ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

Summary

פרסום זה מתאר כיצד להשתמש מיני דגים Agilent מערכת זיהוי כדי לזהות את המין של דג על ידי הפקת DNA וביצוע PCR וניתוח RFLP.

Abstract

פיתחנו מהיר, פשוט, מדויק DNA מבוססת שיטת ההקרנה לזהות את מיני דגים הנמצאים דגימות פירות ים טריים ומעובדים. שיטה זו המגוונת מעסיקה הגברה PCR של הדנ"א הגנומי המופקים דגימות דגים, ואחריו ניתוח שבר הגבלת אורך (RFLP) פולימורפיזם ליצור דפוסים קטע זה ניתן לפתור על 2100 Agilent Bioanalyzer ו מתאימים למין הנכון באמצעות תוכנת RFLP התאמת דפוסים.

שיטת זיהוי דגים משתמש פשוט, אמין, טור מבוססי פרוטוקול ספין לבודד דנ"א מדגימות הדגים. הדגימות מטופלים proteinase K לשחרר את חומצות גרעין לתוך פתרון. DNA הוא מבודד אז על ידי השעיית מדגם במאגר מחייב העמסה על כוס מיקרו ספין המכיל סיליקה מטריצה ​​מבוססי סיבים. חומצות גרעין ב לאגד את המדגם כדי המטריצה ​​סיבים. חומצות גרעין משותקת נשטפים להסרת מזהמים, ו-DNA הכולל הוא התאושש בנפח סופי של μl 100. ה-DNA מבודד מוכן הגברה PCR עם פריימרים ובלבד להיקשר רצפי נמצא כל הגנום דגים. המוצרים PCR מתעכלים אז עם שלושה אנזימי הגבלה שונים החליט על 2100 Agilent Bioanalyzer. אורך קטע מיוצר התגובות העיכול ניתן להשתמש כדי לקבוע את מינים של דגים שממנו דגימת DNA הוכן באמצעות דפוס RFLP התאמת תוכנה המכילה מסד נתונים של ניסויי הנגזרות דפוסי RFLP דגים ממינים רלוונטי מסחרית.

Protocol

1: הכן את דוגמאות דגים עבור הפקת DNA

1. עבור כל דגימה דגים להיבדק, מקום פיסת הרקמה דגים, במשקל שבין 10 מ"ג ו -1 גרם (טריים או מבושלים), לתוך צינור 1.5-מ"ל יחיד microcentrifuge. השתמש בתרשים להלן כקו מנחה להערכת המשקל של מדגם דג נא מבוסס על גודל המדגם.
   
   
   באיור 1. הערכות המוניים של דוגמאות דגים מבוסס על גודל המדגם.
   
   
2. טרום לחמם את הצפת K proteinase עיכול עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט מים או בחממה.
3. הכן פתרון עבודה של proteinase K על ידי שילוב של 200 μl של הצפת K עיכול proteinase ו 20 μl של proteinase K לדגימה.
   הערה: הכן פתרון עובד טרי proteinase K לפני כל שימוש.
4. הוסף 220 μl של הפתרון K proteinase הפועלים צינור 1.5 מ"ל כל אחד מדגם דגים. דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות באמבט מים או בחממה.
5. ספין צינורות microcentrifuge עבור 3 5 דקות עד 14,000 XG גלולה כל רקמות מעוכל.
6. העברת 150 μl של supernatant כל לתוך צינור 1.5-מ"ל טריים. הימנע בהעברת כל חומר לא מעוכל מהחלק התחתון של הצינור או כל חומר שומני שעלול להיות נוכחים בחלק העליון של הצינור. צינורות אלו של supernatant הם דוגמאות שמהם גנומית ה-DNA יחולצו.

2: חלץ הדנ"א הגנומי

1. במיכל סטרילי (צינור פוליפרופילן או בקבוק זכוכית), להכין פתרון עבודה של הצפת חומצה sulfolane ו גרעין הכבילה על ידי שילוב של 320 μl של sulfolane 90% ו 170 μl של הצפת חומצות גרעין עקידת לדגימה.
   אולי כדאי להכין כמות מספקת של תערובת זו לתהליך דוגמאות רבות ככל שאתה מתכנן לבחון בתוך 4 שבועות. תערובת זו ניתן לאחסן עד 30 ימים בטמפרטורת החדר. הימנע לחשוף את התערובת אל האור במהלך האחסון.
2. הוסף 490 μl של התערובת הצפת sulfolane / הכבילה (מוכן בשלב 1 לעיל) לדגום כל הדגים. וורטקס או pipet המדגם שוב ושוב עד הומוגני. תוספת של תערובת זו תביא את סך היקף המדגם לכל μl 640.
3. העברת כל מדגם גביע ה-DNA Binding ספין כי כבר יושב בתוך צינור 2-ml קיבול (בתנאי) ואת הצמד את הפקק של הצינור אל החלק העליון של הגביע ספין.
4. ספין דגימות microcentrifuge דקה 1 ב XG 14,000 לטעון את ה-DNA על המטריצה ​​כוס ספין.
5. הסר ולשמר את כוסות ספין להתעלמות filtrates. עבור כל דגימה, להחליף את כוס ספין בצינור קיבול, ואז להוסיף 500 μl של 1x הצפת מלח גבוהים שטפו והכובע את הצינורית.
6. ספין דגימות microcentrifuge בבית XG 14,000 דקה 1.
7. הסר ולשמר את כוסות ספין להתעלמות filtrates. עבור כל דגימה, להחליף את כוס ספין בצינור קיבול, ואז להוסיף 500 μl של 80% אתנול ו כובע הצינור.
8. ספין דגימות microcentrifuge בבית XG 14,000 דקה 1.
9. חזור על שלבים 7 ו -8 פי שניים יותר עבור סכום כולל של 3 שוטף עם 500 μl של אתנול 80%.
10. לאחר לשטוף השלישית 80% אתנול, להסיר ולשמר את כוסות ספין להתעלמות filtrates. החלף את כוסות ספין צינורות קיבול שלהם ספין microcentrifuge למשך 2 דקות XG 14,000 לייבש את מטריצת סיבים.
11. מעבירים את כוסות ספין על 1.5-m1 צינורות האיסוף. הוסף 100 μl של הצפת elution על כל כוס ספין ישירות על המטריצה ​​סיבים בתוך הכוס. הצמד את המכסים של צינורות אוסף גבי כוסות ספין דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 1.
12. ספין דגימות microcentrifuge במהירות המרבית למשך דקה 1.
13. ה-DNA מטוהרים היא הצפת elution בצינור microcentrifuge. מחק את הגביע ספין כובע הצינורות. הדנ"א עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. עבור אחסון לטווח ארוך, חנות ה-DNA ב 20 ° C או 80 ° C.
14. אם תרצה, אתה יכול למדוד את הריכוז של דגימות דנ"א ספקטרופוטומטר.

פרוטוקול ה-DNA הגנומי החילוץ בדרך כלל תשואות דגימות עם ריכוז הנעים בין 5 ng / μl עד 500 ng / μl. PCR-RFLP פרוטוקול בארות עובד עם דגימות DNA הנעים מקום מ 0.05 ng / μl עד 2000 ng / μl.

3: הגדר את תגובת ה-PCR

1. הכן 50 ng / μl דילול של ה-DNA בקרה חיובית סלמון על ידי שילוב של 8 μl של מניות ה-DNA עם 32 μl של מים סטריליים DNase חינם,. וורטקס לערבב.
   המדגם בדילול מלא עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
2. הכן את התגובות על ידי שילוב של המרכיבים בטבלה שלהלן כדי. הכינו תערובת מגיב יחיד עבור כל התגובות PCR יהיה להפעיל בו זמנית על ידי דרוג את הכרכים המפורטיםשולחן. בנוסף דגימות DNA הבדיקה, כולל תגובה מלאה חיוביים תגובה ללא תבנית שליטה. הכנת תגובות לשכפל PCR עבור כל דגימה DNA הבדיקה מומלצת. הכינו תערובת מגיב מספיק עבור כל התגובות שלכם ועוד אחד נפח עודף התגובה.
   לדוגמה, אם יש לך 5 דגימות DNA הבדיקה, להכין תערובת מגיב מספיק גם 8 תגובות (5 תגובות מבחן, 1 לשלוט חיובי, 1 ללא תבנית שליטה, 1 עודף) או 13 תגובות אם אתה כולל כפילויות של התגובות מבחן (10 תגובות מבחן כפולות, 1 לשלוט חיובי, 1 ללא תבנית מלאה 1 עודף).
   PCR תערובת מגיב

   רכיב	כרך 1 תגובה	כרך 5 תגובות
   DH 2 O, סטרילי	9 μl	45 μl
   2x PCR מאסטר מיקס	12.5 μl	62.5 μl
   פריימר Mix	2.5 μl	12.5 μl
   סך נפח	24 μl	120 μl

3. וורטקס את התערובת מגיב היטב, ולאחר מכן להפיץ 24 μl לכל אדם PCR צינור דק דופן התגובה.
4. הוסף 1 μl של ה-DNA שליטה בדילול החיובי של צינור לשלוט תגובה חיובית. כדי צינורות מדגם הבדיקה, להוסיף 1 μl של דגימת DNA הבדיקה. לקבלת תגובה ללא תבנית מלאה, להוסיף 1 μl מים DNase חופשי במקום ה-DNA.
   כדי למנוע זיהום צולבות, השתמש טיפ pipet טריים עבור כל דגימה DNA. לאחר הוספת המדגם, לערבב את התגובה במהירות pipetting את תוכן הצינור למעלה ולמטה.
5. שווי הצינורות התגובה, המערבולת צינורות לערבב צנטריפוגות צינורות בקצרה.

4: הפעל את פרוטוקול ה-PCR

1. מניחים את התגובות Cycler תרמי להפעיל את תוכנית ה-PCR כמוצג להלן.
   פרוטוקול ה-PCR אופניים

   פלח	מספר מחזורי	טמפרטורה	משך
   1	1	95 ° C	5 דקות
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 שניות 30 שניות 30 שניות
   3	1	72 ° C	7 דקות

5: תקציר PCR מוצרים עם אנזימי הגבלה

1. תווית 0.5-מ"ל צינורות או 0.2-מ"ל צינורות רצועת כי הם לשמש את התגובות הגבלה לעכל. התגובה של כל PCR יהיה מעוכל עם שלושה אנזימי הגבלה שונים: DdeI, HaeIII ו NlaIII. לכן, עבור כל תגובה PCR, תווית שלוש שפופרות נפרדות עם השם של המדגם PCR ואת השם של אנזים הגבלה.
2. מכינים את תערובת מגיב על digestions DdeI על ידי שילוב של המרכיבים הבאים לפי הסדר. הכן תערובת מגיב יחיד עבור כל התגובות העיכול DdeI (פלוס אחד לפחות נפח עודף תגובה) באמצעות בכפולות של כל רכיב. לאחר PCR תושלם, התגובות PCR מטופלים עם אנזימי הגבלה עבור ניתוח שבר הגבלת אורך (RFLP) פולימורפיזם.
   מגיב DdeI עיכול תערובת

   רכיב	נפח
   DH 2 O, סטרילי	1.5 μl
   מאגר 10x DdeI	0.5 μl
   אנזים 10x DdeI	0.5 μl

3. וורטקס את התערובת מגיב היטב, ולאחר מכן להפיץ 2.5 μl של צינורות התגובה בודדות תויגו עבור DdeI.
4. מכינים את תערובת מגיב על digestions HaeIII על ידי שילוב של המרכיבים הבאים לפי הסדר. הכן תערובת מגיב יחיד עבור כל התגובות העיכול HaeIII (פלוס אחד לפחות נפח עודף תגובה) באמצעות בכפולות של כל רכיב.
   מגיב HaeIII עיכול תערובת

   רכיב	נפח
   DH 2 O, סטרילי	1.5 μl
   מאגר 10x HaeIII	0.5 μl
   אנזים 10x HaeIII	0.5 μl

5. וורטקס את התערובת מגיב היטב, ולאחר מכן להפיץ 2.5 μl של צינורות התגובה בודדות תויגו עבור HaeIII.
6. מכינים את תערובת מגיב עבורDigestions NlaIII על ידי שילוב של המרכיבים הבאים לפי הסדר. הכן תערובת מגיב יחיד עבור כל התגובות העיכול NlaIII (פלוס אחד לפחות נפח עודף תגובה) באמצעות בכפולות של כל רכיב.
   מגיב NlaIII עיכול תערובת

   רכיב	נפח
   DH 2 O, סטרילי	1.5 μl
   מאגר 10x NlaIII	0.5 μl
   אנזים 10x NlaIII	0.5 μl

7. וורטקס את התערובת מגיב היטב, ולאחר מכן להפיץ 2.5 μl של צינורות התגובה בודדות תויגו עבור NlaIII.
8. עבור כל תגובה העיכול, להוסיף 2.5 μl של המוצר PCR מתאים צינורות שכותרתו. כל התגובות PCR הבדיקה, כמו גם את התגובה החיובית לשלוט צריך להיות מעוכל עם כל שלושת אנזימי הגבלה.
9. את מערכת העיכול תגובות וורטקס ואז בקצרה צנטריפוגות הצינורות.
10. דגירה כל התגובות העיכול על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הדגירה זה יכול להתבצע Cycler התרמית. אם תרצה, תגובות ניתן להשאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
11. מעבירים את התגובות 65 ° C במשך 15 דקות. שלב זה יכול להתבצע Cycler התרמית.
12. הוסף 1 μl של 60 mM EDTA (מסופק עם הערכה) לתגובה כל מערבולת היטב.

6: ניתוח דפוסי לעכל הגבלה

1. מכינים את תערובת ג'ל צבע, מקום שבב ה-DNA על תחנת תחול שבב, ו לטעון את התערובת על גבי שבב ה-DNA.
2. 5 Pipet μl של סמן ה-DNA לתוך המסומן היטב עם סמל בסולם לתוך כל אחד מ -12 בארות מדגם על השבב.
   סמן ה-DNA הוא סיפק את ערכת ה-DNA בשנת 1000 מגיב צינור ירוק הכתיר.
3. 1 Pipet μl של סולם ה-DNA לתוך המסומן היטב עם סמל סולם.
   סולם הדנ"א מסופק ערכת ה-DNA 1000 מגיב בצינור צהוב כתרים.
4. עבור כל אחד דגימות DNA, 1 pipet μl התגובה לכל הגבלה לעכל לאחד 12 בארות מדגם על השבב על פי הנחיות באיור להלן. בגישה זו, בארות 1-3 הם עבור 3 תגובות העיכול למדגם שליטה חיובית, בארות 4-6 הם עבור 3 תגובות העיכול למדגם מבחן 1, בארות 7-9 הם עבור 3 תגובות העיכול למדגם מבחן 2, ובארות 10-12 הם עבור 3 תגובות לעיכול עבור מדגם הבדיקה 3.Analyze לעכל הגבלה תגובות על 2100 Agilent Bioanalyzer כדי לקבוע את אורכי שבר הנוצר במהלך עיכול. ה-DNA Agilent 1000 Kit מדריך יש הוראות מלאות להפעלת שבבי מעבדה על Bioanalyzer. פרוטוקול קצר המסופק להלן לנוחיותך.
   
   
   איור 2. ארגון דוגמאות על שבב.
   
   אם יש לך פחות מ 4 דגימות DNA, 1 pipet μl של מים לתוך בארות בשימוש. אם יש לך יותר מ 4 דגימות DNA, תצטרך לרוץ יותר שבב. שים לב כי אין צורך להפעיל את המדגם בקרה חיובית על כל שבב.
5. מניחים את שבב אופקית מתאם של מערבל איקא מערבולת מערבולת של 60 שניות 2400 סל"ד.
6. הכנס את השבבים לתוך 2100 Agilent Bioanalyzer ולהתחיל להריץ שבב. אותות הגלם הנכנסים מוצגים בהקשר Instrument.
   לאחר הפעלת סיימה, פסגות מזוהים עבור כל דגימות באמצעות הגדרות של הפסגה למצוא אלגוריתם. אם אתה מאמין האלגוריתם נכשל לזהות שיא אמיתי, אתה יכול להנמיך את גובה סף setpoint לערך אלגוריתם המאפשר לזהות את השיא.
7. עבור בהקשר Assay ובחר את הכרטיסייה סיכום שבב. בשדה שם לדוגמה, הזן שם עבור כל מדגם 12 בארות על השבב, כפי שמוצג באיור להלן.
   
   
   איור 3. לדוגמה שם כניסה בלשונית סיכום שבב.

7: זיהוי מינים מדגם הבדיקה באמצעות RFLP Matcher

התוכנה Agilent יישום RFLP מפענח ניתן להשתמש כדי לזהות את מיני דגים של דגימות DNA הבדיקה מבוססת על אורכי שבר מיוצר התגובות העיכול. לוח 7 צפוי קטע דנ"א הגדלים הבקרה חיובית הגבלת גודל אנזימים מוצר הצפוי (נ"ב) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 459 NlaIII ההוראות כאן להשתמש בניתוח הגדרות ברירת המחדל RFLP Matcher. עיין במערכת העזרה של התוכנה עבור מידע מפורט על הפעלת התוכנה לפרש את התצוגה.

1. הפעל את התוכנית מפענח RFLP.
2. לחץ> פתח> XAD קובץ.
   שיח פתח תיבת wilאני פותחת.
3. בחר את הקובץ XAD על שבב ה-DNA שכלל את התגובות לעכל הגבלה. לחץ על פתח.
   תיבת הדו שיח תפתח רשימת דגימות הועמסו על השבב.
4. תבחר שלושה התגובות העיכול המתאים דגימה אחת דנ"א לציין את אנזים הגבלה מתאים מדגם זה באמצעות התפריטים הנפתחים תחת העמודה אנזימים. באיור למטה, בעמודה אנזימים כבר למלא עבור דגימת DNA 1.
   
   
   איור 4. ציון אנזים הגבלה עבור כל דגימה.
   
   
5. בשדה שכותרתו גובה דקות השיא של סמן כמו% נמוך יותר ", ערך ברירת המחדל הוא 10.0%. במידת הצורך, ערך זה עשוי להיות הוריד לזהות פסגות קטן היה לפספס, או העלה לבטל פסגות הנובעות רעש בלתי ספציפיים electropherogram. לחץ לאחות מחדש לאחר ביצוע ההתאמות על ערך השיא דקות גובה.
   
   
   איור 5. הקצאת גובה שיא מינימום.
   
   
6. לחץ Calc בחלק התחתון של תיבת הדו שיח.
   אורך קטע נתונים המתקבלים בטווח Bioanalyzer יהיה לאכלס את השדות תוכנה.
7. ברשימה ציון הנפתח בפינה השמאלית העליונה של המסך, בחר את האלגוריתם המתאים לניתוח הנתונים. אם המדגם דגים להיות מנותח מורכב מיני דגים יחיד, בחר קוביות (ניי Li) בניקוד הרשימה הנפתחת. אם הדגימות עשויה להיות מורכבת מתערובת של מינים, בחר תערובת.
   הטבלה בתחתית המסך שכותרתו ציון משולב רשימות המין המתאים ביותר בהתבסס על התוצאות של כל שלושת התגובות העיכול. שם המין, כמו גם את השם הנפוץ המפורטות בטבלה (ראה להלן). תואם מושלם (אלה עם ציון של 1) מודגשים בירוק. משחקים מודגש בצהוב נחשבים ליד גפרורים. אתה יכול ללחוץ לחיצה כפולה על שם זן כדי להעלות את דף האינטרנט FishBase עבור מינים.
   
   
   איור 6. זיהוי מינים בהתבסס על העיכול.
   
   
8. ב החיתוך התחתון להתאים שדות סובלנות בחלק העליון של המסך, אתה יכול להתאים את הגדרות ברירת המחדל על מנת לשפר את הציון של המשחק מינים הטוב ביותר. ערך הסף התחתון משמש למחיקת כל שברי קצר יותר מאורך ייעודיים בתחום. הערך סובלנות להתאים קובע כמה קרוב באורך שבר חייב להיות שבר החזוי להיחשב התאמה.
9. חזור על שלבים 4 עד 8 עבור דגימות DNA הנותרים אשר נכללו על שבב זה אותו הדבר.

8: נציג תוצאות:

תמונה של ג'ל Bioanlyzer עם לעכל דגימות הגבלה של 4 מיני דגים שונים מוצג בתרשים להלן. התוצאות הצפויות דגימת DNA חיובי מסוכמים בטבלה שלהלן.


איור 7. Bioanalyzer ג'ל תמונה ההגבלה דגימות לעכל התגובה. נתיב כל ג'ל מתויג עם אנזים הגבלה בשימוש התגובה.

צפוי קטע DNA גדלים בחוק הפיקוח על סלמון חיובית

איור 8. צפוי קטע DNA גדלים בחוק הפיקוח על סלמון חיובית.

Discussion

אנו מדגימים פשוט, מהיר, מדויק DNA מבוססת שיטת ההקרנה לזיהוי מינים של דגים ומאכלי ים. שיטה זו עוצמה מספקת לשחזור, תוצאות מדויקות תוך יום עבודה אחד פחות וזה יכול להיות מיושם מתקני בדיקה מסחרית עקב פרוטוקולים יעיל ההתקנה פשוטה. הוא מאופיין על ידי הדור של נתונים אובייקטיביים אשר נותחו באמצעות תוכנה RFLP מפענח עם מסד נתונים להרחבה פרופילים בניסוי מינים שמקורם בדגים.

עם יישום שגרתי, זו שיטת הבדיקה יש את הפוטנציאל למנוע ואבחון לא נכון של מוצרי פירות ים ולסייע בשמירה רישומים מדויקים מתאים תאימות עם תקנות ממשלתיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various