Summary
Данная публикация описывает, как использовать видов Agilent Рыбы Идентификация систем для определения видов рыб путем извлечения ДНК и проведения ПЦР и ПДРФ анализа.
Abstract
Мы разработали быстрый, простой и точной ДНК-метод скрининга для выявления видов рыб присутствуют в свежих и переработанных образцы морепродуктов. Этот универсальный метод использует ПЦР-амплификации геномной ДНК, выделенной из образцов рыбы, а затем полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) анализ для получения фрагмента модели, которые могут быть решены на Agilent 2100 Bioanalyzer и соответствуют правильным видов с использованием ПДРФ шаблону программного обеспечения.
Метод идентификации рыбы использует простой, надежный, спина колонке протокол на основе выделить ДНК из образцов рыбы. Образцы относятся с протеиназы К выпустить нуклеиновых кислот в раствор. ДНК затем выделяют путем приостановления образца в связывающем буфере и погрузки на микро-спинового чашку содержащих на основе диоксида кремния волокна матрицы. Нуклеиновых кислот в образце связываются с волокном матрицы. Иммобилизованных нуклеиновых кислот промывают для удаления загрязнений и тотальной ДНК восстанавливается в конечном объеме 100 мкл. Выделенная ДНК готов для ПЦР-амплификации с праймерами при условии, что привязка к последовательности во всех рыб геномов. ПЦР-продукты затем переваривается с тремя различными ферментами ограничения и разрешить на Agilent 2100 Bioanalyzer. Фрагмент длиной производится в пищеварении реакции могут быть использованы для определения видов рыб, из которых образец ДНК был подготовлен, используя шаблон ПДРФ соответствующие программное обеспечение, содержащее базу данных экспериментально полученных моделей ПДРФ из коммерчески соответствующих видов рыб.
Protocol
1: Подготовка рыбы Образцы для выделения ДНК
- Для каждой рыбы образец для тестирования, поместите кусок ткани рыб, весом от 10 мг и 1 г (сырые или вареные), в один 1,5-мл микроцентрифужных трубки. Используйте рисунке ниже в качестве ориентира для оценки веса исходного образца рыбы на основе выборки.
Рисунок 1. Массовая Оценки Рыба образцов на основе размера выборки. - Предварительно теплой Пищеварение протеиназы K буфера до 65 ° С в течение 5 минут в ванне инкубаторе или в воде.
- Подготовка рабочего раствора протеиназы К, объединяя 200 мкл протеиназы К буфера Пищеварение и 20 мкл протеиназы К в образце.
Примечание: Подготовка свежего рабочего раствора протеиназы К перед каждым использованием. - Добавить 220 мкл протеиназы К рабочий раствор для каждой 1,5-мл трубки рыбы образца. Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение 10 минут в ванне инкубаторе или в воде.
- Спиновые труб в микроцентрифужных течение 3 5 мин при 14 000 мкг для осаждения любой непереваренные тканей.
- Передача 150 мкл каждого супернатанта в свежем 1,5 мл трубки. Избегайте передачи любых непереваренные материал из нижней части трубки или любой жирной материал, который может находиться в верхней части трубки. Эти трубки супернатанта являются образцы, из которых геномные ДНК будут извлечены.
2: Получение геномной ДНК
- В стерильный контейнер (труба полипропилен или стекло бутылки), готовят рабочий раствор сульфолан и нуклеиновых кислот буфера для связывания путем объединения 320 мкл 90% сульфолан и 170 мкл нуклеиновых кислот буфера для связывания на образец.
Возможно, вы захотите подготовить достаточное количество этой смеси в процессе столько образцов, как вы планируете изучать в течение следующих 4 недель. Эта смесь может храниться до 30 дней при комнатной температуре. Избегайте попадания смеси на свет во время хранения. - Добавить 490 мкл сульфолан / буфера для связывания смеси (подготовлен в шаге 1) для каждой рыбы образца. Vortex или пипеткой образец несколько раз, пока гомогенизации. Помимо этой смеси принесет общий объем каждой пробы по 640 мкл.
- Передача каждого образца ДНК, связывание Кубка Спиновые, которая была сидя в 2-мл сосуд трубку (прилагается) и оснастки крышку трубки на верхнюю часть спин чашку.
- Спиновые образцов в микроцентрифужных в течение 1 минуты при 14000 мкг для загрузки ДНК на матрице чашку спина.
- Снять и сохранить спину чашки и отбросить фильтратов. Для каждого образца, замените спина чашку в сосуд трубку, а затем добавить 500 мкл 1x Высокая промывочного буфера Соль и колпачок трубки.
- Спиновые образцов в микроцентрифужных при 14000 мкг на 1 минуту.
- Снять и сохранить спину чашки и отбросить фильтратов. Для каждого образца, замените спина чашку в сосуд трубку, а затем добавить 500 мкл 80% этанола и колпачок трубки.
- Спиновые образцов в микроцентрифужных при 14000 мкг на 1 минуту.
- Повторите шаги 7 и 8 еще два раза в общей сложности 3 смывает с 500 мкл 80% этанола.
- После третьего мытья в 80% этанола, удалять и сохранять спину чашки и отбросить фильтратов. Замените спина чашек в своих трубах сосуд и спина в микроцентрифужных в течение 2 минут при 14000 мкг сохнуть волокна матрицы.
- Передача спина стакана до 1,5-m1 трубы коллекции. Добавить 100 мкл буфера для элюции каждого спина чашку прямо на матрице волокна внутри чашки. Привязка шапки коллекцию труб на спину чашки и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 минуты.
- Спиновые образцов в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 1 минуты.
- Очищенную ДНК находится в элюции буфера в микроцентрифужных трубки. Откажитесь от спина чаши и крышки пробирки. ДНК можно хранить при температуре 4 ° С на срок до одного месяца. Для длительного хранения, хранят ДНК при 20 ° С или 80 ° C.
- При желании, вы можете измерить концентрацию ДНК в спектрофотометр.
Геномной протокол выделения ДНК обычно дает образцы с концентрацией от 5 нг / мкл до 500 нг / мкл. ПЦР-ПДРФ протокол работает скважин образцов ДНК начиная где-то от 0,05 нг / мкл до 2000 нг / мкл.
3: Настройка реакции ПЦР
- Подготовка 50 нг / мкл разведения положительного ДНК лосося контроль путем объединения 8 мкл ДНК акции с 32 мкл стерильной, ДНКазы без воды. Vortex перемешать.
Разбавленные образцы могут храниться при температуре 4 ° C для дальнейшего использования. - Подготовка реакции путем объединения компонентов в таблице ниже, в порядке. Подготовка одного смеси реагентов для всех ПЦР, которые будут работать одновременно путем расширения объемов, перечисленные втаблице. В дополнение к образцах ДНК, включают положительную реакцию управления и не-шаблон контрольной реакции. Подготовка дубликата реакции ПЦР для каждого образца ДНК-тест рекомендуется. Подготовка достаточно смеси реагентов для всех ваших реакций плюс один реакционного объема избытке.
Например, если у вас есть 5 опытных образцов ДНК, подготовить достаточно смеси реагентов для любого 8 реакций (5 проверить реакцию, 1 положительный контроль, 1 не-шаблон контроля, и 1 избытке) или 13 реакций, если вы в том числе дубликатов проверить реакцию (10 дублировать реакции теста, 1 положительный контроль, 1 не-шаблон управления и 1 избытком).
ПЦР смеси реагентовКомпонент Том 1 Реакция Том 5 Реакции дН 2 O, стерильный 9 мкл 45 мкл 2x PCR Master Mix 12,5 мкл 62,5 мкл Грунтовка Mix 2,5 мкл 12,5 мкл Общий объем 24 мкл 120 мкл - Vortex смеси реагентов, хорошо, затем распространить 24 мкл для каждого отдельного тонкостенной трубы реакции ПЦР.
- Добавить 1 мкл разбавленного положительный ДНК управления положительные реакции трубки контроля. Для пробирки образец, добавляют 1 мкл исследуемого образца ДНК. Для не-шаблон контрольной реакции, добавляют 1 мкл ДНКазы без воды в месте ДНК.
Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте свежий кончика пипетки для каждого образца ДНК. После добавления образца, смесь реакции, быстро пипетки содержимое пробирки вверх и вниз. - Cap реакции трубы, вихревые трубы, чтобы смешивать и центрифуги трубы кратко.
4: Запуск ПЦР протокола
- Место реакций в термоциклер и запустить программу ПЦР показано ниже.
ПЦР Велоспорт протоколаСегмент Количество циклов Температура Продолжительность 1 1 95 ° C 5 минут 2 40 95 ° C
50 ° C
72 ° C30 секунд
30 секунд
30 секунд3 1 72 ° C 7 минут
5: Дайджест ПЦР продуктов ферментами рестрикции
- Этикетка 0,5-мл пробирки или 0,2-мл полосы труб, которые должны быть использованы для ограничения реакции переварить. Каждый реакции ПЦР будет переварена с тремя различными ферментами ограничение: DdeI, HaeIII и NlaIII. Таким образом, для каждой реакции ПЦР, этикетка трех отдельных труб с именем образца ПЦР и название рестрикции.
- Подготовка смеси реагентов для пищеварения DdeI путем объединения компонентов ниже в порядке. Подготовить единую смесь реагентов для всех пищеварения DdeI реакции (плюс, по крайней мере одного реакционного объема избыточного), используя кратные каждого компонента. После завершения ПЦР, ПЦР-реакции лечат ферментами рестрикции для полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) анализа.
DdeI Пищеварение смеси реагентовКомпонент Объем дН 2 O, стерильный 1,5 мкл 10x Буфер DdeI 0,5 мкл 10x фермента DdeI 0,5 мкл - Vortex смеси реагентов, хорошо, то распространять 2,5 мкл до отдельных трубок реакции, которые были помечены для DdeI.
- Подготовка смеси реагентов для пищеварения HaeIII путем объединения компонентов ниже в порядке. Подготовить единую смесь реагентов для всех пищеварения HaeIII реакции (плюс, по крайней мере одного реакционного объема избыточного), используя кратные каждого компонента.
HaeIII Пищеварение смеси реагентовКомпонент Объем дН 2 O, стерильный 1,5 мкл 10x Буфер HaeIII 0,5 мкл 10x фермента HaeIII 0,5 мкл - Vortex смеси реагентов, хорошо, то распространять 2,5 мкл до отдельных трубок реакции, которые были помечены для HaeIII.
- Подготовка смеси реагентов дляNlaIII пищеварения путем объединения компонентов ниже в порядке. Подготовить единую смесь реагентов для всех пищеварения NlaIII реакции (плюс, по крайней мере одного реакционного объема избыточного), используя кратные каждого компонента.
NlaIII Пищеварение смеси реагентовКомпонент Объем дН 2 O, стерильный 1,5 мкл 10x Буфер NlaIII 0,5 мкл 10x фермента NlaIII 0,5 мкл - Vortex смеси реагентов, хорошо, то распространять 2,5 мкл до отдельных трубок реакции, которые были помечены для NlaIII.
- Для каждой реакции пищеварение, добавьте 2,5 мкл соответствующего продукта ПЦР с меченым труб. Все испытания реакции ПЦР, а также положительная реакция контроля должны быть переварены со всеми тремя ферментами рестрикции.
- Vortex пищеварения реакции, а затем кратко центрифуги трубы.
- Инкубируйте все пищеварение реакции при 37 ° С в течение 2 часов. Это инкубации могут быть выполнены в термоциклер. При желании, реакция может быть оставлен при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Передача реакции до 65 ° С в течение 15 минут. Этот шаг может быть выполнен в термоциклер.
- Добавить 1 мкл 60 мМ ЭДТА (входит в комплект) для каждой реакции и вихревые хорошо.
6: Анализ ограничений переварить моделей
- Подготовка гель-краска перемешать, поместить ДНК чип на чипе станции грунтовка, и нагрузка на смеси ДНК-чип.
- Внесите 5 мкл ДНК-маркеров в колодец, отмеченные символом лестнице и в каждой из 12 образцов скважин на чипе.
ДНК маркер содержится в ДНК 1000 Набор реагентов в зеленой крышками трубки. - Внесите 1 мкл ДНК лестнице в колодец, отмеченные символом лестницы.
ДНК лестнице содержится в ДНК 1000 Набор реагентов в желто-ограничен трубки. - Для каждого из образцов ДНК, пипетки 1 мкл каждой реакции ограничение переварить в один из 12 образцов скважин на чипе в соответствии с указаниями на рисунке ниже. Используя этот подход, колодцы 1-3, для 3 пищеварения реакций для положительного контрольного образца, колодцы 4-6 предназначены для 3 пищеварения реакций на исследуемый образец 1, 7-9 скважины предназначены для 3 пищеварения реакций на исследуемый образец 2, и колодцев 10-12 предназначены для 3 пищеварения реакции для исследуемого образца 3.Analyze ограничение переварить реакций на Agilent 2100 Bioanalyzer для определения длины фрагмента производится в процессе пищеварения. Agilent ДНК 1000 Kit Руководство имеет полные инструкции для запуска лаборатории чипов на Bioanalyzer. Краткого протокола приводится ниже для вашего удобства.
Рисунок 2. Организация Образцы на кристалле.
Если у вас меньше чем на 4 образцах ДНК, пипетки 1 мкл воды в неиспользованных скважин. Если у вас есть более чем в 4 образцах ДНК, вам необходимо запустить более одного чипа. Обратите внимание, что не стоит запускать положительного контрольного образца на каждый чип. - Место чипе горизонтально в адаптер смесителя IKA вихря и вихревой в течение 60 секунд при 2400 оборотах в минуту.
- Вставьте чип в Agilent 2100 Bioanalyzer и начать работать чип. Поступающего сырья сигналы отображаются в акте контексте.
После запуска завершена, пики, определенных для всех образцов, используя настройки пика найти алгоритм. Если Вы уверены, что алгоритм не позволяют выявить подлинный пик, вы можете ниже заданного значения Высота порога на значение, которое позволяет алгоритм для определения пика. - К Пробирной контексте и выберите вкладку Чип Резюме. В поле Имя пробы, ввести наименование образца для всех 12 скважин на чипе, как показано на рисунке ниже.
Рисунок 3. Пример Имя записи в чип Tab Резюме.
7: Определить тестового образца видов с использованием ПДРФ Matcher
Agilent программное приложение ПДРФ декодер может быть использован для идентификации видов рыб для теста ДНК на основе фрагмента длины производится в пищеварении реакций. Таблица 7 Ожидаемые фрагмент ДНК Размеры в Положительный контроль рестрикции Предполагаемый размер продукта (б.п.) DdeI 117 , 332, 340 40 HaeIII, 105, 333 459 NlaIII инструкциям здесь использовать настройки по умолчанию анализа ПДРФ Matcher. Обратитесь к справочной системе программного обеспечения с для подробной информации по использованию программы и интерпретации просмотров.
- Запустите программу ПДРФ декодер.
- Выберите Файл> Открыть> XAD файла.
Открытое Виль диалоговом окнел открытым. - Выберите XAD файл для ДНК-чипов, которые включали ограничение реакции переварить. Нажмите кнопку Открыть.
Откроется диалоговое окно список образцов, которые были загружены на чипе. - Выберите три пищеварения реакции соответствующих одному образец ДНК и указать соответствующий фермент ограничения для каждого образца с помощью выпадающего меню под ферментов колонке. На рисунке ниже, ферментов колонка была заполнена для ДНК Пример 1.
Рисунок 4. Указание рестрикции для каждого образца. - В поле мин высота пика в% от нижнего маркера ", значение по умолчанию составляет 10,0%. В случае необходимости, эта величина может быть понижена для выявления небольших пиков, что было упущено, или повышенное отказаться от пиков в результате неспецифических шума в electropherogram. Нажмите Воссоединение после внесения любых изменений минимальное значение высоты пика.
Рисунок 5. Назначение Минимальная высота пика. - Нажмите Calc в нижней части диалогового окна.
Длины фрагмента данных, полученных от выполнения Bioanalyzer будет заполнять поля программного обеспечения. - В партитуре раскрывающемся списке в верхнем левом углу экрана, выберите соответствующий алгоритм для анализа данных. Если рыба анализируемом образце состоит из одного вида рыб, выберите Dice (Nei Li) в счет раскрывающегося списка. Если образцы могут состоять из смеси видов, выберите смеси.
Таблице в нижней части экрана помечены комбинированные оценка списки лучших видов матчей на основе результатов всех трех реакций пищеварения. Название вида, а также общее название, перечислены в таблице (см. ниже). Идеальный матчей (с 1 балл), выделены зеленым цветом. Матчи выделены желтым цветом, считаются около матчей. Вы можете дважды щелкнуть на название вида, чтобы вызвать Фишбейс веб-страницу для данного вида.
Рисунок 6. Виды идентификации на основе пищеварения. - В нижней отсечки и сопоставить поля толерантности в верхней части экрана, вы можете настроить параметры по умолчанию для улучшения счетом лучший матч видов. Ниже порогового значения используется, чтобы отбросить любые фрагменты короче, чем длина, указанные в поле. Значение матча толерантности определяет, насколько близко в длину фрагмента должно быть предсказано фрагмент считается матч.
- Повторите шаги с 4 по 8 для оставшихся образцов ДНК, которые были включены на этом же чипе.
8: представитель Результаты:
Образ гель Bioanlyzer с ограничением переварить образцы из 4-х различных видов рыб показана на рисунке ниже. Ожидаемые результаты для положительных образцов ДНК приведены в таблице ниже. 
Рисунок 7. Bioanalyzer гель образ ограничение образцы переварить реакции. Каждый гель полоса помечена рестрикции, используемых в этой реакции.
Ожидаемые фрагмент ДНК Размеры в Лосось Положительный контроль
Рисунок 8. Ожидаемые фрагмент ДНК Размеры в Лосось положительного контроля.
Discussion
Мы показываем, простой, быстрый и точный на основе ДНК метод скрининга для выявления видов рыб в морепродуктов. Этот мощный метод обеспечивает воспроизводимые, точные результаты менее чем за один рабочий день, и это может быть реализовано в коммерческих объектов тестирования из-за обтекаемой протоколов и простой установки. Она характеризуется поколения объективных данных, которые анализируются с помощью ПДРФ декодер программного обеспечения с расширяемой базе данных экспериментально полученные профили видов рыб.
С рутинной реализации, этот метод испытания имеет потенциал для предотвращения неправильной установки морепродуктов и оказания помощи в поддержании точный учет подходит для соблюдения государственными правилами.
Disclosures
Авторы используемых технологий Agilent, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Agilent Stratagene Products Division
- Харини Рави
- Наталья Novorodovskaya
- Скотт Basehore
- Джефф Браман
- Рэйчел Формоза
- Ронда Аллен
- Раджеш Bagga
- Дерек зал
- Сара Jandle
- Даниэль Хаффман
- Роберт Кинкейд
- Мэри Макбрайд
- Найджел Скиннер
- Юрген Шнайдер
- Стефан Мюллер
- Мартин Kratzmeier
- Стив Гарретт
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer) | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software | Agilent Technologies | G2953CA | G2950CA - desktop PC & Expert Software |
| Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504) | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Thermal Cycler | Various | Various | |
| PCR Strip Tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| PCR Strip Caps | Agilent Technologies | 401425 | |
| 96-Well Working Rack | Agilent Technologies | 410094 | |
| Fish Species Identification System DNA Isolation Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| RFLP Matcher Software | Agilent Technologies | Contact | |
| 100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent) | Various | Various | |
| Sterile, nuclease-free water | Various | Various | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Incubator or water bath set to 65°C | Various | Various | |
| Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene) | Various | Various | |
| round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes) | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various | |
| Microcentrifuge | Various | Various | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Various | Various | |
| Tube rack 1.5ml | Various | Various | |
| Pipette Tips | Various | Various |
References
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology. Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study. J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).
- Dooley, J., Garrett, S. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Agilent Technologies Application Note. , (2005).
- Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species. FSA Final Report Q01069. , (2004).
