Summary
Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.
Abstract
Änderungen in der zellulären Organisation und Chromosom Dynamik, die während der Mitose auftreten, sind eng aufeinander abgestimmt, um genaue Vererbung der genomischen und zellulären Inhalte zu gewährleisten. Hallmark Ereignisse der Mitose, wie Chromosom Bewegung, kann ohne weiteres auf eine einzelne Zelle auf der Grundlage einer Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von Säugetier-Zelllinien, die spezifische GFP-markierten Proteine verfolgt werden. In Kombination mit RNAi-basierte Erschöpfung, kann dies eine leistungsfähige Methode der Ermittlung der Bühne (n) der Mitose, wo Mängel auftreten, nachdem das Vorkommen eines bestimmten Proteins gesenkt worden sind. In diesem Protokoll, präsentieren wir eine grundlegende Methode zur Beurteilung der Wirkung von abbauenden eine mögliche mitotischen regulatorisches Protein über den Zeitpunkt der Mitose. Die Zellen werden mit siRNA transfizierten, in einen Tischinkubation Kammer und bebildert mit Hilfe eines automatisierten Fluoreszenz-Mikroskop. Wir beschreiben, wie Sie Software verwenden, um die Einrichtung eines Zeitraffer-Experiment, wie die Bildsequenzen Prozess entweder noch Bildmontagen oder Filme zu machen, und wie zur Quantifizierung und Analyse der Zeitpunkt der Mitosestadien mit einer Zell-Linie Ausdruck mCherry- getaggt Histon H2B. Schließlich diskutieren wir wichtige Überlegungen für die Gestaltung eines Zeitraffer-Experiment. Diese Strategie ist eine Ergänzung zu anderen Ansätzen und bietet die Vorteile von 1) Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen in der Kinetik, die nicht beobachtet, wenn man Zellen einer Population und 2) Analyse der Mitose ohne die Notwendigkeit, den Zellzyklus mit medikamentösen Behandlungen zu synchronisieren könnte. Die visuelle Informationen aus solchen bildgebenden Experimenten ermöglicht nicht nur die sub-Stadien der Mitose zu beurteilen, sondern können auch unerwartete Erkenntnis, dass sich nicht unmittelbar aus Zellzyklusanalyse durch FACS sichtbar.
Protocol
siRNA-Transfektion und Zell-Vorbereitung
- Bereiten Sie ein 4-gut LabTek II chambered Deckglas, indem 0,5 ml Fibronektin (10μg/mL) in jede Vertiefung, die verwendet werden. Inkubieren für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Bereiten siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)-Komplexe für die reverse Transfektion laut Hersteller Anweisungen. Verwenden Sie die empfohlenen Mengen für eine Vertiefung einer 24-well Schale pro Kammer verwendet werden (100 &mgr; l insgesamt) werden. Eine analoge Produkt / Protokoll für siRNA-Transfektion ersetzt werden können.
- Entfernen Sie die Fibronektin aus den Vertiefungen der Kammer Deckglas. Add 100 &mgr; von siRNA / Lipofectamine RNAiMAX Komplexe in jede Vertiefung, die verwendet werden.
- Aliquot 20.000 Histon H2B-mCherry-exprimierenden Zellen (in 500μL) pro Well mit Transfektionsansatz.
- Lassen Zellen für ~ 24 Stunden vor dem Auswechseln der Transfektion Gemisch mit 1ml von regelmäßigen Zellkulturmedium inkubiert.
- Inkubieren Zellen weitere 24 Stunden vor der Bildaufnahme (48 Stunden nach der Transfektion).
Mikroskop-Setup und Bildaufnahme
- Es gibt drei wesentliche Teile der Bildaufnahme Setup: 1) eine Zelle Inkubator, der auf dem Mikroskoptisch passt und sorgt für eine konstante feuchten Umgebung von 37 ° C und 5% CO 2, 2) einem inversen Mikroskop mit einem automatisierten Bühne ausgestattet, automatisierten Fluoreszenz-und Hellfeld Fensterläden und automatisierte Filterräder und 3) ein Softwarepaket, das integriert und steuert die Bühne, Fensterläden und Filterräder. In unserer Imaging-Setup verwenden wir ein maßgeschneidertes Zellinkubator von OKO Lab, die mit dem LabTek II chambered Deckglas verwendet werden können. Die Bühne, Fensterläden und Filterräder werden von der Metamorph-Software gesteuert. Hinweis: Die OKO Lab Bühne-Top-Inkubator-System wird mit Adaptern für eine Vielzahl von verschiedenen Teller, Schüssel oder Deckglas Größen.
- Positionieren Sie den LabTek II chambered Deckglas in den Inkubator durch das Öffnen der Deckel des vorgewärmten und äquilibriert Inkubator, indem die Kammern Deckglas in den Adapter, und hält in Platz mit Knetmasse. Lassen Sie die Abdeckung auf der Kammern Deckglas, so dass das Zellkulturmedium nicht austrocknet. Schließen Sie den Deckel und die Position der gesamten Inkubator auf dem Mikroskoptisch, dass der Inkubator fest an ihrem Platz gehalten.
- Mit Metamorph, richten Sie Ihren Experiment durch Auswahl von "Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme" in der Menüleiste der Software. Dadurch öffnet sich ein Fenster, in dem Sie die Frequenz und die Länge der Zeitraffer auswählen können, die Belichtungszeit für jede Farbe (wenn dies mehrere Einstellungen), die Anzahl und Lage der Bühne Positionen, und die Anzahl der z-Abschnitten (falls gewünscht). . Wählen Sie, wo die Daten-Dateien speichern Tipp: Wenn Sie andere Software als Metamorph, die Funktionen können leicht unterschiedlich, aber das Gesamtkonzept ist die gleiche. Mikromanager, ein Open-Source ImageJ-basierte Software zur Erfassung, die kompatibel mit den meisten Hardware-Setups ist, ist eine hervorragende Alternative.
- . Für die Zwecke dieses Protokolls, wir werden die Bilder bei zwei Wellenlängen (Hellfeld und mCherry) alle 15 Minuten für 8 Stunden bei 15 Tischpositionen Hinweis zu erwerben: Wenn bessere zeitliche Auflösung gewünscht wird, dann können Sie verkürzen die Zeitspanne zwischen den Aufnahmen, aber kann weniger Bühne Positionen eingesetzt werden, und damit weniger mitotischen Zellen werden zur Analyse zur Verfügung. Es ist wichtig, wenn man Zeitabständen zu berücksichtigen, die Zeit für das Filterrad zwischen Filter-Sets Schalter erforderlich.
- Bestimmen Sie die optimale Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen mit Hilfe von Hellfeld. In der Software, stellen Sie die Autofokus-Funktion nur für die Hellfeld-Kanal (dieser wird die Software auf Autofokus ermöglicht in jeder Phase Position vor jedem Erwerb). Hinweis: Wir verwenden ein 40x trockenen Phasen-Kontrast-Ziel, hervorragende Auflösung, ohne die Notwendigkeit für Öl geben . Andere Ziele können in Abhängigkeit von der optischen Auflösung wünschen übrig.
- Wechseln Sie auf die mCherry Wellenlänge und Snap ein Bild mit einem 50 ms Belichtung. Stellen Sie die Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um ein gutes Bild zu sehen. Es ist wichtig, die Menge an Licht ausgesetzt nachhaltige Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten begrenzen. Als allgemeine Regel gilt, können dies am besten durch einen Graufilter (zur Anregung Lichtstrom zu reduzieren) und eine längere Belichtung Zeit, anstatt durch eine Erhöhung der Beleuchtungsstärke erreicht werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle weiteren Wellenlängen verwendet werden. Hinweis: Um die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen bei einer bestimmten Belastung für Ihr Experiment zu bestimmen, können Sie die Gesamtzahl der Bilder einer Zelle überleben kann über die gewünschte Zeitraffer durch eine einstweilige Umgestaltung der Zeitpunkt Abstand Vorschau von Minuten auf Sekunden (dh, 10 min. wird 10 Sekunden). Wenn Ihre Zellen überleben 100-200 Aufnahmen (oder dieentsprechende Anzahl), dann wird Ihre Exposition ist in Ordnung. Wenn nicht, reduzieren Sie Ihre Anregungslicht, Belichtungszeit oder die Gesamtzahl der Bilder auf Ihren vollständigen Experiment simulieren.
- Als nächstes wählen Sie und markieren Sie eine entsprechende Anzahl von Positionen der Bühne, so dass Sie auf eine ausreichende Stichprobe der Zellpopulation erreichen können. Metamorph zeichnet die Positionen und wird dort als Gegenleistung für jede Akquisition. Tipp: ich generell versuchen, Positionen, in denen gibt es viele Zellen zu Bild zu finden, aber nicht so viele, dass sie zu dicht sind. Außerdem ist es wichtig, genügend Positionen wählen, so dass Sie eine gute Chance, unter Einhaltung einer großen Anzahl von Zellen voran durch Mitose wird.
- Nachdem alle Zeitraffer, Wellenlänge Belichtungszeit, und Tischposition Informationen aufgezeichnet worden sind, wählen Sie die Schaltfläche "Vorschau" auf dem Bildschirm, um festzustellen, ob die Software die Steuerung der Geräte entsprechend.
- Sobald Sie zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche "Erfassen" auf dem Bildschirm auf den Erwerb beginnen. Dann lehnen Sie sich zurück und lassen Sie den Computer und Mikroskop, um die Arbeit zu tun. Hinweis: Beachten Sie die Automatisierung durch mindestens eine volle Runde der Akquisition um sicherzustellen, dass alles richtig funktioniert.
Bildverarbeitung und-analyse
- Nach der Übernahme abgeschlossen ist, ist der nächste Schritt, um die Bilddaten in eine Form, die einfacher zu handhaben ist zu übertragen. Für die Zwecke dieses Protokolls, werde ich zunächst zeigen, wie man Filme mit Metamorph erzeugen, dann wie Bildmontagen mit dem ImageJ Programm zu generieren. Entweder Format nützlich sein wird für die Quantifizierung Zwecke.
- Der erste Schritt ist, um die Daten zu überprüfen. Dazu wählen Sie "Apps / Review Mehrdimensionale Daten" in der Menüleiste. Wählen Sie den Speicherort der Dateien und wählen Sie "Ansicht". Dies ermöglicht es Ihnen, den Stapel von Bildern aus jedem Stadium Position einzeln zu überprüfen. Wählen Sie die gewünschte Stufe Position, dann "Load Images". Sie können durch die Daten-Frame-by-Frame Voraus.
- Für diejenigen Bühne Positionen, in denen Zellen gehen durch Mitose (wie von DNA-und Zell-Morphologie bestimmt), können Sie Filme und Montagen mit Metamorph, oder mit anderen Programmen wie ImageJ (kostenlos erhältlich über NIH).
- Um einen Film in Metamorph, wählen Sie "Bearbeiten / Speichern Film" in der Menüleiste. Du wirst in der Lage sein, die Bilder zu verwenden, die Geschwindigkeit und den Dateityp des Films auszuwählen. Dann wählen Sie "Save Movie".
- Um eine Montage und ich spare den Bildstapel als. Stk Datei, die auch in anderen Programmen wie ImageJ verwendet werden.
- Öffnen Sie die Datei in ImageJ und vorab den Rahmen, bis Sie eine Zelle durchläuft Mitose zu finden. . Crop den Bereich um die Zelle und wählen Sie "Bild / Duplizieren" Hinweis: Vergewissern Sie sich, um alle Frames duplizieren.
- Um eine Montage, wählen Sie "Bild / Stacks / Make Montage" in der Menüleiste. Hier können Sie festlegen, welche Bilder Sie sind, der Größe und Form der Montage werden soll, und ob Sie die Grenzen zwischen den Frames. Wählen Sie diese und klicken Sie auf "Okay". .. Speichern Sie die Montage als tif-Datei und führen Sie einen weiteren Verarbeitung in beiden ImageJ oder Adobe Photoshop Tipp: Ändern Sie montage-Dateien aus dem 16-Bit-Format, das von Metamorph auf 8-Bit-Format verwendet zur leichteren Bildverarbeitung.
- Zur Berechnung der Zeit in verschiedenen Stadien der Mitose bestimmen t = 0 (erste Anzeichen für DNA-Kondensation oder Zellabrundung), die Anzahl der Frames, bis Chromosomen am Äquator (Zeit in Prophase / Prometaphase), Frames ausgerichtet sind, bis Chromosomen zu trennen beginnen (Zeit in der Metaphase) und Frames, bis die Zellen beginnen zu glätten (Anaphase / Telophase / Cytokinese). Die berechnete Zeit in jeder mitotischen Phase hängt von dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Bildern.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer typischen Kontroll-siRNA-Transfektion Experiment mit einem HeLa Zelllinie Histon H2B-mCherry. Diese Methode der hat effektiv auf mitotische Timing quantifizieren und enthüllt eine unerwartete Rolle für die nucleoporin Nup153 in das Timing der späten Mitose 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
Discussion
Mit den jüngsten Fortschritten in der Bildgebung und fluoreszierendes Protein-Technologie, hat Live-Bildgebung zu einem routinemäßigen Bestandteil der zellulären Analyse 2. Eine Vielzahl von GFP (und andere Farbvarianten 3)-markierte Proteine sind überall erhältlich oder relativ leicht zu konstruieren und können verwendet werden, um eine Reihe von Zellteilung Kennzeichen einschließlich DNA / Chromosom Dynamik 4, 5, Zentrosom Vervielfältigung 6, Cyclin B Dynamik zu verfolgen 7, Kernhülle Abbau und Wiedereinbau 8, 9, Mitosespindel Bildung 10 und verschiedenen Stadien der Cytokinese 11. Tagged Proteine können allein oder in Kombination verwendet werden, wenn die Anregungs / Emissionsspektren von fluoreszierenden Tags kompatibel sind, so dass die Koordination zwischen bestimmten Ereignissen zu beurteilen. Wenn größere räumliche und / oder temporale Auflösung ist / sind erwünscht, auch weiterhin die konfokale Mikroskopie, ob Laser-Scanning-, Spinning-Disk oder Resonanz Scannen verwendet werden kann, und die Liste der anspruchsvolle Mikroskopie-Optionen mit zunehmenden Auflösung zu wachsen. Live-Bildgebung der Mitose in Säugetierzellen ist auch für den Einsatz in High-Throughput-RNAi und kleinen Molekül-Bildschirme 12-14 angepasst worden. Während also ein s erste Experimente mit dieser Technik kann relativ einfach, sind die Möglichkeiten für den Aufbau dieser Strategie umfangreich.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (PF-07-103 bis 01-CSM), die National Institutes of Health (R01 GM61275 und P30 CA042014), die Leukämie-und Lymphom-Gesellschaft und der Huntsman Cancer Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
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