DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol

Summary

Deze publicatie wordt beschreven hoe u de Agilent Vissoorten Identification System te gebruiken om de soort van een vis te identificeren door extractie van DNA en het uitvoeren van PCR en RFLP-analyse.

Abstract

We hebben een snelle, eenvoudige en nauwkeurige DNA-gebaseerde screening methode om de vissoorten die in verse en verwerkte zeevruchten monsters te identificeren. Deze veelzijdige methode maakt gebruik van PCR-amplificatie van genomisch DNA uit vis monsters, gevolgd door een restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) analyse fragment patronen die kunnen worden opgelost op de Agilent 2100 Bioanalyzer en afgestemd op het juiste soort gebruik van RFLP pattern matching-software te genereren.

De vis identificatie methode maakt gebruik van een eenvoudige, betrouwbare, spin kolom-gebaseerd protocol om DNA te isoleren uit vis monsters. De monsters worden behandeld met proteinase K aan de nucleïnezuren introductie in oplossing. DNA wordt vervolgens geïsoleerd door schorsing van de sample in de bindende buffer en het laden op een micro-spin cup met een silica-gebaseerde glasvezel matrix. De nucleïnezuren in het monster binden aan de vezel matrix. Het geïmmobiliseerde nucleïnezuren worden gewassen om verontreinigingen te verwijderen, en de totale DNA is teruggevonden in een eindvolume van 100 ul. De geïsoleerde DNA is klaar voor PCR-amplificatie met de meegeleverde primers die zich binden aan sequenties in alle vis genomen. De PCR-producten worden dan verteerd met drie verschillende restrictie-enzymen en opgelost op Agilent 2100 Bioanalyzer. Het fragment lengtes geproduceerd in de spijsvertering reacties kunnen worden gebruikt om de vissoorten waarvan het DNA-monster werd bereid te bepalen, het gebruik van de RFLP patroon matching-software, die een databank van experimenteel afgeleide RFLP patronen van commercieel relevante vissoorten.

Protocol

1: Maak de vis monsters voor DNA-extractie

1. Voor elke vis te testen monster, een stukje weefsel van de vis, met een gewicht tussen 10 mg en 1 g (rauw of gekookt), in een enkele 1,5-ml microcentrifugebuis. Gebruik de onderstaande figuur als een leidraad voor het schatten van het gewicht van een rauwe vis steekproef op basis van de steekproefomvang.
   
   
   Figuur 1. Massa Schattingen van Fish monsters op basis van de steekproefomvang.
   
   
2. Pre-warm het proteïnase K spijsvertering Buffer tot 65 ° C gedurende 5 minuten in een couveuse of waterbad.
3. Bereid een werkende oplossing van proteïnase K door het combineren van 200 ul van proteïnase K Spijsvertering Buffer en 20 ul van proteïnase K per monster.
   Let op: Maak een nieuw werkende oplossing van proteïnase K voor elk gebruik.
4. Voeg 220 ul van het proteïnase K werkende oplossing voor elke 1,5 ml tube van vis monster. Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 10 minuten in een couveuse of waterbad.
5. Spin de buizen in een microcentrifuge voor de 3 5 minuten bij 14.000 xg te pellet een onverteerd weefsels.
6. Overdracht 150 ul van elk supernatant in een verse 1,5-ml-buis. Vermijd de overdracht van een onverteerd materiaal uit de bodem van de buis of een olieachtige stof die aanwezig kunnen zijn aan de bovenkant van de buis. Deze buizen van supernatant worden de monsters uit die genomische DNA zal worden geëxtraheerd.

2: Extract Genomic DNA

1. In een steriele container (polypropyleen buis of glazen fles), bereidt een werkende oplossing van sulfolaan en Nucleic Acid Binding Buffer door het combineren van 320 ul van 90% sulfolaan en 170 ul van Nucleic Acid Binding Buffer per monster.
   Misschien wilt u een voldoende hoeveelheid van dit mengsel te bereiden om zo veel samples proces als u van plan bent om na te gaan in de komende 4 weken. Dit mengsel kan worden opgeslagen voor maximaal 30 dagen bij kamertemperatuur. Niet bloot te stellen het mengsel aan het licht tijdens de opslag.
2. Voeg 490 ul van de sulfolaan / Binding Buffer mengsel (bereid in stap 1 hierboven) om elke vis monster. Vortex of pipet het monster totdat gehomogeniseerd. De toevoeging van dit mengsel zal het totale volume van elk monster tot 640 ul.
3. Overdracht elk monster om een ​​DNA-bindend Spin Cup die is geworteld in een 2-ml bakje buis (meegeleverd) en druk de dop van de tube op de bovenkant van de spin beker.
4. Spin de monsters in een microcentrifuge gedurende 1 minuut bij 14.000 xg aan het DNA laden op de spin-cup matrix.
5. Verwijder en bewaar de spin cups en gooi de filtraten. Voor elk monster, de spin beker te vervangen in de houder buis, voeg dan 500 ul van 1 x High Salt Wash Buffer en de dop op de tube.
6. Spin de monsters in een microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 1 minuut.
7. Verwijder en bewaar de spin cups en gooi de filtraten. Voor elk monster, de spin beker te vervangen in de houder buis, voeg dan 500 pi van 80% ethanol en dop de tube.
8. Spin de monsters in een microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 1 minuut.
9. Herhaal stap 7 en 8 twee keer voor een totaal van 3 wasbeurten met 500 ul van 80% ethanol.
10. Na de derde maal in 80% ethanol, te verwijderen en te behouden van de spin-cups en gooi de filtraten. Vervang de spin bekers in hun bakje buizen en draaien in een microcentrifuge gedurende 2 minuten bij 14.000 xg om de vezel matrix droog.
11. Breng de spin-cups tot 1,5 m1-collectie buizen. Voeg 100 ul van elutiebuffer aan elke spin cup direct op de vezel matrix in de beker. Snap de doppen van de collectie buizen op de spin-bekers en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
12. Spin de monsters in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 1 minuut.
13. Het gezuiverde DNA is in de elutie buffer in de microcentrifugebuis. Gooi de spin cup en pet van de buizen. Het DNA kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. Voor de lange-termijn opslag, opslaan van de DNA bij 20 ° C of 80 ° C.
14. Indien gewenst, kunt u de concentratie van het DNA-monsters te meten in een spectrofotometer.

De genomische DNA-extractie protocol levert meestal monsters met een concentratie variërend van 5 ng / ul tot 500 ng / ul. De PCR-RFLP protocol werkt putten met DNA-monsters varieert ergens tussen de 0,05 ng / ul tot 2000 ng / ul.

3: Stel de PCR-reacties

1. Bereid een 50 ng / ul verdunning van de positieve controle zalm-DNA door het combineren van 8 ul van de DNA-aandelen met 32 ​​ul van een steriele, DNase-vrij water. Vortex te mengen.
   De verdunde monster kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
2. Bereid de reacties van het combineren van de componenten in de onderstaande tabel in orde is. Bereid een reactiemengsel voor alle PCR-reacties die simultaan zal worden geleid door het opschalen van de volumes die in detafel. In aanvulling op de test DNA-monsters, onder meer een positieve controle reactie en een no-template controle reactie. Voorbereiden dubbele PCR-reacties voor elke test DNA-monster wordt aanbevolen. Bereid genoeg reactiemengsel voor al uw reacties, plus een reactie van het volume eigen risico.
   Bijvoorbeeld, als je 5 testen DNA-monsters, voor te bereiden genoeg reactiemengsel voor een van beide 8 reacties (5-test reacties, een positieve controle, een no-template controle, en een eigen risico) of 13 reacties als je zijn inclusief duplicaten van de test reacties (10 dubbele-test reacties, een positieve controle, een no-template-controle en een eigen risico).
   PCR reactiemengsel

   Bestanddeel	Volume 1 Reactie	Volume 5 Reacties
   dH 2 O, steriele	9 pl	45 pl
   2x PCR Master Mix	12,5 ul	62,5 ul
   Primer Mix	2,5 pl	12,5 ul
   Totale volume	24 pl	120 ul

3. Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 24 ul op elke individuele dunwandige PCR-reactie buis.
4. Voeg een pi van de verdunde positieve controle DNA naar de positieve controle reactie buis. Om de test monsterbuizen, voeg 1 pl van de test-DNA-monster. Voor de no-template control reactie, voeg 1 pl van DNase-vrij water in plaats van het DNA.
   Om te voorkomen dat kruisbesmetting, gebruik maken van een nieuwe pipet tip voor elk DNA-monster. Na het toevoegen van het monster, meng de reactie door snel pipetteren de inhoud van de buis omhoog en omlaag.
5. Cap de reactie buizen, vortex de buizen te mengen en kort gecentrifugeerd de buizen.

4: Start de PCR-protocol

1. Plaats de reacties in de thermal cycler en voer het PCR-programma hieronder.
   PCR Fietsen Protocol

   Segment	Aantal Cycles	Temperatuur	Duur
   1	1	95 ° C	5 minuten
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 seconden 30 seconden 30 seconden
   3	1	72 ° C	7 minuten

5: Digest PCR Producten met restrictie-enzymen

1. Label de 0,5 ml buizen of 0,2 ml-strip buizen die worden gebruikt voor de beperking verteren reacties. Elke PCR-reactie zal worden verteerd met drie verschillende restrictie-enzymen: DdeI, HaeIII en NlaIII. Daarom is voor elke PCR-reactie, het etiket drie afzonderlijke buisjes met de naam van de PCR-monster en de naam van het restrictie-enzym.
2. Bereid het reactiemengsel voor de DdeI vertering door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle DdeI spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component. Zodra de PCR is voltooid, worden de PCR-reacties behandeld met restrictie-enzymen voor restriction fragment length polymorfisme (RFLP) analyse.
   DdeI Spijsvertering reactiemengsel

   Bestanddeel	Volume
   dH 2 O, steriele	1,5 pl
   10x DdeI Buffer	0,5 pl
   10x DdeI enzym	0,5 pl

3. Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor DdeI.
4. Bereid het reactiemengsel voor de HaeIII vertering door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle HaeIII spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component.
   HaeIII Spijsvertering reactiemengsel

   Bestanddeel	Volume
   dH 2 O, steriele	1,5 pl
   10x HaeIII Buffer	0,5 pl
   10x HaeIII enzym	0,5 pl

5. Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor HaeIII.
6. Bereid het reactiemengsel voor deNlaIII ontsluitingen door het combineren van de onderstaande componenten in orde zijn. Bereid een reactiemengsel voor alle NlaIII spijsvertering reacties (plus ten minste een reactie volume dan) met behulp van een veelvoud van elke component.
   NlaIII Spijsvertering reactiemengsel

   Bestanddeel	Volume
   dH 2 O, steriele	1,5 pl
   10x NlaIII Buffer	0,5 pl
   10x NlaIII enzym	0,5 pl

7. Vortex het reactiemengsel goed, dan verdelen 2,5 ul aan de individuele reactie buisjes die waren gelabeld voor NlaIII.
8. Voor elke spijsvertering reactie, voeg 2,5 pl van de geschikte PCR-product aan de gelabelde buizen. Alle van de test PCR-reacties en de positieve controle reactie moeten worden gedigereerd met alle drie de restrictie-enzymen.
9. Vortex de spijsvertering reacties en vervolgens in het kort centrifugeer de buizen.
10. Incubeer de spijsvertering reacties bij 37 ° C gedurende 2 uur. Deze incubatie kan worden uitgevoerd in de thermal cycler. Indien gewenst, kunnen reacties worden achtergelaten bij 37 ° C gedurende de nacht.
11. Breng de reacties op 65 ° C gedurende 15 minuten. Deze stap kan worden uitgevoerd in de thermal cycler.
12. Voeg 1 ui 60 mM EDTA (geleverd bij de kit) om elke reactie en vortex goed.

6: Analyseer de beperking verteren patronen

1. De voorbereiding van de gel-dye mix, plaats een DNA-chip op de chip priming station, en laad de mix op de DNA-chip.
2. Pipetteer 5 ul van de DNA-merker in de put gemarkeerd met de ladder symbool en in elk van de 12 monster putten op de chip.
   DNA-marker is reeds voorzien in het DNA 1000 reagens Kit in een groen buisje met.
3. Pipetteer 1 pi van DNA ladder in de put gemarkeerd met een ladder symbool.
   DNA-ladder is voorzien in de DNA 1000 reagens Kit in een geel-buisje.
4. Voor elk van de DNA-monsters, pipet 1 pi van elke restrictie digest reactie in een van de 12 monster putten op de chip volgens de richtlijnen in de figuur hieronder. Met behulp van deze aanpak, putten 1-3 zijn voor de 3 spijsvertering reacties voor de positieve controle monster, putten 4-6 voor de 3 spijsvertering reacties voor monster 1, putten 7-9 voor de 3 spijsvertering reacties voor monster 2, en putten 10-12 zijn voor de spijsvertering 3 reacties voor monster 3.Analyze de beperking verteren reacties op de Agilent 2100 Bioanalyzer om het fragment lengtes geproduceerd tijdens de spijsvertering te bepalen. De Agilent DNA 1000 Kit Guide heeft de volledige instructies voor het uitvoeren van de lab chips op de Bioanalyzer. Een korte protocol is hieronder voor uw gemak.
   
   
   Figuur 2. Organisatie van de monsters op de Chip.
   
   Als u minder dan 4 DNA-monsters, pipet een pi van water in de ongebruikte putten. Als u meer dan vier DNA-monsters, moet u meer dan een chip uit te voeren. Merk op dat het niet nodig is om het positieve controlemonster draaien op elke chip.
5. Horizontaal plaatsen van de chip in de adapter van het IKA vortex mixer en vortex gedurende 60 seconden bij 2400 tpm.
6. Plaats de chip in de Agilent 2100 Bioanalyzer en start de chip uit te voeren. De inkomende ruwe signalen worden weergegeven in het instrument context.
   Na de run is voltooid, worden pieken vastgesteld voor alle monsters met de instellingen van de piek vinden algoritme. Als je denkt dat het algoritme niet heeft voldaan aan een echte piek te detecteren, kunt u de hoogte Threshold setpoint te verlagen tot een waarde die het mogelijk maakt het algoritme te identificeren de top.
7. Ga naar de Assay context en selecteer het tabblad Samenvatting Chip. In het Sample veld Naam een ​​sample naam voor alle 12 putten op de chip zoals in de afbeelding hieronder.
   
   
   Figuur 3. Sample invoeren van een naam in Chip tabblad Samenvatting.

7: Identificeer het monster soort gebruik van RFLP Matcher

De Agilent software applicatie RFLP-decoder kan worden gebruikt om de vissoorten voor de test DNA-monsters op basis van het fragment lengtes geproduceerd in de vertering reacties te identificeren. Tabel 7 Verwachte DNA-fragment Maten in de positieve controle restrictie-enzym Verwachte Product afmetingen (bp) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 De instructies die hier gebruik maken van de standaard analyse-instellingen in RFLP Matcher. Raadpleeg de Help van de software en systeem voor gedetailleerde informatie over de bediening van de software en interpreteren van de display.

1. Start het RFLP Decoder programma.
2. Klik op Bestand> Openen> XAD bestand.
   Het dialoogvenster Openen Will open.
3. Selecteer het XAD-bestand voor de DNA-chip dat de beperking verteren reacties opgenomen. Klik op Openen.
   Er wordt een dialoogvenster geopend opsomming van de monsters die zijn geladen op de chip.
4. Selecteer drie spijsvertering reacties die overeenkomt met een DNA-monster en geef de juiste restrictie-enzym voor elk monster met behulp van de drop-down menu's in de Enzyme kolom. In de onderstaande figuur is de Enzyme column is ingevuld voor DNA-monster 1.
   
   
   Figuur 4. Het specificeren van restrictie-enzym voor elk monster.
   
   
5. In het veld min piekhoogte als% van de lagere marker ", de standaard waarde is 10,0%. Indien nodig, deze waarde kan worden verlaagd tot kleine pieken die werd gemist te identificeren, of verhoogd tot pieken als gevolg van niet-specifieke geluid in het gooi electropherogram. Klik Reïntegratie na het maken van eventuele aanpassingen van de min piekhoogte waarde.
   
   
   Figuur 5. Het toewijzen van Minimum piekhoogte.
   
   
6. Klik Calc aan de onderkant van het dialoogvenster.
   Het fragment length gegevens verkregen uit de Bioanalyzer termijn zal bevolken de software velden.
7. In de score drop-down lijst in de linker bovenhoek van het scherm, selecteert u de juiste algoritme voor de analyse van de gegevens. Als de vis monster wordt geanalyseerd bestaat uit een enkele vissoorten, selecteer Dice (Nei Li) in de score drop-down lijst. Indien de monsters kan bestaan ​​uit een mengsel van soorten, te selecteren mengsel.
   De tabel aan de onderkant van het scherm label gecombineerde score-lijsten van de beste soort wedstrijden gebaseerd op de resultaten van alle drie de spijsvertering reacties. De soortnaam evenals de gemeenschappelijke naam staan ​​in de tabel (zie hieronder). Perfect wedstrijden (die met een score van 1) zijn groen gemarkeerd. Wedstrijden in het geel worden beschouwd als bijna-overeenkomsten. U kunt dubbelklikken op een soortnaam om het FishBase webpagina voor deze soort.
   
   
   Figuur 6. Soorten die identificatie op basis van spijsvertering.
   
   
8. In de lagere cutoff en match tolerantie velden aan de bovenkant van het scherm, kunt u de standaardinstellingen voor de score van de beste soort match te verbeteren. De lagere cutoff waarde wordt gebruikt om alle fragmenten korter dan de lengte aangewezen in het veld te verwijderen. De wedstrijd tolerantie waarde bepaalt hoe dicht in de lengte een fragment moet zijn om de voorspelde fragment te worden beschouwd als een wedstrijd.
9. Herhaal stap 4 tot en met 8 voor de overige DNA-monsters die werden opgenomen op dezelfde chip.

8: representatieve resultaten:

Een afbeelding van een Bioanlyzer gel met restrictiedigestie samples uit 4 verschillende vissoorten is weergegeven in onderstaande figuur. De verwachte resultaten voor de positieve DNA-monster zijn samengevat in onderstaande tabel.


Figuur 7. Bioanalyzer gel beeld van restrictiedigestie reactie monsters. Elke gel laan is gelabeld met de restrictie-enzym gebruikt in die reactie.

Verwachte DNA-fragment Maten in de Salmon positieve controle

Figuur 8. Verwachte DNA-fragment Maten in de Salmon positieve controle.

Discussion

Demonstreren we een eenvoudige, snelle en accurate DNA-gebaseerde screening methode voor de identificatie van de vissoorten in visproducten. Deze krachtige methode biedt reproduceerbare, precieze resultaten in minder dan een werkdag en het kan worden toegepast in commerciële testfaciliteiten te wijten aan een gestroomlijnde protocollen en eenvoudige setup. Het wordt gekenmerkt door het genereren van objectieve gegevens die geanalyseerd met behulp van RFLP Decoder software met een uitbreidbare database van experimenteel afgeleide vissoorten profielen.

Met de gewone toepassing, deze testmethode heeft de potentie om verkeerde labeling van schaal-en schelpdieren te voorkomen en te helpen bij het handhaven van accurate administratie geschikt is voor de naleving van overheidsvoorschriften.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various