DNA-baserade Fiskarter Identification protokoll

Summary

Denna publikation beskriver hur du använder Agilent Fish System artbestämning att identifiera arter av en fisk genom att extrahera DNA och utföra PCR och RFLP analys.

Abstract

Vi har utvecklat en snabb, enkel och exakt DNA-baserad screening metod för att identifiera de fiskarter som finns i färska och bearbetade skaldjur prover. Denna mångsidiga metod använder PCR-amplifiering av genomiska DNA extraherat från fisk prover, följt av begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) analys för att generera fragment mönster som kan lösas på Agilent 2100 Bioanalyzer och matchas till rätt art med hjälp av RFLP mönstermatchning programvara.

Fisken identifiering metoden använder en enkel, pålitlig, spin kolumn-baserat protokoll för att isolera DNA från fisk prover. De prover som är behandlade med proteinas K att frigöra nukleinsyror i lösning. DNA är sedan isoleras genom att avbryta provet i bindande buffert och lastning på en mikro-spin kopp som innehåller en silica-baserad fiber matris. Den nukleinsyror i provet binder till fibern matrisen. Den immobiliserade nukleinsyror tvättas för att avlägsna föroreningar, och den totala DNA återvinns i en slutlig volym på 100 l. De isolerade DNA är klar för PCR-amplifiering med de medföljande primers som binder till sekvenser som finns i all fisk genom. PCR-produkterna är sedan kokas med tre olika restriktionsenzymer och beslutade om Agilent 2100 Bioanalyzer. Fragmentet längder tillverkas i matsmältningen reaktioner kan användas för att bestämma de arter av fisk från vilken DNA-prov var beredd, med hjälp av RFLP mönstermatchning programvara som innehåller en databas med experimentellt härledda RFLP mönster från kommersiellt relevanta fiskarter.

Protocol

1: Förbered fisk Prover för DNA-extraktion

1. För varje fisk prov som ska testas, placera en bit av fisken vävnad, som väger mellan 10 mg och 1 g (rå eller kokt), till en enda 1,5 ml mikrocentrifugrör. Använd bilden nedan som en riktlinje för att uppskatta vikten av en rå fisk prov baserade på urval.
   
   
   Figur 1. Mass Uppskattningar av alla fiskprover Baserat på urval.
   
   
2. Förvärma proteinas K Digestion buffert till 65 ° C i 5 minuter i en inkubator eller vattenbad.
3. Bered en brukslösning av proteinas K genom att kombinera 200 ìl proteinas K Matsmältning Buffer och 20 l proteinas K per prov.
   OBS: Förbered en ny brukslösning av proteinas K före varje användning.
4. Tillsätt 220 ìl av proteinas K fungerande lösning för varje 1,5 ml tub av fisk prov. Inkubera rören vid 65 ° C i 10 minuter i en inkubator eller vattenbad.
5. Snurra rören i en mikrocentrifug för 3 5 minuter på 14.000 xgi till pellets något osmält vävnader.
6. Överför 150 l av varje supernatant till ett nytt 1,5 ml rör. Undvika att överföra något osmält material från botten av röret eller något oljig material som kan finnas på toppen av röret. Dessa rör av supernatanten är de prover som genomiska DNA kommer extraheras.

2: Extrahera Genomic DNA

1. I en steril behållare (polypropylen rör eller glasflaska), förbereda en fungerande lösning av sulfolane och nukleinsyra bindningsbuffert genom att kombinera 320 l på 90% sulfolane och 170 l av nukleinsyra bindningsbuffert per prov.
   Du kanske vill förbereda en tillräcklig mängd av denna blandning för att behandla så många prover som du planerar att granska inom de närmaste fyra veckorna. Denna blandning kan förvaras i upp till 30 dagar vid rumstemperatur. Undvik att utsätta blandningen för ljus under lagring.
2. Tillsätt 490 ìl av sulfolane / bindningsbuffert blandning (utarbetad i steg 1 ovan) till varje fisk prov. Vortex eller pipettera provet tills homogeniserad. Tillägget av denna blandning kommer det totala volymen av varje prov till 640 l.
3. Överför varje prov till ett DNA-bindande Spin Cup som har suttit i ett 2-ml-kärl rör (medföljer) och knäppa av locket på röret på toppen av spin koppen.
4. Snurra prover i en mikrocentrifug under 1 minut på 14.000 xg för att ladda DNA på spin koppen matrisen.
5. Ta bort och behåll snurra koppar och kasta filtraten. För varje prov, byt snurra koppen i kärlet röret, lägg sedan till 500 ìl 1x höga salt tvättbuffert och förslut röret.
6. Snurra prover i en mikrocentrifug på 14.000 xg i 1 minut.
7. Ta bort och behåll snurra koppar och kasta filtraten. För varje prov, byt snurra koppen i kärlet röret, lägg sedan till 500 ìl av 80% etanol och förslut röret.
8. Snurra prover i en mikrocentrifug på 14.000 xg i 1 minut.
9. Upprepa steg 7 och 8 två gånger för totalt 3 tvättar med 500 l på 80% etanol.
10. Efter det tredje tvätt i 80% etanol, ta bort och behålla snurra koppar och kasta filtraten. Byt spin koppar i sina kärl rör och snurra i mikrocentrifug i 2 minuter på 14.000 xgi att torka fibern matrisen.
11. Överför snurra koppar till 1,5-M1 samling rör. Tillsätt 100 ìl Elution buffert i varje dragning kopp direkt på fibermatris inuti koppen. Snap locken av samlingen rören på spin koppar och inkubera vid rumstemperatur i 1 minut.
12. Snurra prover i en mikrocentrifug med maximal hastighet under 1 minut.
13. Det renade DNA är i Elution buffert i mikrocentrifugrör. Kasta spin kopp och lock rören. De DNA kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad. För långtidsförvaring, förvara DNA vid 20 ° C eller 80 ° C.
14. Om så önskas kan man mäta koncentrationen av DNA-prover i en spektrofotometer.

Arvsmassans DNA-extraktion protokoll ger ofta prov med en koncentration på mellan 5 ng / l till 500 ng / l. PCR-RFLP-protokollet fungerar brunnar med DNA-prover varierar allt från 0,05 ng / l till 2000 ng / l.

3: Ställ in PCR-reaktioner

1. Förbered en 50 ng / l utspädning av den positiva kontrollen laxen DNA genom att kombinera 8 ìl av DNA-lager med 32 ìl av sterila, DNas-fritt vatten. Vortex att blanda.
   Den utspädda provet kan förvaras vid 4 ° C för framtida bruk.
2. Förbered reaktioner genom att kombinera komponenter i tabellen nedan i ordning. Förbered en enda blandningen för alla PCR-reaktioner som ska köras samtidigt genom ökning av de volymer som anges ibord. Förutom de prover är DNA, inkluderar en positiv kontroll reaktion och en nej-mall kontroll reaktion. Förbereda dubbla PCR-reaktioner för varje test-DNA-prov rekommenderas. Förbered nog blandningen för alla dina reaktioner plus en reaktion volym överskott.
   Till exempel, om du har 5 prover DNA, förbereda nog blandningen för antingen 8 reaktioner (5 testa reaktioner, en positiv kontroll, en no-mall kontroll, och ett överskott) eller 13 reaktioner om du är bland dubbletter av testet reaktioner (10 duplicera testa reaktioner, en positiv kontroll, en no-mall kontroll och ett överskott).
   PCR-blandningen

   Komponent	Volym 1 Reaktion	Volym 5 Reaktioner
   dH 2 O, sterilt	9 l	45 l
   2x PCR Master Mix	12,5 l	62,5 l
   Primermix	2,5 l	12,5 l
   Total volym	24 l	120 l

3. Vortexa blandningen ja, då distribuera 24 l till varje enskild tunnväggiga PCR-reaktion röret.
4. Tillsätt 1 l av den utspädda positiv kontroll DNA för att den positiva kontrollen reaktionsrör. För att rören provet, tillsätt 1 l av test-DNA-prov. För ingen mall kontroll reaktion, tillsätt 1 ìl av DNas-fritt vatten i stället för DNA.
   För att undvika korskontaminering, använd en ny pipettspetsen för varje DNA-prov. Efter att ha lagt provet, blanda reaktionen genom att snabbt pipettering innehållet i röret upp och ner.
5. Cap reaktionen rör, Vortexa rören för att blanda och centrifugera rören kortfattat.

4: Kör PCR-protokollet

1. Placera reaktioner i termocykeln och kör PCR-programmet visas nedan.
   PCR-Cykling Protokoll

   Segment	Antal cykler	Temperatur	Varaktighet
   1	1	95 ° C	5 minuter
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 sekunder 30 sekunder 30 sekunder
   3	1	72 ° C	7 minuter

5: Digest PCR-produkter med restriktionsenzymer

1. Märk 0,5 ml rör eller 0,2 ml rör band som ska användas för begränsning smälta reaktioner. Varje PCR-reaktionen kommer att kokas med tre olika restriktionsenzymer: DdeI, HaeIII och NlaIII. För varje PCR-reaktion, etikett tre separata rör med namnet på PCR-provet och namnet på den begränsningen enzym.
2. Förbered blandningen för DdeI digestions genom att kombinera komponenter nedan i ordning. Förbered en enda blandningen för alla DdeI matsmältningen reaktioner (plus minst en reaktion volym överskott) med multiplar av varje komponent. När PCR är klar, är PCR-reaktioner behandlas med restriktionsenzymer för begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) analys.
   DdeI Digestion blandningen

   Komponent	Volym
   dH 2 O, sterilt	1,5 l
   10x DdeI Buffer	0,5 l
   10x DdeI enzym	0,5 l

3. Vortexa blandningen ja, då distribuera 2,5 l till individen reaktionsrören som var märkta för DdeI.
4. Förbered blandningen för HaeIII digestions genom att kombinera komponenter nedan i ordning. Förbered en enda blandningen för alla HaeIII matsmältningen reaktioner (plus minst en reaktion volym överskott) med multiplar av varje komponent.
   HaeIII Digestion blandningen

   Komponent	Volym
   dH 2 O, sterilt	1,5 l
   10x HaeIII Buffer	0,5 l
   10x HaeIII enzym	0,5 l

5. Vortexa blandningen ja, då distribuera 2,5 l till individen reaktionsrören som var märkta för HaeIII.
6. Förbered blandningen förNlaIII digestions genom att kombinera komponenter nedan i ordning. Förbered en enda blandningen för alla NlaIII matsmältningen reaktioner (plus minst en reaktion volym överskott) med multiplar av varje komponent.
   NlaIII Digestion blandningen

   Komponent	Volym
   dH 2 O, sterilt	1,5 l
   10x NlaIII Buffer	0,5 l
   10x NlaIII enzym	0,5 l

7. Vortexa blandningen ja, då distribuera 2,5 l till individen reaktionsrören som var märkta för NlaIII.
8. För varje matsmältning reaktion, tillsätt 2,5 l av lämplig PCR-produkten för att den märkta rör. Alla testet PCR-reaktioner såväl som positiv kontroll reaktionen måste kokas med alla tre restriktionsenzymer.
9. Vortexa matsmältningen reaktioner och sedan snabbt centrifugera rören.
10. Inkubera alla matsmältningen reaktioner vid 37 ° C i 2 timmar. Detta inkubationstiden kan utföras i apparaten. Om så önskas kan reaktioner lämnas vid 37 ° C över natten.
11. Överför reaktionerna på 65 ° C i 15 minuter. Detta steg kan utföras i apparaten.
12. Tillsätt 1 l av 60 mM EDTA (medföljer kitet) till varje reaktion och virvel också.

6: Analysera begränsningen smälta mönster

1. Förbered gel-dye mix, placera en DNA-chip på chippet grundning stationen, och ladda blandningen på DNA-chip.
2. Pipettera 5 ìl av DNA-markör i den markerade väl med stege symbol och i varje av de 12 provbrunnar på chipet.
   DNA-markör finns i DNA-1000 reagenskit i en grön-begränsade rör.
3. Pipettera 1 l DNA-stege i det markerade bra med en stege symbol.
   DNA stege finns i DNA-1000 reagenskit i en gul-begränsade rör.
4. För varje DNA-prover, Pipettera 1 l av varje begränsning smälta reaktion till en av de 12 provbrunnar på chippet enligt de riktlinjer som i figuren nedan. Med hjälp av denna metod, brunnar 1-3 är för de 3 matsmältningen reaktioner för det positiva kontrollprovet, brunnar 4-6 är för 3 matsmältningen reaktioner för prov 1, brunnar 7-9 är för 3 matsmältningen reaktioner för prov 2, och brunnar 10-12 är för 3 matsmältningen reaktioner för prov 3.Analyze reaktionerna begränsning smälta på Agilent 2100 Bioanalyzer att bestämma fragment längder som produceras under matsmältningen. Den Agilent DNA-1000 Kit Guide har fullständiga instruktioner för drift labbet marker på Bioanalyzer. En kort protokoll finns nedan för din bekvämlighet.
   
   
   Figur 2. Organisation av prover på Chip.
   
   Om du har mindre än 4 DNA-prover, Pipettera 1 l vatten i oanvända brunnar. Om du har mer än 4 DNA-prover, måste du köra fler än ett chip. Observera att det inte är nödvändigt att köra det positiva kontrollprovet på varje chip.
5. Placera chippet horisontellt i adaptern för IKA vortexblandare och skaka i 60 sekunder vid 2400 rpm.
6. Sätt in marker i Agilent 2100 Bioanalyzer och starta chip springa. De inkommande råa signaler visas i instrumentet sammanhang.
   Efter körningen är klar, finns toppar identifieras för alla prover med inställningarna på toppen finner algoritmen. Om du tror att algoritmen har misslyckats med att upptäcka en äkta topp, kan du sänka börvärdet Höjd tröskeln till ett värde som gör att algoritmen för att identifiera toppen.
7. Gå till analys sammanhang och välj Chip fliken Sammanfattning. I exemplet fältet Namn skriver du ett prov namn för alla 12 brunnar på chipet som visas i figuren nedan.
   
   
   Figur 3. Sample Name Entry i Chip fliken Sammanfattning.

7: Identifiera de arter provet med hjälp av RFLP Matcher

Den Agilent programmet RFLP Decoder kan användas för att identifiera de fiskarter för proverna DNA baserad på fragmentet längder som produceras i matsmältningen reaktioner. 7 Förväntad DNA-fragment storlekar i positiv kontroll begränsning Förväntad enzymprodukt Storlek (bp) DdeI 117 Tabell , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Instruktionerna som ges använder standardinställningarna för analys i RFLP Matcher. Se programmet s hjälpsystemet för detaljerad information om programmets användning och tolka displayen.

1. Starta RFLP Decoder programmet.
2. Klicka på Arkiv> Öppna> XAD fil.
   I dialogrutan Öppna till öppna.
3. Välj XAD filen för DNA-chip som ingår reaktionerna begränsningen smälta. Klicka på Öppna.
   En dialogruta öppnas uppräkning av prover som lastades på chipet.
4. Välj tre matsmältningen reaktioner motsvarande ett DNA-prov och ange lämpliga begränsningar enzym för varje prov med hjälp av rullgardinsmenyerna under Enzyme kolumnen. I figuren nedan har det enzym kolumnen fyllts ut för DNA-prov 1.
   
   
   Figur 4. Ange Restriktionsenzymanalys för varje prov.
   
   
5. I fältet min topphöjden i% av lägre markör "är standardvärdet 10,0%. Vid behov kan detta värde sänkas för att identifiera små toppar som missade eller tog att göra sig topparna från icke-specifik buller i electropherogram. Klicka Återanpassa efter att göra några justeringar av min topphöjden värde.
   
   
   Figur 5. Tilldela Minsta topphöjden.
   
   
6. Klicka Calc längst ned i dialogrutan.
   Fragmentet Längd uppgifter som erhållits från Bioanalyzer köra befolkar programvaran fält.
7. I resultatet listrutan i det övre vänstra hörnet av skärmen, välj lämplig algoritm för analys av data. Om fisken prov som analyseras består av en enda fiskart, välj Dice (Nei Li) i partituret listrutan. Om proven kan bestå av en blandning av arter, välj Blandning.
   I tabellen längst ner på skärmen märkt kombinerad ställning listar de bästa arterna matchningar baserat på resultaten av alla tre matsmältningen reaktioner. Artnamnet samt det gemensamma namnet är listade i tabellen (se nedan). Perfekt matcher (de med ett resultat på 1) är markerade i grönt. Matcher markerade med gult anses vara nära matcher. Du kan dubbelklicka på ett artnamn för att få fram FishBase hemsida för denna art.
   
   
   Figur 6. Artbestämning Baserat på matsmältningen.
   
   
8. I den nedre cutoff och matchande fält tolerans längst upp på skärmen kan du justera standardinställningarna för att förbättra resultatet av de bästa arterna matchen. Det lägre Gränsvärdet används för att slänga bort fragment kortare än längden som anges i fältet. Matchen tolerans värdet avgör hur nära i längd ett fragment måste vara att den förutspådda fragment anses vara en match.
9. Upprepa steg 4 till 8 för de återstående DNA-prover som togs upp på samma chip.

8: representativa resultat:

En bild av en Bioanlyzer gel med prover begränsning smälta från 4 olika fiskarter visas i figuren nedan. De förväntade resultaten för den positiva DNA-provet sammanfattas i tabellen nedan.


Figur 7. Bioanalyzer gel bild av begränsning smälta reaktion prover. Varje gel körfält är märkt med restriktionsenzymanalys används i reaktionen.

Förväntad DNA-fragment storlekar i Salmon positiv kontroll

Figur 8. Förväntad DNA-fragment storlekar i Salmon positiva kontrollen.

Discussion

Vi visar ett enkelt, snabbt och korrekt DNA-baserad screening metod för identifikation av fiskarter i skaldjursprodukter. Denna kraftfulla metod ger reproducerbara, exakta resultat på mindre än en arbetsdag och det kan implementeras i kommersiella testanläggningar på grund av strömlinjeformade protokoll och enkel installation. Den kännetecknas av den generation av objektiva data som analyseras med RFLP dekoderprogramvara med en utbyggbar databas med experimentellt härledda profiler fiskarter.

Med rutin genomförande har denna testmetod potential att förhindra mislabeling av fisk-och skaldjursprodukter och bidra till att upprätthålla korrekta register lämpar sig för att följa statliga föreskrifter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various