Summary
Questa pubblicazione descrive come utilizzare il sistema di identificazione delle specie di pesce Agilent per identificare la specie di un pesce con l'estrazione del DNA e l'esecuzione di analisi di PCR e RFLP.
Abstract
Abbiamo sviluppato una veloce, semplice e preciso basato sul DNA metodo di screening per identificare le specie ittiche presenti nei campioni di frutti di mare freschi e trasformati. Questo metodo versatile impiega amplificazione del DNA genomico estratto da campioni di pesce, seguita dalla lunghezza del frammento di restrizione polimorfismi (RFLP) per generare modelli frammento che può essere risolto sulla Agilent 2100 Bioanalyzer e abbinati alla specie corretta utilizzando il software modello RFLP di corrispondenza.
Il metodo di identificazione dei pesci utilizza un semplice, affidabile, spin basato su colonne protocollo per isolare il DNA da campioni di pesce. I campioni sono trattati con proteinasi K per liberare gli acidi nucleici in soluzione. Il DNA è poi isolato sospendendo il campione in buffer vincolante e carico su un micro-spin coppa contenente una matrice a base di silice fibra. Gli acidi nucleici nel campione si legano alla matrice fibra. Gli acidi nucleici immobilizzati vengono lavati per rimuovere i contaminanti, e il DNA totale è recuperato in un volume finale di 100 ul. Il DNA isolato è pronto per l'amplificazione PCR con i primer a condizione che si legano alle sequenze si trovano in tutti i genomi di pesce. I prodotti della PCR vengono poi digeriti con tre enzimi di restrizione diversi e risolto il Agilent 2100 Bioanalyzer. Le lunghezze frammento prodotte nelle reazioni di digestione può essere utilizzata per determinare la specie di pesci da cui è stato preparato il campione di DNA, utilizzando il modello RFLP corrispondenza software contenente un database di modelli derivati sperimentalmente RFLP da specie ittiche di interesse commerciale.
Protocol
1: preparare i campioni di pesce per l'estrazione del DNA
- Per ogni campione di pesce da testare, posto un pezzo del tessuto di pesce, di peso compreso tra 10 mg e 1 g (crudi o cotti), in un singolo da 1,5 ml provetta. Utilizzare la figura come una linea guida per stimare il peso di un campione di pesce crudo in base alle dimensioni del campione.
Figura 1. Le stime di massa dei campioni di pesce in base alle dimensioni del campione. - Pre-riscaldare la digestione proteinasi K Buffer a 65 ° C per 5 minuti in un bagno di incubatore o acqua.
- Preparare una soluzione di lavoro di proteinasi K, combinando 200 l di tampone di digestione proteinasi K e 20 ml di proteinasi K per campione.
Nota: Preparare una soluzione fresca di lavoro di proteinasi K prima di ogni utilizzo. - Aggiungere 220 microlitri della soluzione di proteinasi K al lavoro per ogni 1,5 ml di tubo di campione di pesce. Incubare le provette a 65 ° C per 10 minuti in un bagno di incubatore o acqua.
- Gira i tubi in una microcentrifuga per 3 5 minuti a 14000 g per far sedimentare i tessuti non digerito.
- Trasferire 150 ml di ciascun supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml. Evitare il trasferimento di qualsiasi materiale non digerito dalla parte inferiore del tubo o qualsiasi altro materiale oleoso che possono essere presenti nella parte superiore del tubo. Questi tubi di supernatante sono i campioni da cui genomico DNA sarà estratto.
2: Estrarre il DNA genomico
- In un contenitore sterile (tubo in polipropilene o in bottiglia di vetro), preparare una soluzione di lavoro di tampone acido nucleico sulfolane e Binding, combinando 320 ml di 90% sulfolane e 170 ml di Buffer Nucleic Acid Binding per campione.
Si consiglia di preparare una quantità sufficiente di questa miscela a trattare i campioni quanti si prevede di esaminare entro le prossime 4 settimane. Questa miscela può essere conservato per un massimo di 30 giorni a temperatura ambiente. Evitare di esporre la miscela alla luce durante la conservazione. - Aggiungere 490 microlitri della miscela Buffer sulfolane / Binding (preparata al punto 1 sopra) per ogni campione di pesce. Vortex o pipettare il campione finché non omogeneizzato. L'aggiunta di questa miscela porterà il volume totale di ogni campione a 640 microlitri.
- Trasferire ciascun campione in una Coppa del Binding Spin DNA che è stato seduto all'interno di un tubo da 2 ml presa (in dotazione) e far scattare il tappo del tubo sulla parte superiore della coppa di spin.
- Spin i campioni in una microcentrifuga per 1 minuto a 14000 g per caricare il DNA sulla matrice tazza di spin.
- Rimuovere e conservare le tazze di spin e scartare i filtrati. Per ogni campione, sostituire la coppa di centrifuga del tubo di presa, quindi aggiungere 500 microlitri di 1x tampone di lavaggio ad alta Sale e cappuccio del tubo.
- Spin i campioni in microcentrifuga a 14000 g per 1 minuto.
- Rimuovere e conservare le tazze di spin e scartare i filtrati. Per ogni campione, sostituire la coppa di centrifuga del tubo di presa, poi aggiungere 500 ml di etanolo all'80% e il tappo del tubo.
- Spin i campioni in microcentrifuga a 14000 g per 1 minuto.
- Ripetere i passaggi 7 e 8 altre due volte per un totale di 3 lavaggi con 500 ml di etanolo all'80%.
- Dopo il terzo lavaggio in 80% etanolo, rimuovere e conservare le tazze di spin e scartare i filtrati. Sostituire le calotte di spin in loro tubi presa e spin in una microcentrifuga per 2 minuti a 14000g per asciugare la matrice di fibra.
- Trasferire le tazze di selezione per 1,5 m1 tubi di raccolta. Aggiungere 100 ml di tampone di eluizione per ogni tazza girare direttamente sulla matrice in fibra all'interno della coppa. Snap i tappi delle provette di raccolta sul coppe spin e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
- Spin i campioni in una microcentrifuga alla massima velocità per 1 minuto.
- Il DNA purificato è nel buffer di eluizione in provetta. Scartare la coppa di spin e il berretto dei tubi. Il DNA può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. Per la conservazione a lungo termine, conservare il DNA a 20 ° C o 80 ° C.
- Se lo si desidera, è possibile misurare la concentrazione dei campioni di DNA in uno spettrofotometro.
Il protocollo di estrazione del DNA genomico rendimenti generalmente campioni con una concentrazione che varia da 5 ng / mL a 500 ng / mL. La PCR-RFLP protocollo funziona pozzetti con campioni di DNA che varia da 0,05 ng / mL a 2000 ng / mL.
3: Impostare le reazioni PCR
- Preparare un 50 ng / mL di diluizione del DNA positivo salmone controllo, combinando 8 ml di stock DNA con 32 ml di sterili, DNase senza acqua. Vortex per mescolare.
Il campione diluito può essere conservato a 4 ° C per un uso futuro. - Preparare le reazioni combinando i componenti nella tabella seguente in ordine. Preparare un impasto unico reagente per tutte le reazioni PCR che saranno eseguiti contemporaneamente scalando i volumi elencati intavolo. Oltre a campioni di DNA alla prova, sono una reazione positiva di controllo e un non-modello di reazione di controllo. Preparazione reazioni PCR duplicare per ogni campione di DNA test è raccomandato. Preparare impasto abbastanza reattivo per tutte le vostre reazioni più uno eccesso di volume di reazione.
Per esempio, se si dispone di 5 campioni del test del DNA, preparazione impasto abbastanza reattivo per le reazioni sia a 8 (5 reazioni di prova, 1 controllo positivo, 1 no-modello di controllo, e 1 in eccesso) o 13 se le reazioni sono inclusi i duplicati delle reazioni di prova (10 reazioni campioni in doppio, 1 controllo positivo, 1 no-modello di controllo e 1 in eccesso).
PCR Reagente MiscelaComponente Volume 1 di reazione Volume 5 Reazioni dH 2 O, sterile 9 microlitri 45 microlitri 2x PCR Master Mix 12,5 microlitri 62,5 microlitri Primer Mix 2,5 microlitri 12,5 microlitri Volume totale 24 microlitri 120 microlitri - Vortex la miscela di reazione e, quindi distribuire 24 microlitri per ogni individuo a parete sottile tubo di reazione PCR.
- Aggiungere 1 ml di DNA di controllo positivo diluito al tubo positiva reazione di controllo. Per provette del test, aggiungere 1 ml del campione di DNA. Per i non-modello reazione di controllo, aggiungere 1 ml di acqua priva di DNasi al posto del DNA.
Per evitare la contaminazione incrociata, utilizzare una punta fresca pipetta per ogni campione di DNA. Dopo aver aggiunto il campione, mescolare la reazione rapidamente pipettamento il contenuto della provetta su e giù. - Cap le provette di reazione, i tubi vortex per miscelare e centrifugare i tubi brevemente.
4: Eseguire il protocollo di PCR
- Luogo le reazioni nel termociclatore ed eseguire il programma PCR illustrato di seguito.
PCR Ciclismo protocolloSegmento Numero di cicli Temperatura Durata 1 1 95 ° C 5 minuti 2 40 95 ° C
50 ° C
72 ° C30 secondi
30 secondi
30 secondi3 1 72 ° C 7 minuti
5: Digest I prodotti di PCR con enzimi di restrizione
- Etichettare il 0,5 ml di tubi o 0.2 ml, tubi di strip che devono essere utilizzati per le reazioni di restrizione digerire. Ogni reazione di PCR sarà digerito con tre diversi enzimi di restrizione: DdeI, HAEIII e NlaIII. Pertanto, per ogni reazione di PCR, etichetta tre tubi separati con il nome del campione di PCR e il nome del enzima di restrizione.
- Preparare la miscela di reazione per la digestioni DdeI combinando le componenti di seguito in ordine. Preparare una miscela singolo reagente per le reazioni di digestione tutti DdeI (più almeno un eccesso di volume di reazione), utilizzando i multipli di ogni componente. Una volta che la PCR è completo, le reazioni di PCR sono trattati con enzimi di restrizione per la lunghezza del frammento di restrizione polimorfismi (RFLP).
DdeI digestione miscela di reazioneComponente Volume dH 2 O, sterile 1,5 microlitri 10x DdeI Buffer 0,5 microlitri 10x DdeI enzima 0,5 microlitri - Vortex la miscela di reazione e, quindi distribuire 2,5 microlitri per i tubi di reazione individuale che sono stati etichettati per DdeI.
- Preparare la miscela di reazione per la digestioni HAEIII combinando le componenti di seguito in ordine. Preparare una miscela singolo reagente per le reazioni di digestione tutti HAEIII (più almeno un eccesso di volume di reazione), utilizzando i multipli di ogni componente.
HAEIII digestione miscela di reazioneComponente Volume dH 2 O, sterile 1,5 microlitri 10x HAEIII Buffer 0,5 microlitri 10x HAEIII enzima 0,5 microlitri - Vortex la miscela di reazione e, quindi distribuire 2,5 microlitri per i tubi di reazione individuale che sono stati etichettati per HAEIII.
- Preparare la miscela di reazione per laDigestioni NlaIII combinando le componenti di seguito in ordine. Preparare una miscela singolo reagente per le reazioni di digestione tutti NlaIII (più almeno un eccesso di volume di reazione), utilizzando i multipli di ogni componente.
NlaIII digestione miscela di reazioneComponente Volume dH 2 O, sterile 1,5 microlitri 10x NlaIII Buffer 0,5 microlitri 10x NlaIII enzima 0,5 microlitri - Vortex la miscela di reazione e, quindi distribuire 2,5 microlitri per i tubi di reazione individuale che sono stati etichettati per NlaIII.
- Per ogni reazione di digestione, aggiungere 2,5 ml di prodotto per PCR per i tubi etichettati. Tutte le reazioni di PCR di prova così come la reazione di controllo positivo deve essere digerito con tutti e tre enzimi di restrizione.
- Vortex reazioni l'attacco, poi centrifugare brevemente le provette.
- Incubare tutte le reazioni di digestione a 37 ° C per 2 ore. Questo incubazione può essere eseguita nel termociclatore. Se lo si desidera, le reazioni possono essere lasciati a 37 ° C durante la notte.
- Trasferire le reazioni a 65 ° C per 15 minuti. Questa operazione può essere eseguita nel termociclatore.
- Aggiungere 1 ml di 60 mM EDTA (fornito con il kit) ad ogni reazione e vortice bene.
6: Analizzare i modelli di restrizione digerire
- Preparare il gel colorante mix, un chip di DNA posto sulla stazione di adescamento chip, e caricare l'impasto sul chip di DNA.
- Pipettare 5 ml di marker del DNA nel pozzo contrassegnati con il simbolo scala e in ciascuno dei 12 pozzi campione sul chip.
Marker del DNA è fornito nel kit del DNA 1000 reagente in una provetta con tappo verde. - Pipettare 1 ml di scala del DNA nel pozzetto contrassegnato con il simbolo scala.
Scaletta del DNA è fornito nel kit 1000 reagente DNA in una provetta con tappo giallo. - Per ognuno dei campioni di DNA, pipettare 1 ml di ogni reazione restrizione digerire in uno dei 12 pozzi campione sul chip secondo le linee guida nella figura sottostante. Usando questo approccio, i pozzi 1-3 sono per le 3 reazioni digestione per il campione di controllo positivo, i pozzi sono 4-6 per i 3 reazioni digestione per il campione di prova 1, 7-9 sono i pozzi per le 3 reazioni digestione per campione 2, e pozzi 10-12 sono per le 3 reazioni di digestione campione 3.Analyze le reazioni digerire restrizione alla Agilent 2100 Bioanalyzer per determinare le lunghezze frammento prodotte durante la digestione. Il DNA Agilent 1000 Kit Guida ha le istruzioni complete per eseguire i chip di laboratorio sul Bioanalyzer. Un protocollo breve è riportato di seguito per vostra comodità.
Figura 2. Organizzazione dei Campioni on Chip.
Se avete meno di 4 campioni di DNA, pipettare 1 ml di acqua nei pozzi inutilizzati. Se si dispone di più di 4 campioni di DNA, è necessario eseguire più di un chip. Si noti che non è necessario eseguire l'esempio positivo di controllo su ogni chip. - Posizionare il chip orizzontalmente l'adattatore del vortex IKA e vortex per 60 secondi a 2400 giri al minuto.
- Inserire il chip nel Agilent 2100 Bioanalyzer e iniziare la corsa chip. I segnali prime in ingresso sono visualizzati nel contesto dello strumento.
Dopo la corsa è terminata, i picchi sono identificati per tutti i campioni utilizzando le impostazioni del picco find. Se credi l'algoritmo non è riuscito a rilevare un picco genuino, si può abbassare la soglia di setpoint altezza ad un valore che consente l'algoritmo per identificare il picco. - Vai al contesto di analisi e selezionare la scheda Chip Riepilogo. Nel campo Nome campione, immettere un nome di esempio per tutti i 12 pozzi sul chip, come illustrato nella figura sottostante.
Figura 3. Campione in ingresso Nome scheda Riepilogo Chip.
7: Identificare la specie di prova del campione utilizzando RFLP Matcher
Il software applicativo Agilent RFLP decoder può essere utilizzato per identificare le specie di pesce per i campioni di DNA alla prova in base alla lunghezza frammento prodotte nelle reazioni di digestione. Tabella 7 attesi Misure frammento di DNA in positivo Dimensione restrizione di controllo prodotto enzimatico attesi (bp) DdeI 117 , 332, 340 HAEIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Le istruzioni fornite qui utilizzare le impostazioni predefinite analisi RFLP Matcher. Fare riferimento al sistema di aiuto del software s per informazioni dettagliate sul funzionamento del software e di interpretare il display.
- Avviare il programma Decoder RFLP.
- Fare clic su File> Apri> XAD file.
La finestra di dialogo Apri will aperto. - Selezionare il file XAD per il chip di DNA che comprendeva le reazioni di restrizione digerire. Fare clic su Apri.
Una finestra di dialogo si aprirà l'elenco dei campioni che sono stati caricati sul chip. - Selezionare tre reazioni digestione corrispondente ad un campione di DNA e specificare l'enzima di restrizione appropriato per ogni campione utilizzando il menu a discesa nella colonna degli enzimi. Nella figura qui sotto, la colonna degli enzimi è stato compilato per il campione di DNA 1.
Figura 4. Specificando enzima di restrizione per ogni campione. - Nel campo altezza del picco minimo in% inferiore marcatore ", il valore predefinito è 10,0%. Se necessario, questo valore può essere abbassato per identificare i piccoli picchi che è stato perso, o portato a scartare i picchi derivanti dal non-specifici rumore nel elettroferogramma. Clicca reintegrare dopo aver effettuato eventuali rettifiche al valore minimo dell'altezza di picco.
Figura 5. Assegnazione Altezza minima di picco. - Clicca Calc in fondo alla finestra di dialogo.
I dati frammento lunghezza ottenute dalla pista Bioanalyzer popoleranno i campi del software. - Nell'elenco punteggio a discesa nell'angolo in alto a sinistra dello schermo, selezionare l'algoritmo appropriato per l'analisi dei dati. Se il campione di pesce in fase di analisi è costituito da una sola specie di pesci, seleziona Dadi (Nei Li) nel punteggio discesa. Se i campioni può essere costituito da una miscela di specie, selezionate Miscela.
La tabella nella parte inferiore dello schermo etichettati punteggio combinato elenca le specie migliori partite sulla base dei risultati di tutte e tre le reazioni digestione. Il nome della specie e il nome comune sono riportati nella tabella (vedi sotto). Partite perfette (quelle con un punteggio di 1) sono evidenziati in verde. Partite evidenziate in giallo sono considerati nei pressi partite. Si può fare doppio clic sul nome di una specie per far apparire la pagina web FishBase per quella specie.
Figura 6. Identificazione specie in base alle digestione. - Nel taglio basso e abbinare i campi di tolleranza nella parte superiore dello schermo, è possibile regolare le impostazioni di default per migliorare il punteggio della corrispondenza migliore specie. Il valore di cutoff più basso viene utilizzata per scartare tutti i frammenti più corto della lunghezza designato in materia. Il valore di tolleranza corrispondere determina quanto vicino di lunghezza un frammento deve essere al frammento previsto per essere considerato una corrispondenza.
- Ripetere i passaggi da 4 a 8 per i campioni di DNA rimanenti che sono stati inclusi in questo stesso chip.
8: Risultati Rappresentante:
L'immagine di un gel Bioanlyzer con campioni restrizione digerire da 4 diverse specie di pesci è mostrato nella figura seguente. I risultati attesi per il campione risultato positivo al DNA sono riassunti nella tabella seguente. 
Figura 7. Bioanalyzer immagine gel di restrizione campioni reazione digerire. Ogni corsia del gel è etichettato con l'enzima di restrizione utilizzati in tale reazione.
Atteso Frammento Taglie DNA nel controllo salmone Positivo
Figura 8. Atteso Frammento Taglie DNA nel controllo salmone positivo.
Discussion
Abbiamo dimostrato una semplice, veloce e preciso basato sul DNA metodo di screening per l'identificazione di specie ittiche nei prodotti ittici. Questo metodo fornisce potenti riproducibile, risultati precisi in meno di un giorno lavorativo e può essere implementato in strutture di collaudo commerciali a causa di protocolli snella e semplice setup. Si caratterizza per la generazione di dati oggettivi che viene analizzata utilizzando RFLP software Decoder con un database di profili espandibile pesce sperimentalmente specie derivate.
Con l'implementazione di routine, questo metodo di prova ha il potenziale per prevenire un'etichettatura erronea di prodotti ittici e assistere a mantenere registrazioni accurate adatto per la conformità con le normative governative.
Disclosures
Gli autori sono impiegati da Agilent Technologies che produce i reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Agilent Stratagene Divisione Prodotti
- Harini Ravi
- Natalia Novorodovskaya
- Scott Basehore
- Jeff Braman
- Rachel Formosa
- Ronda Allen
- Rajesh Bagga
- Derek Sala
- Sarah Jandle
- Danielle Huffman
- Robert Kincaid
- Maria McBride
- Nigel Skinner
- Juergen Schneider
- Stephen Mueller
- Martin Kratzmeier
- Steve Garrett
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer) | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software | Agilent Technologies | G2953CA | G2950CA - desktop PC & Expert Software |
| Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504) | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Thermal Cycler | Various | Various | |
| PCR Strip Tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| PCR Strip Caps | Agilent Technologies | 401425 | |
| 96-Well Working Rack | Agilent Technologies | 410094 | |
| Fish Species Identification System DNA Isolation Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| RFLP Matcher Software | Agilent Technologies | Contact | |
| 100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent) | Various | Various | |
| Sterile, nuclease-free water | Various | Various | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Incubator or water bath set to 65°C | Various | Various | |
| Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene) | Various | Various | |
| round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes) | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various | |
| Microcentrifuge | Various | Various | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Various | Various | |
| Tube rack 1.5ml | Various | Various | |
| Pipette Tips | Various | Various |
References
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology. Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study. J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).
- Dooley, J., Garrett, S. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Agilent Technologies Application Note. , (2005).
- Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species. FSA Final Report Q01069. , (2004).
