Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.
Abstract
שינויים בארגון הסלולר דינמיקה כרומוזום המתרחשים במהלך מיטוזה מתואמים באופן הדוק על מנת להבטיח ירושה מדויקת של תוכן גנומי הסלולר. אירועים Hallmark של מיטוזה, כגון תנועת כרומוזום, ניתן לעקוב בקלות על בסיס תאים בודדים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של שורות תאים יונקים להביע ספציפי GFP-tagged חלבונים. בשילוב עם דלדול RNAi מבוסס, זה יכול להיות שיטה חזקה איכון את הבמה (ים) של מיטוזה בו פגמים להתרחש לאחר רמות של חלבון מסוים כבר הוריד. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה בסיסית להערכת ההשפעה של depleting חלבון mitotic פוטנציאל הרגולציה על העיתוי של מיטוזה. תאים הם transfected עם siRNA, הניח בתא הבמה העליון הדגירה, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות. אנו מתארים כיצד להשתמש בתוכנה כדי להגדיר ניסוי זמן לשגות, איך לעבד את התמונה sequences לעשות או עדיין תמונה montages או סרטים, וכיצד לכמת ולנתח את העיתוי של שלבים mitotic באמצעות תא שורת להביע mCherry- מתויג H2B היסטון. לבסוף, אנו דנים שיקולים חשובים לעיצוב ניסוי זמן לשגות. אסטרטגיה זו הוא משלים גישות אחרות מציע את היתרונות של 1) רגישות לשינויים קינטיקה שעשויים להיות לא נצפתה כאשר מסתכלים תאים כאוכלוסייה ו 2) ניתוח של מיטוזה ללא צורך לסנכרן את מחזור התא באמצעות טיפולים תרופתיים. מידע חזותי מניסויים הדמיה כזו לא רק מאפשרת המשנה שלבי מיטוזה להיות מוערך, אבל גם יכול לספק תובנה צפוי כי לא יהיה ברור מניתוח מחזור התא על ידי FACS.
Protocol
siRNA transfection והכנת תא
- הכינו 4-היטב LabTek coverglass II החדרים ידי הוספת 0.5mL של פיברונקטין (10μg/mL) היטב כל אשר ישמשו. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכן siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) מתחמי עבור transfection הפוכה על פי הוראות של היצרן. השתמש בכמויות מומלץ אחד טוב של המנה 24 באר לכל תא לשמש (100μL סה"כ). מוצר פרוטוקול מקביל / עבור transfection siRNA ניתן להחליף.
- הסר את פיברונקטין מבארות של coverglass החדרים. הוסף 100μL של siRNA / מתחמי RNAiMAX Lipofectamine היטב כל אשר ישמשו.
- Aliquot 20,000 היסטון H2B-mCherry-להביע תאים (ב 500μL) לכל היטב המכיל תערובת transfection.
- אפשר תאים כדי לדגור במשך ~ 24 שעות לפני החלפת תערובת transfection עם 1mL של המדיום הסלולרי הרגיל תרבות.
- תאים דגירה נוספת 24 שעות לפני רכישת התמונה (48 שעות שלאחר transfection).
מיקרוסקופ ההתקנה רכישת תמונה
- ישנם שלושה חלקים עיקריים ההתקנה רכישת תמונה: 1) תא חממה שמתאים על הבמה מיקרוסקופ ושומרת על סביבה לחה קבועה של 37 ° C, ו - 5% CO 2: 2) מיקרוסקופ המצויד הפוכה שלב אוטומטית, אוטומטיות פלואורסצנטי brightfield תריסים, וגלגלים מסנן אוטומטי: 3) חבילת תוכנה המשלבת שולטת על הבמה, תריסים, וגלגלים הסינון. ב ההתקנה הדמיה שלנו, אנו משתמשים תא אישית מתוך אוקו החממה Lab כי ניתן להשתמש עם השנייה LabTek החדרים coverglass. השלב, תריסים, וגלגלים לסנן נשלטים על ידי תוכנת Metamorph רמז:. המעבדה אוקו הבמה העליונה מערכת החממה כולל מתאמים עבור מגוון רחב של צלחת מאכל שונים, או בגדלים coverslip.
- מקם את השנייה LabTek החדרים coverglass בחממה על ידי פתיחת המכסה של החממה מראש התחמם equilibrated, הצבת coverglass החדרים בתוך המתאם, והחזקה במקום עם פלסטלינה. השאירו את המכסה על coverglass החדרים כך בינוני תרבית תאים לא יתייבש. סגור את המכסה ואת המיקום החממה כולה על הבמה מיקרוסקופ, על מנת להבטיח כי החממה מוחזק במקומו.
- שימוש Metamorph, להגדיר את הניסוי שלך על ידי בחירת "Apps / רכישת רב ממדית" בשורת התפריטים של התוכנה. פעולה זו תציג חלון בו ניתן לבחור את תדירות ואורך timelapse, את זמן החשיפה לכל צבע (אם עושים מספר הגדרות), מספר ומיקום עמדות הבמה, ומספר Z-הסעיפים (אם ) הרצוי. . בחר היכן לשמור את קבצי הנתונים רמז: אם אתם משתמשים בתוכנה שאינה Metamorph, פונקציות עשוי להיות מעט שונה, אך הרעיון הכללי הוא זהה. Micromanager, קוד פתוח ImageJ מבוססי תוכנה הרכישה תואמת setups חומרה ביותר, היא חלופה מעולה.
- . למטרות פרוטוקול זה, נוכל לרכוש תמונות בשני אורכי גל (brightfield ו mCherry) כל 15 דקות במשך 8 שעות 15 עמדות בשלב רמז: אם החלטה זמן טוב יותר הוא הרצוי, אז אתה יכול לקצר את מרווח הזמן בין רכישות, אולם , עמדות הבמה פחות ניתן להשתמש, ותאי mitotic ובכך פחות יהיה זמין עבור הניתוח. חשוב כאשר שוקלים מרווחי הזמן לקחת בחשבון את הזמן הנדרש עבור ההגה מסנן כדי לעבור בין מערכות הסינון.
- קבע את זמן החשיפה האופטימלי עבור כל אורך הגל הראשון על ידי התמקדות בתחום של תאים באמצעות תאורה brightfield. בתוך התוכנה, להתאים את פונקציית פוקוס אוטומטי רק עבור ערוץ brightfield (זה יאפשר את התוכנה פוקוס אוטומטי במיקום כל שלב לפני רכישת כל אחד) רמז:. אנו משתמשים מטרה 40X יבש שלב בניגוד לתת פתרון מצוין ללא צורך שמן . מטרות נוספות ניתן להשתמש בהתאם לרזולוציה אופטית הרצוי.
- מעבר הגל mCherry ולהצמיד תמונה באמצעות חשיפה 50 msec. התאם את זמן החשיפה למינימום הנדרש כדי לראות תמונה טובה. זה חיוני כדי להגביל את כמות החשיפה לאור, כדי להבטיח כדאיות התא מתמשכת. ככלל, זו יכולה להיות מושגת הטובה ביותר באמצעות מסנן צפיפות ניטרלי (כדי להפחית את שטף האור עירור) וחשיפה ארוכה יותר זמן המצלמה ולא על ידי הגדלת עוצמת הארה. חזור על הליך זה עבור כל אורכי גל נוסף לשמש רמז:. כדי לקבוע לטווח ארוך כדאיות התא בעת החשיפה נתון עבור הניסוי שלך, תוכל לצפות בתצוגה מקדימה את המספר הכולל של תמונות בתא יכולים לשרוד מעל timelapse הרצוי על ידי התאמת המרווח זמנית timepoint מ דקות שניות (כלומר, 10 דקות. הופכת 10 שניות). אם התאים שלך לשרוד 100-200 חשיפות (אוהמספר המתאים), ואז החשיפה שלך היא בסדר. אם לא, להפחית את האור עירור שלך, זמן חשיפה, או את המספר הכולל של תמונות כדי לדמות בניסוי המלא.
- הבא, בחר וסמן המספר המתאים של עמדות שלב, כך שתוכל להשיג דגימה מספקת של האוכלוסייה התא. Metamorph יתעד את עמדות יחזור לשם רכישת כל רמז:. אני בדרך כלל מנסה למצוא עמדות שבהן יש שפע של תאים לתמונה, אבל לא רבים, כך הם צפופים מדי. כמו כן, חשוב לבחור עמדות מספיק, כך יהיה לך סיכוי טוב לצפות במספר גדול של תאים מתקדמת באמצעות מיטוזה.
- אחרי הכל timelapse, זמן חשיפה הגל, ואת המיקום מידע הבמה נרשמו, בחר את "תצוגה מקדימה" כפתור על המסך כדי לקבוע אם התוכנה היא שליטה על ציוד מתאים.
- ברגע שאתה מרוצה, בחר את "רוכשת את" כפתור על המסך כדי להתחיל הרכישה. ואז לשבת בחיבוק ידיים ולאפשר את המחשב מיקרוסקופ לעשות את העבודה רמז:. ציית אוטומציה באמצעות סיבוב אחד לפחות מלא רכישה כדי להבטיח שהכל פועל כשורה.
תמונה עיבוד וניתוח
- לאחר הרכישה הסתיימה, השלב הבא הוא להעביר את נתוני התמונה לתוך טופס כי הוא יותר קל לטפל. למטרות פרוטוקול זה, אני אדגים הראשונה איך ליצור סרטים באמצעות Metamorph, אז איך ליצור תמונה montages באמצעות תוכנית ImageJ. פורמט או יהיה שימושי למטרות כימות.
- הצעד הראשון הוא לבדוק את הנתונים. כדי לעשות זאת, בחר "Apps / סקירה נתונים רב מימדי" בשורת התפריטים. בחר את המיקום של הקבצים שלך, ואז לבחור "תצוגה". זה יאפשר לך לבדוק את ערימת התמונות מעמדת כל שלב בנפרד. בחר את המיקום הרצוי הבמה, ואז "טען תמונות". תוכל לקדם את הנתונים דרך מסגרת לפי מסגרת.
- לאלו עמדות השלב בו התאים עוברים מיטוזה (כפי שנקבע על ידי ה-DNA והן מורפולוגיה תאית), אתה יכול לעשות סרטים montages באמצעות Metamorph, או עם תוכניות אחרות כגון ImageJ (זמין בחינם דרך NIH).
- כדי להפוך סרט Metamorph, בחר "תהליך / שמור סרט" בשורת התפריטים. תוכל לבחור את מסגרות לשימוש, מהירות, סוג הקובץ של הסרט. לאחר מכן, בחר "שמור סרט".
- כדי להפוך את מונטאז, אני שומר את ערימת התמונה כקובץ STK., אשר ניתן להשתמש בתוכניות אחרות כגון ImageJ.
- פתח את הקובץ ב ImageJ ולקדם את מסגרות עד שתמצא תא עובר מיטוזה. . חתוך את האזור סביב התא ובחר "תמונה / שכפול" רמז: ודא לשכפל כל המסגרות.
- כדי להפוך את מונטאז, בחר "תמונה / ערימות / לעשות מונטאז" בשורת התפריטים. כאן אתה יכול לציין אילו מסגרות שברצונך לכלול, בגודל ובצורה של מונטאז', ואם אתה רוצה הגבולות בין המסגרות. בחר האלה והכה "בסדר". .. שמור את מונטאז' כקובץ tif ולעשות כל עיבוד נוסף או ImageJ או Adobe Photoshop רמז: שנה קבצים מונטאז' מתבנית 16-bit המשמש Metamorph בפורמט 8 סיביות עבור עיבוד תמונה קל.
- כדי לחשב את זמן בשלבים שונים של מיטוזה, לקבוע t = 0 (הסימן הראשון עיבוי דנ"א או עיגול התא), לספור את מספר מסגרות עד הכרומוזומים מיושרים בקו המשווה (זמן prophase / prometaphase), מסגרות עד הכרומוזומים מתחילים להפריד (זמן metaphase), מסגרות עד התאים מתחילים להשתטח (anaphase / telophase / cytokinesis). הזמן מחושב בכל שלב mitotic תלוי במרווח הזמן בין כל מסגרת.
נציג תוצאות
איור 1 מדגים את התוצאות של ניסוי טיפוסי transfection siRNA לשלוט באמצעות קו תא הלה הביע היסטון H2B-mCherry. שיטה זו של נעשה שימוש יעיל לכמת העיתוי mitotic, חושפים תפקיד בלתי צפוי עבור Nup153 nucleoporin בעיתוי של מיטוזה מאוחר 1. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
Discussion
עם ההתקדמות בטכנולוגיית הדמיה חלבון פלואורסצנטי, הדמיה לחיות הפכה פעולה שגרתית של ניתוח הסלולר 2. מגוון של GFP (וגירסאות צבע אחר 3), מתויג חלבונים זמינים באופן נרחב או קל יחסית לבנות והוא יכול לשמש כדי לעקוב אחר מספר סימני ההיכר חלוקת התא, כולל ה-DNA / כרומוזום הדינמיקה 4, 5, 6 centrosome שכפול, cyclin B הדינמיקה 7, המעטפה פירוק והרכבה מחדש גרעיני 8, 9, ציר mitotic היווצרות 10, בשלבים שונים של cytokinesis 11. חלבונים Tagged ניתן להשתמש לבד או בשילוב כאשר ספקטרום עירור / פליטה של תגי פלורסנט תואמים, המאפשר תיאום בין אירועים ספציפיים להיות מוערך. אם ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר ו / או הזמני הוא / הם הרצויה, מיקרוסקופיה confocal אם סריקה סריקת לייזר, דיסק ספינינג, או תהודה ניתן להשתמש, ואת רשימת אפשרויות במיקרוסקופ משוכלל עם רזולוציה הולך וגובר ממשיך לגדול. הדמיה חיה של מיטוזה בתאי יונקים יש גם מותאם לשימוש תפוקה גבוהה RNAi מסכי מולקולה קטנה 12-14. וכך, בעוד הניסויים הראשוניים של אחד באמצעות טכניקה זו עשויה להיות פשוטה יחסית, האפשרויות לבנייה על אסטרטגיה זו נרחב.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקנית לסרטן (PF-07-103-01-CSM), המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM61275 ו P30 CA042014), לוקמיה וחברה לימפומה, סרטן צייד ואת הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
