद्री भोजन के नमूने में मौजूद प्रजातियों की पहचान विधि विकसित किया है. इस बहुमुखी जीनोमिक डीएनए, मछली के नमूने से निकाले प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता विश्लेषण (RFLP) द्वारा पीछा करने के लिए कि Agilent Bioanalyzer 2100 पर हल किया जा सकता है और सही RFLP पैटर्न मिलान सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रजातियों करने के लिए मिलान टुकड़ा पैटर्न उत्पन्न की पीसीआर प्रवर्धन विधि कार्यरत हैं.

मछली पहचान विधि एक सरल, विश्वसनीय, स्पिन स्तंभ आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है मछली नमूनों से डीएनए अलग. नमूने proteinase कश्मीर के साथ व्यवहार कर रहे हैं समाधान में न्यूक्लिक एसिड जारी है. डीएनए तो बंधन बफर में नमूना निलंबित और एक स्पिन माइक्रो सिलिका आधारित एक फाइबर मैट्रिक्स युक्त कप पर लोड करके अलग है. नमूना फाइबर मैट्रिक्स करने के लिए बाध्य में न्यूक्लिक एसिड. immobilized nucleic एसिड contaminants को दूर धो रहे हैं, और कुल डीएनए 100 μl के अंतिम मात्रा में बरामद किया है. पृथक डीएनए प्रदान प्राइमरों कि सभी मछली जीनोम में पाया दृश्यों के लिए बाध्य के साथ पीसीआर प्रवर्धन के लिए तैयार है. पीसीआर उत्पादों को फिर तीन विभिन्न प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा रहे हैं और Agilent Bioanalyzer 2100 पर हल. पाचन प्रतिक्रियाओं में उत्पादित टुकड़ा लंबाई मछली की प्रजातियों में से जो डीएनए नमूना तैयार किया गया था निर्धारित करने के लिए, RFLP प्रयोगात्मक व्युत्पन्न व्यावसायिक रूप से प्रासंगिक मछली प्रजातियों से RFLP पैटर्न के एक डेटाबेस युक्त सॉफ्टवेयर मिलान पैटर्न का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

1: डीएनए निष्कर्षण के लिए मछली नमूने तैयार

  1. प्रत्येक मछली करने के लिए परीक्षण किया जा नमूना के लिए, मछली ऊतक का एक टुकड़ा जगह है, एक एकल microcentrifuge 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीग्राम और 1 जी (कच्चे या पकाया) के बीच वजन,. एक कच्ची मछली नमूना आकार के आधार पर नमूने के वजन का आकलन करने के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में आंकड़ा नीचे का प्रयोग करें.

    1 आंकड़ा
    चित्रा 1. मछली नमूने मास estimations नमूना आकार के आधार पर.

  2. पूर्व गर्म proteinase कश्मीर पाचन 65 बफर डिग्री सेल्सियस एक मशीन या पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए.
  3. Proteinase कश्मीर के proteinase कश्मीर पाचन बफर और नमूना प्रति proteinase कश्मीर के 20 μl के 200 μl के संयोजन के द्वारा एक काम समाधान तैयार है.
    नोट: प्रत्येक का उपयोग करने से पहले काम कर proteinase कश्मीर के एक ताजा समाधान तैयार करें.
  4. Proteinase कश्मीर काम कर मछली के नमूने के प्रत्येक ट्यूब 1.5 मिलीलीटर के लिए समाधान के 220 μl जोड़ें. 65 में ट्यूब सेते डिग्री सेल्सियस एक मशीन या पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए.
  5. 3 +१४,००० पर 5 मिनट गोली किसी भी पचाया नहीं ऊतकों को XG के लिए एक microcentrifuge में ट्यूबों स्पिन.
  6. एक ताजा ट्यूब 1.5 मिलीलीटर में प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के 150 μl स्थानांतरण ट्यूब या किसी भी तेल सामग्री है कि ट्यूब के शीर्ष पर मौजूद हो सकता है के नीचे से किसी भी पचाया नहीं सामग्री के हस्तांतरण से बचें. सतह पर तैरनेवाला के इन ट्यूबों के नमूने हैं जो जीनोमिक से डीएनए निकाला जाएगा.

2: जीनोमिक डीएनए निकालें

  1. एक बाँझ कंटेनर (polypropylene ट्यूब या कांच की बोतल) में, 90% sulfolane के 320 μl और नमूना प्रति न्यूक्लिक एसिड बंधन बफर के 170 μl के संयोजन के द्वारा sulfolane और न्यूक्लिक एसिड बंधन बफर के एक काम समाधान तैयार है.
    आप इस मिश्रण की एक पर्याप्त मात्रा में तैयार के रूप में कई नमूने के रूप में आप अगले 4 हफ्तों के भीतर जांच करने की योजना प्रक्रिया के लिए चाहते हो सकता है. इस मिश्रण को 30 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है . भंडारण के दौरान प्रकाश के मिश्रण को उजागर करने से बचें.
  2. प्रत्येक मछली नमूने के sulfolane / बाध्यकारी बफर मिश्रण (ऊपर चरण 1 में तैयार) के 490 μl जोड़ें. भंवर या जब तक बार - बार homogenized नमूना pipet. इस मिश्रण के अलावा प्रत्येक नमूने की कुल मात्रा 640 μl लाएगा.
  3. एक डीएनए बाध्यकारी स्पिन कप कि एक डब्बा 2 मिलीलीटर ट्यूब के भीतर बैठा है (बशर्ते) और स्पिन कप के शीर्ष पर ट्यूब की टोपी तस्वीर प्रत्येक नमूना स्थानांतरण.
  4. 14,000 XG पर 1 मिनट के लिए एक microcentrifuge में नमूने स्पिन स्पिन कप मैट्रिक्स पर डीएनए लोड.
  5. निकालें और स्पिन कप को बनाए रखने और filtrates त्यागें. प्रत्येक नमूने के लिए, ट्यूब गोदाम में स्पिन कप की जगह है, तो 1x उच्च नमक धो बफर के 500 μl जोड़ने और ट्यूब टोपी.
  6. 1 मिनट के लिए 14,000 XG microcentrifuge में नमूने स्पिन.
  7. निकालें और स्पिन कप को बनाए रखने और filtrates त्यागें. प्रत्येक नमूने के लिए, ट्यूब गोदाम में स्पिन कप की जगह है, तो 80% इथेनॉल 500 μl जोड़ने और ट्यूब टोपी.
  8. 1 मिनट के लिए 14,000 XG microcentrifuge में नमूने स्पिन.
  9. 80% इथेनॉल के 500 μl के साथ 3 washes के एक कुल के लिए चरण 7 और 8 दो से अधिक बार दोहराएँ.
  10. 80% इथेनॉल में तीसरे धोने के बाद निकालने के लिए, और स्पिन कप को बनाए रखने और filtrates त्यागें. अपने गोदाम ट्यूबों में स्पिन कप बदलें और 14,000 XG पर 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में स्पिन करने के लिए फाइबर मैट्रिक्स सूखी.
  11. 1.5-M1 संग्रह ट्यूबों स्पिन कप स्थानांतरण. प्रत्येक स्पिन कप के लिए फाइबर मैट्रिक्स अंदर कप पर सीधे Elution बफर के 100 μl जोड़ें. स्पिन कप संग्रह ट्यूब की टोपी पर स्नैप और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  12. 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक microcentrifuge में नमूने स्पिन.
  13. शुद्ध डीएनए microcentrifuge ट्यूब में Elution बफर में है. स्पिन कप त्यागें और ट्यूबों टोपी. डीएनए 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है एक महीने के लिए. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 20 में डीएनए की दुकान डिग्री सेल्सियस या 80 डिग्री सेल्सियस
  14. अगर वांछित, तुम एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में डीएनए नमूनों की एकाग्रता को मापने हो सकता है.

जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल आमतौर पर एक 5 से एनजी / μl 500 एनजी / μl लेकर एकाग्रता के साथ नमूने की पैदावार है. पीसीआर - RFLP प्रोटोकॉल डीएनए नमूने लेकर कहीं भी 0.05 से एनजी / μl 2000 / एनजी μl के साथ कुओं से काम करता है.

3: सेट पीसीआर प्रतिक्रियाओं

  1. डीएनए शेयर के 8 μl बाँझ, DNase मुक्त पानी के 32 μl के साथ संयोजन के द्वारा सकारात्मक नियंत्रण सामन डीएनए के एक 50 एनजी / μl कमजोर पड़ने को तैयार. मिश्रण भंवर.
    पतला नमूना 4 डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  2. क्रम में नीचे तालिका में घटकों के संयोजन द्वारा तैयार प्रतिक्रियाओं. सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं है कि में सूचीबद्ध मात्रा स्केलिंग द्वारा एक साथ चलेंगे के लिए एक एकल अभिकर्मक मिश्रण तैयारतालिका. परीक्षण डीएनए नमूनों के अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया और एक नियंत्रण कोई टेम्पलेट प्रतिक्रिया शामिल हैं. तैयारी प्रत्येक परीक्षण डीएनए नमूने के लिए डुप्लिकेट पीसीआर प्रतिक्रियाओं की सिफारिश की है. आपके सभी प्रतिक्रियाओं से अधिक एक प्रतिक्रिया मात्रा अधिक के लिए पर्याप्त अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें.
    उदाहरण के लिए, अगर आप 5 परीक्षण डीएनए नमूने है, तो या तो 8 (5 परीक्षण प्रतिक्रियाओं, 1 सकारात्मक नियंत्रण, 1 नियंत्रण कोई टेम्पलेट, और एक अतिरिक्त) प्रतिक्रियाओं या 13 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त अभिकर्मक मिश्रण तैयार अगर आप परीक्षण प्रतिक्रियाओं का डुप्लिकेट सहित हैं (10 डुप्लिकेट परीक्षण प्रतिक्रियाओं, 1 सकारात्मक नियंत्रण, एक नियंत्रण कोई टेम्पलेट और एक अतिरिक्त).
    पीसीआर अभिकर्मक मिश्रण
    घटक 1 रिएक्शन वॉल्यूम 5 प्रतिक्रियाओं वॉल्यूम
    DH 2 हे, बाँझ 9 μl 45 μl
    2x पीसीआर मास्टर मिक्स 12.5 μl 62.5 μl
    प्राइमर मिक्स 2.5 μl 12.5 μl
    कुल मात्रा 24 μl 120 μl
  3. भंवर अभिकर्मक मिश्रण अच्छी तरह से तो, प्रत्येक व्यक्ति पतली दीवारों पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब 24 μl वितरित.
  4. सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्यूब पतला सकारात्मक नियंत्रण डीएनए के एक μl जोड़ें. परीक्षण के नमूने ट्यूबों के लिए, परीक्षण डीएनए नमूने के 1 μl जोड़ें. नियंत्रण नहीं टेम्पलेट प्रतिक्रिया के लिए डीएनए के स्थान पर 1 DNase मुक्त पानी के μl जोड़ने.
    पार संक्रमण से बचने के लिए, प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए एक ताजा pipet टिप का उपयोग करें. नमूना जोड़ने के बाद, जल्दी ट्यूब की सामग्री pipetting ऊपर और नीचे के द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण .
  5. कैप प्रतिक्रिया ट्यूबों, भंवर ट्यूबों मिश्रण और ट्यूबों अपकेंद्रित्र संक्षेप.

4: पीसीआर प्रोटोकॉल भागो

  1. थर्मल cycler प्रतिक्रियाओं में प्लेस और पीसीआर नीचे दिखाया कार्यक्रम चलाते हैं.
    पीसीआर साइकल चलाना प्रोटोकॉल
    खंड चक्रों की संख्या तापमान अवधि
    1 1 95 ° C 5 मिनट
    2 40 95 ° C
    50 ° C
    72 ° C
    30 सेकंड
    30 सेकंड
    30 सेकंड
    3 1 72 ° C 7 मिनट

5: प्रतिबंध एंजाइमों के साथ डाइजेस्ट पीसीआर उत्पाद

  1. लेबल 0.5 मिलीलीटर ट्यूब या 0.2 मिलीलीटर पट्टी ट्यूबों कि प्रतिबंध पचाने में प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं. DdeI HaeIII, और NlaIII: प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया तीन विभिन्न प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा जाएगा. इसलिए, प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर नमूना के नाम पर और प्रतिबंध एंजाइम के नाम के साथ तीन अलग ट्यूबों लेबल.
  2. DdeI digestions के लिए घटकों के क्रम में नीचे के संयोजन द्वारा अभिकर्मक मिश्रण तैयार सभी DdeI पाचन (प्लस कम से कम एक प्रतिक्रिया मात्रा अधिक) प्रतिक्रियाओं प्रत्येक घटक के गुणकों का उपयोग कर के लिए एक एकल अभिकर्मक मिश्रण तैयार है. एक बार पीसीआर पूरा हो गया है, पीसीआर प्रतिक्रियाओं प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता विश्लेषण (RFLP) के लिए प्रतिबंध एंजाइमों के साथ व्यवहार कर रहे हैं.
    DdeI पाचन अभिकर्मक मिश्रण
    घटक आयतन
    DH 2 हे, बाँझ 1.5 μl
    10x DdeI बफर 0.5 μl
    10x DdeI एंजाइम 0.5 μl
  3. भंवर अभिकर्मक मिश्रण अच्छी तरह से तो, व्यक्तिगत प्रतिक्रिया ट्यूब है कि DdeI के लिए लेबल किए गए 2.5 μl वितरित.
  4. HaeIII digestions के लिए घटकों के क्रम में नीचे के संयोजन द्वारा अभिकर्मक मिश्रण तैयार सभी HaeIII पाचन (प्लस कम से कम एक प्रतिक्रिया मात्रा अधिक) प्रतिक्रियाओं प्रत्येक घटक के गुणकों का उपयोग कर के लिए एक एकल अभिकर्मक मिश्रण तैयार है.
    HaeIII पाचन अभिकर्मक मिश्रण
    घटक आयतन
    DH 2 हे, बाँझ 1.5 μl
    10x HaeIII बफर 0.5 μl
    10x HaeIII एंजाइम 0.5 μl
  5. भंवर अभिकर्मक मिश्रण अच्छी तरह से तो, व्यक्तिगत प्रतिक्रिया ट्यूब है कि HaeIII के लिए लेबल किए गए 2.5 μl वितरित.
  6. के लिए अभिकर्मक मिश्रण तैयारघटकों के क्रम में नीचे के संयोजन के द्वारा NlaIII digestions. सभी NlaIII पाचन (प्लस कम से कम एक प्रतिक्रिया मात्रा अधिक) प्रतिक्रियाओं प्रत्येक घटक के गुणकों का उपयोग कर के लिए एक एकल अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें.
    NlaIII पाचन अभिकर्मक मिश्रण
    घटक आयतन
    DH 2 हे, बाँझ 1.5 μl
    10x NlaIII बफर 0.5 μl
    10x NlaIII एंजाइम 0.5 μl
  7. भंवर अभिकर्मक मिश्रण अच्छी तरह से तो, व्यक्तिगत प्रतिक्रिया ट्यूब है कि NlaIII के लिए लेबल किए गए 2.5 μl वितरित.
  8. प्रत्येक पाचन प्रतिक्रिया के लिए, लेबल ट्यूबों के लिए उपयुक्त पीसीआर उत्पाद के 2.5 μl जोड़ने. परीक्षण पीसीआर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाओं के सभी के लिए सभी तीन प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा की जरूरत है.
  9. भंवर पाचन प्रतिक्रियाओं और फिर संक्षिप्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  10. 37 ° 2 घंटे के लिए सी सब पाचन प्रतिक्रियाओं सेते हैं. यह ऊष्मायन थर्मल cycler में किया जा सकता है. अगर वांछित, प्रतिक्रियाओं 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर छोड़ा जा सकता है है.
  11. 65 ° 15 मिनट के लिए सी प्रतिक्रियाओं स्थानांतरण. यह कदम थर्मल cycler में किया जा सकता है.
  12. प्रत्येक प्रतिक्रिया और भंवर में अच्छी तरह से करने के लिए 60 मिमी EDTA (किट के साथ प्रदान की) 1 μl जोड़ें.

6: प्रतिबंध पचाने में पैटर्न का विश्लेषण

  1. जेल - डाई मिश्रण तैयार करने के लिए, चिप भड़काना स्टेशन पर एक डीएनए चिप जगह है, और डीएनए चिप पर मिश्रण लोड.
  2. Pipet में अच्छी तरह से सीढ़ी प्रतीक के साथ और 12 चिप पर कुओं का नमूना प्रत्येक में चिह्नित 5 डीएनए मार्कर के μl.
    डीएनए मार्कर डीएनए हरी छाया एक ट्यूब में 1000 अभिकर्मक किट में प्रदान की जाती है.
  3. Pipet में अच्छी तरह से एक सीढ़ी प्रतीक के साथ चिह्नित 1 डीएनए सीढ़ी के μl.
    डीएनए सीढ़ी डीएनए एक पीले रंग की छाया ट्यूब में 1000 अभिकर्मक किट में प्रदान की जाती है.
  4. डीएनए नमूनों में से प्रत्येक के लिए, pipet 12 चिप पर नमूना नीचे दिए गए आंकड़े में दिशा निर्देशों के अनुसार कुओं में से एक के रूप में प्रत्येक प्रतिबंध पचाने में प्रतिक्रिया के एक μl. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, कुओं 1-3 सकारात्मक नियंत्रण के नमूने के लिए 3 प्रतिक्रियाओं का पाचन के लिए कर रहे हैं, कुओं 4-6 3 परीक्षण एक नमूना, 7-9 कुओं के लिए प्रतिक्रियाओं का पाचन के लिए परीक्षण नमूना 2 के लिए 3 प्रतिक्रियाओं का पाचन के लिए कर रहे हैं, और कुओं 10-12 3 नमूने के परीक्षण के लिए पाचन के दौरान उत्पादन टुकड़ा लंबाई निर्धारित Agilent Bioanalyzer 2100 पर प्रतिबंध पचाने में प्रतिक्रियाओं 3.Analyze पाचन प्रतिक्रियाओं के लिए कर रहे हैं. Agilent डीएनए 1000 किट गाइड Bioanalyzer पर प्रयोगशाला चिप्स चलाने के लिए पूर्ण निर्देश दिया है. एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल नीचे अपनी सुविधा के लिए प्रदान की जाती है.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. चिप पर नमूने के संगठन.

    यदि आप अप्रयुक्त कुओं में कम से कम 4 डीएनए नमूने, पानी की एक μl pipet है. यदि आप 4 डीएनए नमूनों की तुलना में अधिक है, आप एक से अधिक चिप को चलाने की आवश्यकता होगी. नोट है कि यह आवश्यक करने के लिए हर चिप पर सकारात्मक नियंत्रण के नमूने को चलाने के नहीं है.
  5. IKA भंवर मिक्सर और 2400 rpm पर 60 सेकंड के लिए भंवर के एडाप्टर में चिप क्षैतिज प्लेस.
  6. सम्मिलित Agilent Bioanalyzer 2100 में चिप और चिप चलाना शुरू. आने वाले कच्चे संकेतों साधन संदर्भ में प्रदर्शित कर रहे हैं.
    रन के बाद समाप्त हो गया है, चोटियों सभी चोटी के सेटिंग्स का उपयोग एल्गोरिथ्म खोजने के नमूने के लिए पहचाने जाते हैं . यदि आपको लगता है कि एल्गोरिथ्म के लिए एक वास्तविक चोटी का पता लगाने में नाकाम रही है, आप एक मूल्य है कि एल्गोरिथ्म चोटी की पहचान करने की अनुमति देता ऊँचाई थ्रेसहोल्ड setpoint कम हो सकती है.
  7. परख संदर्भ करने के लिए जाओ और चिप सारांश टैब का चयन करें. नमूना नाम फ़ील्ड में, चिप पर सभी 12 कुओं के रूप में नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाया के लिए एक नमूना नाम दर्ज करें.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. नमूना चिप सारांश टैब में नाम प्रविष्टि.

7: परीक्षण नमूना RFLP matcher का उपयोग प्रजातियों को पहचानें

Agilent सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग RFLP विकोडक परीक्षण डीएनए पाचन प्रतिक्रियाओं में उत्पादित टुकड़ा लंबाई पर आधारित नमूने के लिए मछली प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है टेबल 7 सकारात्मक नियंत्रण प्रतिबंध एनजाइम उम्मीद उत्पाद (बीपी) के आकार 117 DdeI में उम्मीद डीएनए टुकड़ा आकार , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333, 459 NlaIII निर्देशों यहाँ प्रदान RFLP matcher विश्लेषण में डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें. सॉफ्टवेयर की मदद प्रणाली के लिए सॉफ्टवेयर और ऑपरेटिंग प्रदर्शन की व्याख्या पर विस्तृत जानकारी के लिए संदर्भ लें.

  1. RFLP विकोडक प्रोग्राम लॉन्च करें.
  2. फ़ाइल फ़ाइल> ओपन> XAD क्लिक करें.
    खोलें संवाद बॉक्स wilएल खोलने के.
  3. कि प्रतिबंध पचाने में प्रतिक्रियाओं शामिल डीएनए चिप के लिए XAD फ़ाइल का चयन करें. खोलें क्लिक करें.
    नमूने है कि चिप पर लोड थे लिस्टिंग एक संवाद बॉक्स खुलेगा.
  4. तीन पाचन एक डीएनए नमूने के लिए संगत प्रतिक्रियाओं का चयन करें और प्रत्येक नमूना के लिए ड्रॉप - डाउन एनजाइम स्तंभ के तहत मेनू का उपयोग कर उचित प्रतिबंध एंजाइम निर्दिष्ट करें. नीचे के चित्र में, एनजाइम स्तंभ डीएनए नमूना 1 के लिए भरे किया गया है.

    आंकड़ा 4
    चित्रा 4. प्रत्येक नमूना के लिए प्रतिबंध एनजाइम निर्दिष्ट.

  5. मिनट चोटी ऊंचाई कम "मार्कर% के रूप में लेबल क्षेत्र में, डिफ़ॉल्ट मान 10.0% है, यदि आवश्यक हो, तो यह मान छोटे चोटियों है कि चूक गया था की पहचान उतारा जा सकता है, या गैर विशिष्ट शोर से उत्पन्न चोटियों त्यागें उठाया. electropherogram. मिनट चोटी ऊंचाई मूल्य के लिए किसी भी समायोजन करने के बाद reintegrate क्लिक करें .

    चित्रा 5
    चित्रा 5. न्यूनतम पीक ऊँचाई नियत.

  6. Calc संवाद बॉक्स के नीचे क्लिक करें.
    टुकड़ा लंबाई Bioanalyzer रन से प्राप्त आंकड़ों सॉफ्टवेयर क्षेत्रों बसाना होगा.
  7. स्क्रीन के ऊपरी बाएँ कोने में स्कोर ड्रॉप - डाउन सूची में, डेटा के विश्लेषण के लिए उपयुक्त एल्गोरिथ्म का चयन करें. अगर मछली नमूना विश्लेषण किया जा रहा है एक मछली प्रजातियों के होते हैं, स्कोर ड्रॉप - डाउन सूची में पासा (Nei ली) का चयन करें. यदि नमूने प्रजातियों में से एक मिश्रण से मिलकर कर सकते हैं, मिश्रण का चयन करें .
    स्क्रीन के नीचे तालिका लेबल संयुक्त स्कोर सर्वश्रेष्ठ मिलान प्रजातियों सभी तीन पाचन प्रतिक्रियाओं के परिणाम के आधार पर सूचीबद्ध करता है. प्रजाति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आम नाम नाम तालिका में सूचीबद्ध हैं (नीचे देखें). परफेक्ट मैचों (1 के स्कोर के साथ उन लोगों) हरे रंग में हाइलाइट किया जाता है. मेल खाता पीले रंग में प्रकाश डाला मैचों के निकट माना जाता है. आप एक प्रजाति के नाम पर डबल - क्लिक कर सकते हैं कि प्रजातियों के लिए फिशबेस वेबपेज लाने.

    6 आंकड़ा
    चित्रा 6. प्रजातियों की पहचान के पाचन के आधार पर.

  8. कम है और स्क्रीन के शीर्ष पर cutoff मैच सहिष्णुता क्षेत्रों में, आप डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स समायोजित करने के लिए सबसे अच्छा प्रजातियों मैच के स्कोर में सुधार हो सकता है. कम cutoff के मूल्य के छोटे टुकड़े से किसी भी क्षेत्र में नामित लंबाई से त्यागने के लिए प्रयोग किया जाता है. मैच सहिष्णुता मूल्य निर्धारित करता है कैसे बंद लंबाई में एक टुकड़ा भविष्यवाणी टुकड़ा के लिए एक मैच पर विचार किया जा करने के लिए किया जाना चाहिए.
  9. दोहराएँ 8 के माध्यम से शेष डीएनए नमूने है कि यह एक ही चिप पर शामिल थे के लिए 4 कदम.

8: प्रतिनिधि परिणाम:

प्रतिबंध 4 विभिन्न मछली प्रजातियों से पचाने में नमूने के साथ एक Bioanlyzer जेल की एक छवि नीचे दिए गए आंकड़े में दिखाया गया है. सकारात्मक डीएनए नमूने के लिए उम्मीद परिणाम नीचे दी गई तालिका में संक्षेप हैं.

7 आंकड़ा
7 चित्रा. Bioanalyzer प्रतिबंध पचाने में प्रतिक्रिया नमूने की जेल छवि. प्रत्येक जेल लेन प्रतिबंध है कि प्रतिक्रिया में इस्तेमाल एंजाइम के साथ लेबल है.

सामन सकारात्मक नियंत्रण में उम्मीद डीएनए टुकड़ा आकार

8 आंकड़ा
8 चित्रा. सामन सकारात्मक नियंत्रण में उम्मीद डीएनए टुकड़ा आकार.

Discussion

हम एक सरल, तेजी से और सटीक समुद्री खाद्य उत्पादों में मछली प्रजातियों की पहचान के लिए डीएनए आधारित स्क्रीनिंग विधि प्रदर्शित करता है. इस शक्तिशाली विधि कम से कम एक दिन काम में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक परिणाम प्रदान करता है और यह वाणिज्यिक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल और साधारण सेटअप के कारण परीक्षण सुविधाओं में कार्यान्वित किया जा सकता है. यह उद्देश्य डेटा है कि प्रयोगात्मक व्युत्पन्न मछली प्रजातियों प्रोफाइल के एक विस्तार योग्य डेटाबेस के साथ RFLP विकोडक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है की पीढ़ी की विशेषता है.

दिनचर्या कार्यान्वयन के साथ, इस परीक्षण विधि समुद्री खाद्य उत्पादों की mislabeling रोकने के लिए और सरकारी नियमों के अनुपालन के लिए उपयुक्त सटीक रिकॉर्ड बनाए रखने में सहायता करने की क्षमता है.

Disclosures

लेखकों Agilent टेक्नोलॉजीज है कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन द्वारा नियोजित कर रहे हैं.

Acknowledgments

Agilent Stratagene उत्पाद प्रभाग

  • HARINI रवि
  • नतालिया Novorodovskaya
  • स्कॉट Basehore
  • जेफ Braman
  • राहेल Formosa
  • Ronda एलन
  • राजेश बग्गा
  • डेरेक हॉल
  • सारा Jandle
  • डेनिएल Huffman
Agilent प्रयोगशालाओं
  • रॉबर्ट किनकैड
  • मैरी McBride
Agilent है यूरोप
  • निगेल स्किनर
  • Juergen Schneider
  • स्टीफन म्यूएलर
  • मार्टिन Kratzmeier
Campden BRI
  • स्टीव गैरेट

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer) Agilent Technologies G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software Agilent Technologies G2953CA G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504) Agilent Technologies 5067-1504
Thermal Cycler Various Various
PCR Strip Tubes Agilent Technologies 401428
PCR Strip Caps Agilent Technologies 401425
96-Well Working Rack Agilent Technologies 410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit Agilent Technologies Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit Agilent Technologies Contact
RFLP Matcher Software Agilent Technologies Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent) Various Various
Sterile, nuclease-free water Various Various
Pipettors Various Various
Incubator or water bath set to 65°C Various Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene) Various Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes) Various Various
Vortex mixer Various Various
Microcentrifuge Various Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml Various Various
Tube rack 1.5ml Various Various
Pipette Tips Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology. Food Control. 16, (7), 601-607 (2004).
  2. Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study. J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).
  3. Dooley, J., Garrett, S. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Agilent Technologies Application Note. (2005).
  4. Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species. FSA Final Report Q01069. (2004).
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Formosa, R., Ravi, H., Happe, S., Huffman, D., Novoradovskaya, N., Kincaid, R., Garrett, S. DNA-based Fish Species Identification Protocol. J. Vis. Exp. (38), e1871, doi:10.3791/1871 (2010).More

Formosa, R., Ravi, H., Happe, S., Huffman, D., Novoradovskaya, N., Kincaid, R., Garrett, S. DNA-based Fish Species Identification Protocol. J. Vis. Exp. (38), e1871, doi:10.3791/1871 (2010).

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