Summary
이 책자는 DNA를 추출하여 PCR과 RFLP 분석을 수행하여 물고기의 종류를 식별하기 위해 애질런트의 어종 식별 시스템을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
우리는 신선한 해산물 처리 샘플에있는 물고기의 종류를 식별하는, 빠르고 간단하고 정확하게 DNA 기반의 검사 방법을 개발했습니다. 이 다양한 방법은 애질런트 2100 Bioanalyzer에 해결 및 RFLP 패턴 매칭 소프트웨어를 사용하여 올바른 종 일치될 수 있습니다 단편 패턴을 생성하기 위해 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석에 의해 다음 생선 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 PCR 증폭을 고용합니다.
물고기 식별 방법은 생선 샘플에서 DNA를 분리하는 간단한 안정적인 스핀 컬럼 기반의 프로토콜을 사용합니다. 샘플 솔루션에 핵산을 공개 proteinase K로 처리됩니다. DNA 그런 다음 바인딩 버퍼에 샘플을 정지하고 실리카 기반의 섬유 매트릭스를 포함하는 마이크로 스핀 컵에 로딩에 의해 격리됩니다. 섬유 매트릭스에 샘플 바인딩의 핵산. 고정 핵산은 오염 물질을 제거하기 씻어 있으며, 전체 DNA 100 μl의 최종 볼륨에서 발견됩니다. 고립된 DNA는 모든 생선 genomes에서 발견된 시퀀스에 바인딩 제공된 primers로 PCR 증폭을위한 준비가되었습니다. PCR 제품은 다음 세 가지 제한 효소로 소화와 애질런트 2100 Bioanalyzer에 해결됩니다. 소화 반응에서 생산 조각 길이는 상용 관련된 물고기 종 실험적으로 파생 RFLP 패턴 데이터베이스를 포함하는 소프트웨어를 일치하는 RFLP 패턴을 사용하여 DNA 샘플의 준비를했다고하는 물고기의 종류를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1 : DNA 추출을위한 물고기 샘플 준비
- 테스트 각 물고기 샘플 들어, 단일 1.5 - ML microcentrifuge 관으로, 10 MG 1 G (가공 또는 조리) 사이의 무게, 물고기 조직의 조각을 넣으십시오. 표본의 크기에 따라 생선의 샘플의 무게를 계산하는 지침으로 아래 그림을 사용하십시오.
그림 1. 물고기 샘플의 질량 견적 샘플 크기에 따라. - 65 미리 따뜻한 Proteinase K의 소화 버퍼 ° C 배양기 또는 물 목욕 5 분.
- Proteinase K의 소화 버퍼 및 샘플 당 Proteinase K 20 μl 200 μl를 결합하여 Proteinase K의 작업 솔루션을 준비합니다.
참고 : 각 사용하기 전에 Proteinase K의 새로운 작업 솔루션을 준비합니다. - 물고기 샘플 각각 1.5 ML 튜브에 Proteinase K의 작업 솔루션을 220 μl를 추가합니다. 65 튜브를 품어 ° C 배양기 또는 물 목욕 10 분.
- 펠렛 소화되지 않은 조직에 XG 14,000 3 5 분 microcentrifuge에 튜브를 스핀.
- 새로운 1.5 - ML 튜브에 각 뜨는 150 μl을 전송합니다. 튜브 또는 튜브의 상단에 나타날 수있는 기름진 재료의 바닥에서 소화되지 않은 자료를 전송하지 마십시오. 뜨는 이러한 튜브는 샘플있는 게놈에서 DNA가 추출됩니다.
2 : 게놈 DNA를 추출
- 멸균 용기 (폴리 프로필렌 튜브 또는 유리병)에서 90 % sulfolane 320 μl 및 샘플 당 핵산 바인딩 버퍼의 170 μl를 결합하여 sulfolane과 핵산 바인딩 버퍼의 작업 솔루션을 준비합니다.
당신은 다음 4 주 이내에 검토 계획으로 많은 샘플을 처리하기 위해이 혼합물의 충분한 수량을 준비 할 수 있습니다. 이 혼합물은 실온에서 30까지 일 동안 저장할 수 있습니다. 저장하는 동안 빛을 혼합을 노출하지 마십시오. - 각 물고기 견본 sulfolane / 바인딩 버퍼 혼합 (위의 단계 1에서 준비)의 490 μl를 추가합니다. 소용돌이 또는 pipet 균질 때까지 반복적으로 샘플. 이 혼합물의 추가 640 μl 각 샘플의 전체 볼륨을 가져올 것이다.
- 2 ML 소켓 튜브 내에 자리 (제공) 및 스핀 컵 상단에 튜브의 뚜껑을 스냅되어 DNA 바인딩 스핀 컵 각 샘플을 전송합니다.
- 스핀 컵 매트릭스에 DNA를로드 14,000 XG에서 1 분 microcentrifuge에 샘플을 스핀.
- 제거하고 유지 스핀 컵과 filtrates 폐기하십시오. 각 샘플은 용기 튜브의 스핀 컵 교체 후 1X 높은 소금 와시 버퍼 500 μl를 추가하고 튜브 뚜껑.
- 1 분 14,000 XG에서 microcentrifuge에 샘플을 스핀.
- 제거하고 유지 스핀 컵과 filtrates 폐기하십시오. 각 샘플은 용기 튜브의 스핀 컵을 대체하고 80 % 에탄올 500 μl를 추가하고 튜브 뚜껑.
- 1 분 14,000 XG에서 microcentrifuge에 샘플을 스핀.
- 80 % 에탄올 500 μl 3 세척의 총 단계 7 및 8 두 번 더 반복합니다.
- 80 % 에탄올에서 세번째로 세척 후, 제거하고 스핀 컵을 유지하고 filtrates 폐기하십시오. 자신의 소켓 튜브의 스핀 컵을 교체하고 섬유 매트릭스를 건조 14,000 XG 2 분 microcentrifuge에 스핀.
- 1.5 M1 수집 튜브에 스핀 컵을 전송합니다. 직접 컵 안에있는 섬유 매트릭스의 각 회전 컵에 용출 버퍼 100 μl를 추가합니다. 스핀 컵에 컬렉션 튜브의 뚜껑을 스냅 1 분간 실온에서 알을 품다.
- 1 분 최대 속도에서 microcentrifuge에 샘플을 스핀.
- 정화 DNA는 microcentrifuge 관에서 용출 버퍼에 있습니다. 스핀 컵을 취소하고 튜브 뚜껑. DNA는 최대 1 개월 4 ° C에 저장된 수 있습니다. 장기 저장을 위해, 20의 DNA를 저장 ° C 또는 80 ° C.
- 원하는 경우, 당신은 분광 광도계의 DNA 샘플의 농도를 측정 수 있습니다.
게놈 DNA의 추출 프로토콜은 일반적으로 5 μl / NG 500 NG / μl에 이르기까지 다양한 농도로 샘플을 산출. PCR - RFLP 프로토콜은 0.05에서 μl / NG NG / μl 2000 어디까지 DNA 샘플로 우물을 사용할 수 있습니다.
3 : PCR 반응 설정
- 무균, DNase없는 물을 32 μl와 DNA 주식의 8 μl를 결합하여 긍정적인 제어 연어 DNA의 50 μl / NG 희석을 준비합니다. 섞어 와동.
희석 샘플 ° C 나중에 사용하기 위해 4 저장할 수 있습니다. - 순서 아래의 테이블에 구성 요소를 결합하여 반응을 준비합니다. 에 나열된 볼륨을 조절하여 동시에 실행 될 모든 PCR 반응에 대한 단일 시약 혼합물을 준비테이블. 테스트 DNA 샘플을뿐만 아니라, 긍정적인 제어 반응과 노 - 템플릿 컨트롤 반응을 포함합니다. 각 테스트의 DNA 샘플을 준비 중복 PCR 반응을 권장합니다. 모든 반응 더하기 하나는 반응 부피 초과 정도 시약 혼합물을 준비합니다.
당신이 5 테스트 DNA 샘플이 있으면 검사 반응의 중복을 포함하는 경우 예를 들어, 8 개의 반응 (5 테스트 반응, 1 긍정적인 컨트롤, 1 노 템플릿 컨트롤, 1 초과) 또는 13 반응 중 충분한 시약 혼합물을 준비 (10 중복 검사 반응, 1 긍정적인 컨트롤, 1 노 템플릿 컨트롤 1 초과).
PCR 시약 혼합물구성 요소 볼륨 1 반응 볼륨 5 반응에게 DH 2 O, 불임 9 μl 45 μl 2X PCR 마스터 믹스 12.5 μl 62.5 μl 프리머 믹스 2.5 μl 12.5 μl 총 부피 24 μl 120 μl - 소용돌이는 시약의 혼합은 그럼, 각각의 얇은 벽의 PCR 반응 관 24 μl를 배포합니다.
- 긍정적인 제어 반응 관에 희석 긍정적인 제어 DNA 1 μl를 추가합니다. 테스트 샘플 튜브하려면, 테스트 DNA 샘플 1 μl를 추가합니다. 노 템플릿 컨트롤 반응은 DNA 대신에 DNase 무료 물 1 μl를 추가합니다.
교차 오염을 방지하기 위해, 각각의 DNA 샘플을위한 신선한 pipet 팁을 사용합니다. 예제를 추가 후, 신속 튜브의 내용을 pipetting 아래로 반응을 섞는다. - 간단히 튜브를 혼합하고 원심 분리기에 반응 튜브, 소용돌이 튜브 캡.
4 : PCR 프로토콜을 실행
- 열 자전거 타는 사람의 반응을 놓고 아래와 같이 PCR 프로그램을 실행합니다.
PCR 사이클링 프로토콜세그먼트 사이클 수 온도 존속 기간 1 1 95 ° C 오분 2 40 95 ° C
50 ° C
72 ° C30초
30초
30초3 1 72 ° C 7분
5 : 제한 효소로 다이제스트 PCR 제품
- 라벨 0.5 - ML 튜브 또는 제한 다이제스트 반응을 위해 사용됩니다 0.2 - ML 스트립 튜브. DdeI, HaeIII 및 NlaIII : 각 PCR 반응은 3 가지 다른 제한 효소로 소화합니다. 따라서, 각각의 PCR 반응에 대해, PCR 샘플의 이름과 제한 효소의 이름으로 별도의 세 가지 튜브 라벨.
- 순서 아래의 구성 요소를 결합하여 DdeI의 digestions위한 시약 혼합물을 준비합니다. 각 구성 요소의 배수를 사용하는 모든 DdeI의 소화 반응 (더하기 하나 이상의 반응 볼륨 초과)에 대한 단일 시약 혼합물을 준비합니다. PCR이 완료되면, PCR 반응은 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석을위한 제한 효소로 처리됩니다.
DdeI의 소화 시약 혼합물구성 요소 음량 DH 2 O, 불임 1.5 μl 10X DdeI 버퍼 0.5 μl 10X DdeI 효소 0.5 μl - 소용돌이는 시약의 혼합은, 그럼 DdeI에 대한 라벨이 붙지만 개별 반응 튜브 2.5 μl를 배포합니다.
- 순서 아래의 구성 요소를 결합하여 HaeIII의 digestions위한 시약 혼합물을 준비합니다. 각 구성 요소의 배수를 사용하는 모든 HaeIII의 소화 반응 (더하기 하나 이상의 반응 볼륨 초과)에 대한 단일 시약 혼합물을 준비합니다.
HaeIII의 소화 시약 혼합물구성 요소 음량 DH 2 O, 불임 1.5 μl 10X HaeIII 버퍼 0.5 μl 10X HaeIII 효소 0.5 μl - 소용돌이는 시약의 혼합은, 그럼 HaeIII에 대한 라벨이 붙지만 개별 반응 튜브 2.5 μl를 배포합니다.
- 에 대한 시약 혼합물을 준비순서 아래의 구성 요소를 결합하여 NlaIII의 digestions가. 각 구성 요소의 배수를 사용하는 모든 NlaIII의 소화 반응 (더하기 하나 이상의 반응 볼륨 초과)에 대한 단일 시약 혼합물을 준비합니다.
NlaIII의 소화 시약 혼합물구성 요소 음량 DH 2 O, 불임 1.5 μl 10X NlaIII 버퍼 0.5 μl 10X NlaIII 효소 0.5 μl - 소용돌이는 시약의 혼합은, 그럼 NlaIII에 대한 라벨이 붙지만 개별 반응 튜브 2.5 μl를 배포합니다.
- 각 소화 반응은 표시된 튜브에 적절한 PCR 제품의 2.5 μl를 추가합니다. 테스트 PCR 반응뿐만 아니라 긍정적인 반응 제어의 모든 세 가지 제한 효소로 소화해야합니다.
- 소용돌이 소화 반응은 다음 간단히 튜브를 원심 분리기.
- 37 ° C 2 시간 동안 모든 소화 반응을 품어. 이 부화는 온도 자전거 타는 사람으로 수행할 수 있습니다. 원하는 경우, 반응 ° C 야간 37 남아있을 수 있습니다.
- ° C 15 분 65 반응을 전송합니다. 이 단계는 열 자전거 타는 사람으로 수행할 수 있습니다.
- 물론 각각의 반응과 와동 60 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (키트와 함께 제공) 1 μl를 추가합니다.
6 : 제한 다이제스트 패턴을 분석
- 젤 염색 믹스를 준비, 칩 마중물 역에서 DNA 칩을 배치하고, DNA 칩에 믹스를로드합니다.
- 잘 래더 기호와 칩 12 샘플 우물의 각에 표시된에 DNA 마커의 Pipet 5 μl.
DNA 표지는 녹색 덮인 튜브의 DNA 1,000 시약 키트에 제공됩니다. - 잘 사다리 기호로 표시된에 DNA를 사다리 Pipet 1 μl.
DNA의 사다리는 노란색 덮인 튜브의 DNA 1,000 시약 키트에 제공됩니다. - DNA 샘플을 각각 들어, 아래 그림에있는 지침에 따라 칩 12 샘플 우물 중 하나에 각각 제한 소화 반응의 pipet 1 μl. 이 방법을 사용하여, 우물 1-3은 긍정적인 컨트롤 샘플 3 소화 반응에 대한 있으며, 우물 4-6는 테스트 샘플 2 3 소화 반응를위한 테스트 샘플 1, 우물 7-9에서 3 소화 반응에 대한 있으며, 그리고 우물 10-12는 소화하는 동안 생산 조각의 길이를 결정하기 위해 애질런트 2100 Bioanalyzer에 제한 다이제스트 반응을 3.Analyze 테스트 샘플에 대해 3 소화 반응위한 것입니다. 애질런트 DNA 1000 키트 가이드 Bioanalyzer에 실험실 칩을 실행하기위한 완벽한 지침을했다. 간단한 프로토콜은 사용자의 편의를 위해 아래에 제공됩니다.
그림 2. 칩 샘플 조직입니다.
당신이 사용하지 않는 우물에 이하 4 개 이상의 DNA 샘플, 물 pipet 1 μl가있다면. 당신은 4 DNA 샘플 이상이있다면, 당신은 두 개 이상의 칩을 실행해야합니다. 그것은 모든 칩에 긍정적인 컨트롤 샘플을 실행하는 데 필요한되지 않습니다. - 2,400 rpm으로 60 초 동안 이카의 와동 믹서 및 와동의 어댑터에 수평으로 칩을를 놓습니다.
- 애질런트 2100 Bioanalyzer에 칩을 삽입하고 칩 실행을 시작합니다. 수신 신호는 원시 악기 컨텍스트에 표시됩니다.
실행이 완료되면, 봉우리는 알고리즘을 발견 정상의 설정을 사용하는 모든 샘플에 대한 식별됩니다. 당신이 알고리즘 정품 피크를 감지하는 데 실패했습니다 믿으면, 당신은 알고리즘이 절정을 식별할 수있는 값을 높이 임계값 설정점를 낮출 수 있습니다. - 검정 컨텍스트로 이동하여 칩 요약 탭을 선택합니다. 샘플 이름 필드에 아래 그림에 표시된 칩의 모든 12 우물에 대한 샘플 이름을 입력합니다.
그림 3. 칩 요약 탭의 이름을 입력 샘플.
7 : RFLP Matcher를 사용하여 테스트 샘플 수종을 식별
애질런트 소프트웨어 응용 프로그램을 RFLP 디코더는 소화 반응에서 생산되는 조각의 길이에 따라 테스트 DNA 샘플에 대한 어종을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 테이블은 긍정적인 제어 제한 효소 예상 제품 크기 (BP) DdeI 117 7 예상의 DNA 단편 크기 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 지시 RFLP Matcher에 기본 분석 설정을 사용 여기에 제공됩니다. 소프트웨어를 운영하고 디스플레이를 해석에 대한 자세한 내용은 소프트웨어의 도움말 시스템을 참조하십시오.
- RFLP의 디코더 프로그램을 실행합니다.
- 파일> 열기> XAD 파일을 클릭합니다.
열기 대화 상자 윌난 엽니다. - 제한 다이제스트 반응을 포함하는 DNA 칩에 대한 XAD 파일을 선택합니다. 열기를 클릭합니다.
대화 상자가 칩에 로드된 있던 샘플 목록이 열립니다. - 한 DNA 샘플에 대응하는 세 소화 반응을 선택하고 드롭 다운 효소 열 아래 메뉴를 사용하여 각 시료에 대한 적절한 제한 효소를 지정합니다. 아래 그림에서 효소 열은 DNA 샘플 1 작성되었습니다.
그림 4. 각 샘플에 대한 제한 효소를 지정. - 낮은 마커 "의 %로 분 피크 높이 입력란에서 기본값은 10.0 %입니다. 필요한 경우이 값을보고되었다 작은 봉우리를 식별할 인하, 또는이 아닌 특정 소음으로 인한 봉우리를 폐기하기 위해 제기 수 있습니다 electropherogram가. 분 피크 높이 값에 조정을 한 후 Reintegrate를 클릭하십시오.
그림 5. 최소 피크 높이 지정. - 대화 상자 하단의 CALC를 클릭하십시오.
Bioanalyzer 실행에서 얻은 단편 길이 데이터 소프트웨어 필드를 채웁니다. - 화면의 왼쪽 상단에있는 점수가 드롭 다운 목록에서 데이터의 분석에 적합한 알고리즘을 선택합니다. 분석되고있는 물고기 시료는 단일 어종으로 구성되어있다면, 점수가 드롭 다운 목록에서 다이스 (네이 리)를 선택합니다. 샘플 종의 혼합물로 구성되어있다면, 혼합을 선택합니다.
화면의 하단에있는 테이블 결합 점수가 세 소화 반응의 결과에 따라 최고의 종 일치하는 목록을 표시. 종의 이름뿐 아니라 일반적인 이름 (아래 참조) 테이블에 나열되어 있습니다. 완벽한 일치 (1의 점수를 가진 사람) 녹색으로 강조 표시됩니다. 노란색으로 강조 일치는 일치 근처로 간주됩니다. 그 종족에 대한 FishBase 웹페이지를 표시하는 종의 이름을 두 번 클릭할 수도 있습니다.
그림 6. 수종 식별은 소화를 기반으로. - 화면 상단의 낮은 컷오프 및 검색 허용 분야에서는 최고의 종 경기의 점수를 향상시키기 위해 기본 설정을 조정할 수 있습니다. 낮은 컷오프 값은 필드에 지정된 길이보다 짧은 모든 조각을 폐기하는 데 사용됩니다. 검색 허용 값은 길이 조각이 일치 고려해야 할 예측 조각을해야합니다 얼마나 가까 운지 결정합니다.
- 반복이 같은 칩에 포함된 나머지 DNA 샘플을 8 통해 4 단계를 반복합니다.
8 : 대표 결과 :
4 가지 어종의 제한 다이제스트 샘플 Bioanlyzer 젤의 이미지는 아래 그림에 표시됩니다. 긍정적인 DNA 샘플에 대한 예상 결과는 아래 표에 요약되어 있습니다. 
그림 7. 제한 다이제스트 반응 샘플 Bioanalyzer 겔 이미지. 각 겔 레인은 그 반응에 사용되는 제한 효소로 표시됩니다.
연어 긍정적인 컨트롤의 예상의 DNA 단편 크기
그림 8. 연어 긍정적인 컨트롤의 예상 DNA 조각의 크기.
Discussion
우리는 해산물 제품에 물고기 종의 식별을위한 간단하고 빠르고, 정확하고 DNA 기반의 검사 방법을 보여줍니다. 이 강력한 방법은 채 작업을 하루에 재현할, 정확한 결과를 제공하고 그것은 능률적인 프로토콜과 간단한 설정으로 인해 상용 테스트 시설을 구현할 수 있습니다. 이것은 실험적으로 파생 물고기 종 프로필 확장형 데이터베이스 RFLP 디코더 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다 객관적인 데이터의 생성이 특징입니다.
일상적인 구현으로,이 시험 방법은 해산물 제품의 mislabeling을 방지하고 정부 규정 준수에 적합한 정확한 기록을 유지하는데 도움을 가능성이 있습니다.
Disclosures
저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 애질런트 테크놀로지에 의해 고용됩니다.
Acknowledgments
애질런트 Stratagene 제품 부문
- Harini 라비
- 나탈리아 Novorodovskaya
- 스콧 Basehore
- 제프 브래먼
- 레이첼 포모사
- 론다 앨런
- 라제쉬 Bagga
- 데릭 홀
- 사라 Jandle
- 다니엘 허프만
- 로버트 킨케이드
- 메리 맥브라이드
- 니겔 스키너
- Juergen는 슈나이더
- 스테판 뮬러
- 마틴 Kratzmeier
- 스티브 가레트
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer) | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software | Agilent Technologies | G2953CA | G2950CA - desktop PC & Expert Software |
| Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504) | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Thermal Cycler | Various | Various | |
| PCR Strip Tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| PCR Strip Caps | Agilent Technologies | 401425 | |
| 96-Well Working Rack | Agilent Technologies | 410094 | |
| Fish Species Identification System DNA Isolation Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit | Agilent Technologies | Contact | |
| RFLP Matcher Software | Agilent Technologies | Contact | |
| 100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent) | Various | Various | |
| Sterile, nuclease-free water | Various | Various | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Incubator or water bath set to 65°C | Various | Various | |
| Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene) | Various | Various | |
| round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes) | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various | |
| Microcentrifuge | Various | Various | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Various | Various | |
| Tube rack 1.5ml | Various | Various | |
| Pipette Tips | Various | Various |
References
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology. Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study. J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).
- Dooley, J., Garrett, S. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Agilent Technologies Application Note. , (2005).
- Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species. FSA Final Report Q01069. , (2004).
