Summary
Hier beschrijven we een basic protocol om beeld en kwantificeren van de mitotische timing van levende zoogdieren weefselkweek cellen na siRNA transfectie.
Abstract
Veranderingen in de cellulaire organisatie en chromosoom dynamiek die zich voordoen tijdens de mitose zijn nauw afgestemd op accurate erfenis van genomische en cellulaire inhoud te verzekeren. Hallmark gebeurtenissen van mitose, zoals chromosoom beweging, gemakkelijk kan worden gevolgd op een individuele cel basis met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie van zoogdiercellijnen expressie van specifieke GFP-gelabelde eiwitten. In combinatie met RNAi-gebaseerde uitputting, kan dit een krachtige methode voor het aanwijzen van de fase (n) van de mitose waar de gebreken zich voordoen na het niveau van een bepaald eiwit zijn verlaagd. In dit protocol, presenteren we een eenvoudige methode voor de beoordeling van het effect van uitputting van een potentiële mitotische regulatie-eiwit op de timing van de mitose. Cellen worden getransfecteerd met siRNA, geplaatst in een stage-top incubatiekamer en beeld gebracht met behulp van een geautomatiseerd fluorescentie microscoop. We beschrijven hoe software te gebruiken om het opzetten van een time-lapse experiment, hoe het beeld sequenties proces om ofwel stilstaande beelden of films te maken montages, en hoe te kwantificeren en analyseren van de timing van de mitotische fase met behulp van een cellijn tot expressie mCherry- getagd histon H2B. Tot slot bespreken we belangrijke overwegingen voor het ontwerpen van een time-lapse experiment. Deze strategie is complementair aan andere benaderingen en biedt de voordelen van een) gevoeligheid voor veranderingen in de kinetiek dat misschien niet in acht worden genomen bij het bekijken van cellen als een bevolking en 2) analyse van de mitose, zonder de noodzaak om de celcyclus met behulp van behandeling met medicijnen te synchroniseren. De visuele informatie uit deze beeldvorming experimenten kunnen niet alleen de sub-stadia van mitose te beoordelen, maar kan ook onverwacht inzicht dat niet zou blijken uit de celcyclus analyse door FACS.
Protocol
siRNA transfectie en celpreparaat
- Bereid een 4-goed LabTek II chambered dekglaasje door het toevoegen van 0,5 ml van fibronectine (10μg/mL) aan elk goed, dat zal worden gebruikt. Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complexen voor reverse transfectie volgens de fabrikant de instructies. Gebruik de aanbevolen hoeveelheden voor een well van een 24-wells gerecht per kamer om te worden gebruikt (100μL totaal). Een analoge product / protocol voor siRNA transfectie kan worden vervangen.
- Haal de fibronectine uit de bronnen van de chambered dekglaasje. Voeg 100μL van siRNA / Lipofectamine RNAiMAX complexen aan elk goed, dat zal worden gebruikt.
- Aliquot 20.000 histon H2B-mCherry expressie cellen (in 500μL) per putje met transfectie mengsel.
- Laat cellen voor ~ 24 uur geïncubeerd voordat u transfectie mengsel met 1 ml van de reguliere celkweekmedium.
- Incubeer cellen een extra 24 uur voordat de foto acquisitie (48 uur na transfectie).
Microscoop setup en beeldacquisitie
- Er zijn drie belangrijke onderdelen om het beeld overname setup: 1) een cel incubator die past op de microscoop podium en een constante vochtige omgeving van 37 ° C, en 5% CO 2, 2) een omgekeerde microscoop uitgerust met een geautomatiseerd stadium, geautomatiseerde fluorescentie en helderveld luiken, en geautomatiseerde filter wielen, en 3) een software pakket dat integreert en controleert het podium, rolluiken, en filter wielen. In onze beeldvorming opstelling maken we gebruik van een aangepaste cel incubator van OKO Lab die kunnen worden gebruikt met de LabTek II chambered dekglaasje. Het podium, rolluiken, en filter wielen worden gecontroleerd door de Metamorph software Hint:. De OKO Lab stage-top incubator systeem bevat adapters voor een verscheidenheid van verschillende bord, schotel, of dekglaasje maten.
- Plaats de LabTek II chambered dekglaasje in de couveuse door het openen van het deksel van de voorverwarmde en in evenwicht incubator, het plaatsen van de chambered dekglaasje in de adapter, en op de plaats houden met boetseerklei. Laat de deksel op de chambered dekglaasje, zodat het celkweekmedium niet zal uitdrogen. Sluit het deksel en de positie van de hele couveuse op de microscoop podium, ervoor te zorgen dat de incubator stevig op zijn plaats gehouden.
- Met behulp van Metamorph, het instellen van uw experiment door te kiezen voor "Applicaties / Multidimensional Acquisition" in de menubalk van de software. Dit zal een venster waarin u de frequentie en de lengte van de timelapse selecteert, wordt de belichtingstijd voor elke kleur (als dit meerdere instellingen), het aantal en de locatie van het podium posities, en het aantal z-profielen (indien gewenst). . Selecteren waar u de data bestanden op te slaan Tip: Bij gebruik van andere software dan Metamorph, de functies kunnen worden iets anders, maar het totale concept is hetzelfde. Micromanager, een open source ImageJ-gebaseerde acquisitie software die compatibel is met de meeste hardware opstellingen, is een uitstekend alternatief.
- . Voor de toepassing van dit protocol zullen we beelden te verwerven bij twee golflengten (helderveld en mCherry) elke 15 minuten gedurende 8 uur bij 15 stadium posities Hint: Als een betere tijdsresolutie gewenst is, dan kun je verkorten van de tijdsduur tussen overnames, maar , kan er minder podium posities worden gebruikt, en dus minder mitotische cellen zullen beschikbaar zijn voor analyse. Het is belangrijk bij het overwegen van tijdsintervallen om rekening te houden met de tijd die nodig is voor het filter wiel om te schakelen tussen filter sets.
- Bepaal de optimale belichting voor elke golflengte door eerst richten op een veld van cellen met behulp van helderveld verlichting. In de software, stelt u de autofocus-functie alleen voor de helderveld kanaal (dit is de software te laten autofocus in elke fase positie voor elke acquisitie). Tip: We maken gebruik van een 40x droge fase-contrast doel om uitstekende resolutie geven zonder de behoefte aan olie . Andere doelstellingen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste optische resolutie.
- Schakel over naar de mCherry golflengte en snap een afbeelding met behulp van een 50 msec blootstelling. Pas de belichting aan tijd om het vereiste minimum om een goed beeld te zien. Het is essentieel om de hoeveelheid licht blootstelling aan duurzame levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren. Als algemene regel geldt, kan dat het beste worden bereikt door het gebruik van een grijsfilter (de excitatie lichtstroom te verminderen) en een langere belichting tijd in plaats van door het verhogen van de verlichting sterkte. Herhaal deze procedure voor eventuele extra golflengten om te worden gebruikt. Tip: Om de lange termijn levensvatbaarheid van de cellen te bepalen op een gegeven blootstelling voor je experiment, dan kunt u het totaal aantal opnamen een cel kan overleven over de gewenste timelapse bekijken door tijdelijke aanpassing van de meetpunt afstand van minuut tot seconde (dat wil zeggen, 10 minuten. raakt 10 seconden). Als uw cellen overleven 100-200 blootstelling (of dejuiste nummer), dan is uw belichting is prima. Zo niet, verminderen uw excitatielicht, belichtingstijd, of het totale aantal van beelden om uw volledige experiment simuleren.
- Vervolgens selecteren en markeren een passend aantal podium posities, zodat u kunt een adequate bemonstering van de cel bevolking te bereiken. Metamorph registreert de posities en zal er aangifte in voor elk acquisitie Hint:. Ik probeer gewoonlijk posities waarin er genoeg cellen zijn om de afbeelding te vinden, maar niet zoveel dat ze te dicht. Ook is het belangrijk om voldoende functies te selecteren, zodat u een goede kans op het waarnemen van een groot aantal cellen doorlopen mitose hebben.
- Immers timelapse, golflengte belichtingstijd, en het podium positie-informatie zijn opgenomen, selecteert u de "Preview" knop op het scherm om te bepalen of de software is het beheersen van de apparatuur naar behoren.
- Als u tevreden bent, selecteert u de "Acquire" knop op het scherm om acquisitie te beginnen. Vervolgens achterover leunen en laat de computer en microscoop om het werk te doen Hint:. Observeer de automatisering door middel van ten minste een volledige ronde van de overname om ervoor te zorgen dat alles goed werkt.
Beeldverwerking en analyse
- Na de overname heeft voltooid, wordt de volgende stap is het beeld overdracht van gegevens in een vorm die is gemakkelijker te hanteren. Voor de toepassing van dit protocol, zal ik eerst laten zien hoe je films met Metamorph te genereren, maar ook hoe u foto montages met behulp van het ImageJ programma te genereren. Beide formaten zal nuttig zijn voor de kwantificering doeleinden.
- De eerste stap is om herziening van de gegevens. Om dit te doen, selecteer "Applicaties / Review Multidimensional Data" in de menubalk. Selecteer de locatie van uw bestanden, en kies vervolgens "View". Dit zal u toelaten om de stapel foto's afzonderlijk recensie van elke fase positie. Selecteer de gewenste podium positie, dan "Load Images". Je zult in staat zijn om vooraf door de data frame-by-frame.
- Voor degenen die het podium posities in die cellen gaan door mitose (zoals bepaald door zowel de DNA en cellulaire morfologie), kunt u films en montages met behulp van Metamorph, of met andere programma's zoals ImageJ (gratis beschikbaar via NIH).
- Om een film in Metamorph, selecteert u "Proces / Save movie" in de menubalk. Je zult in staat zijn om die frames te gebruiken, de snelheid, en het bestandstype van de film te selecteren. Selecteer vervolgens "Save Movie".
- Om een montage, ik sla de afbeelding op stapel als een. Stk bestand, dat gebruikt kan worden in andere programma's zoals ImageJ.
- Open het bestand in ImageJ en vooraf de kaders tot je een cel gaat door mitose. . Gewas het gebied rond de cel en "Image / Dupliceren" te selecteren Tip: Zorg ervoor dat alle frames te dupliceren.
- Om een montage, selecteer "Image / Stacks / Maak Montage" in de menubalk. Hier kunt u opgeven welke kaders u wilt opnemen, de grootte en de vorm van de montage, en of u wilt dat de grenzen tussen de frames. Selecteer deze en druk op "Okay". .. Sla de montage als een tif-bestand en voert u een verdere verwerking in een van beide ImageJ of Adobe Photoshop Hint: Verander montage bestanden van de 16-bit formaat wordt gebruikt door Metamorph om 8-bit formaat voor eenvoudiger beeldverwerking.
- Voor het berekenen van de tijd in verschillende stadia van de mitose, vast te stellen t = 0 (eerste teken van DNA condensatie of cel afronding), het aantal frames tellen tot de chromosomen worden uitgelijnd op de evenaar (tijd in profase / prometafase), frames tot de chromosomen beginnen te scheiden (tijd in metafase), en frames tot de cellen beginnen af te vlakken (anafase / telofase / cytokinese). De berekende tijd in elke mitotische fase is afhankelijk van het tijdsinterval tussen elke frame.
Representatieve resultaten
Figuur 1 toont de resultaten van een typische controle siRNA transfectie experiment met behulp van een HeLa cellijn die histon H2B-mCherry. Deze methode van daadwerkelijk is gebruikt om de mitotische timing kwantificeren, onthullen een onverwachte rol voor de nucleoporin Nup153 in de timing van late mitose 1. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Discussion
Met de recente ontwikkelingen in de beeldvorming en fluorescerend eiwit-technologie, is er live imaging uitgegroeid tot een routine aspect van cellulaire analyse 2. Een verscheidenheid van GFP (en andere kleurvarianten 3)-gemerkte eiwitten worden op grote schaal beschikbaar of relatief eenvoudig te bouwen en kan worden gebruikt om een aantal van de celdeling kenmerken waaronder DNA / chromosoom dynamiek van 4, 5, 6 centrosoom duplicatie, cycline B dynamiek spoor 7, nucleaire envelop afbraak en heropbouw 8, 9, mitotische spindel vorming van 10, en de verschillende stadia van cytokinese 11. Gemerkte eiwitten kan alleen of in combinatie worden gebruikt wanneer de excitatie / emissie spectra van fluorescerende labels zijn compatibel, waardoor de coördinatie tussen bepaalde gebeurtenissen te worden beoordeeld. Indien een grotere ruimtelijke en / of temporele resolutie is / zijn gewenst, confocale microscopie of laser scanning, draaiende schijf, of resonantie scan kan worden gebruikt, en de lijst van geavanceerde microscopie opties met steeds grotere resolutie blijft groeien. Live-beeldvorming van de mitose in zoogdiercellen is ook aangepast voor gebruik in high-throughput RNAi en kleine molecule schermen 12-14. Dus, terwijl een s eerste experimenten met deze techniek kan zijn relatief eenvoudig, de mogelijkheden voor het bouwen op deze strategie zijn uitgebreid.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), de National Institutes of Health (R01 GM61275 en P30 CA042014), de leukemie en lymfoom Society, en de Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
