Summary
Qui si descrive un protocollo di base per l'immagine e quantificare i tempi mitotico delle cellule dei tessuti dei mammiferi vivono cultura dopo trasfezione di siRNA.
Abstract
Cambiamenti nell'organizzazione del cellulare e della dinamica dei cromosomi che si verificano durante la mitosi sono strettamente coordinato per garantire eredità accurata del contenuto genomica e cellulare. Hallmark eventi della mitosi, come il movimento dei cromosomi, può essere facilmente monitorati su base singola cella utilizzando time-lapse microscopia a fluorescenza di linee cellulari di mammiferi che esprimono specifiche proteine GFP-tagged. In combinazione con base di RNAi esaurimento, questo può essere un metodo efficace per individuare la fase di (s) della mitosi in cui i difetti si verificano dopo i livelli di una proteina particolare sono stati abbassati. In questo protocollo, vi presentiamo un metodo di base per valutare l'effetto di impoverire una proteina potenziale mitotico regolamentazione sui tempi della mitosi. Le cellule sono transfettate con siRNA, posto in un palco-top camera di incubazione, e fotografato con un microscopio a fluorescenza automatizzato. Abbiamo descritto come utilizzare il software per impostare un time-lapse experiment, come elaborare il sequenze di immagini per dare sia di immagini fisse montaggi o film, e come quantificare e analizzare i tempi di stadi mitotico si usa una cella-line expressing mCherry- tag istone H2B. Infine, si discute considerazioni importanti per la progettazione di un time-lapse esperimento. Questa strategia è complementare ad altri approcci e offre i vantaggi di 1) sensibilità ai cambiamenti di cinetica che potrebbe non essere osservati quando si guarda cellule come una popolazione e 2) l'analisi della mitosi, senza la necessità di sincronizzare il ciclo cellulare con trattamenti farmacologici. Le informazioni visive dagli esperimenti di imaging, non solo permette la sub-fasi della mitosi da valutare, ma può anche fornire indicazioni inaspettati che non sarebbe evidente dall'analisi del ciclo cellulare da FACS.
Protocol
trasfezione di siRNA e la preparazione delle cellule
- Preparare un 4-ben LabTek II coprioggetti incamerata con l'aggiunta di 0,5 ml di fibronectina (10μg/mL) in ciascun pozzetto che verrà utilizzato. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complessi di trasfezione inverso secondo le istruzioni del produttore s. Usare le quantità raccomandate di un pozzetto di un piatto ben 24 per camera da utilizzare (100μL totale). Un prodotto analogo / protocollo per la trasfezione di siRNA possono essere sostituiti.
- Rimuovere la fibronectina dai pozzi del coprioggetti camerati. Aggiungere 100μL di siRNA / Lipofectamine complessi RNAiMAX in ogni pozzetto che verrà utilizzato.
- Aliquota 20.000 istone H2B-mCherry cellule che esprimono (in 500μL) per pozzetto contenente miscela di trasfezione.
- Consentono alle cellule ad incubare per ~ 24 ore prima della sostituzione miscela trasfezione con 1 ml di medium di coltura delle cellule normali.
- Incubare cellule ulteriori 24 ore prima acquisizione delle immagini (48 ore post-trasfezione).
Microscopio setup e acquisizione delle immagini
- Ci sono tre parti principali per la configurazione di acquisizione delle immagini: 1) una cella incubatore che si adatta in scena microscopio e mantiene un ambiente umido costante di 37 ° C, e il 5% di CO 2; 2) un microscopio invertito dotato di uno stadio automatizzato, automatizzato persiane fluorescenza e chiaro, e automatizzato ruote portafiltri e 3) un pacchetto software che integra e controlla il palco, persiane, e le ruote filtro. Nella nostra configurazione di imaging, si usa una cella personalizzata incubatore da OKO laboratorio che possono essere utilizzati con il II LabTek chambered coprioggetti. Il palco, persiane, e le ruote filtro sono controllate dal software Metamorph. Suggerimento: Il Laboratorio OKO stadio-top sistema incubatore comprende adattatori per una varietà di differenti piatto, piatto, o dimensioni coprioggetto.
- Posizionare il LabTek II coprioggetti camerata in dell'incubatore aprendo il coperchio del pre-riscaldato ed equilibrato incubatore, posizionando il coprioggetti camerata in l'adattatore, e tenendo in posizione con plastilina. Lasciare il coperchio sul coprioggetti incamerata in modo che il terreno di coltura cellulare non si secchino. Chiudere il coperchio e posizionare il tutto incubatore sul palco microscopio, assicurando che l'incubatore si tiene saldamente in posizione.
- Utilizzando Metamorph, istituito l'esperimento selezionando "Applicazioni / Acquisizione multidimensionali" nella barra dei menu del software. Si aprirà una finestra nella quale è possibile selezionare la frequenza e la lunghezza del Timelapse, il tempo di esposizione per ogni colore (se fare le regolazioni multiple), il numero e la localizzazione delle posizioni palco, e il numero di z-sezioni (se ) desiderata. . Scegliere dove salvare i file di dati Suggerimento: se usate un software diverso Metamorph, le funzioni possono essere leggermente diversi, ma il concetto generale è lo stesso. Micromanager, un open source ImageJ basato su software di acquisizione che è compatibile con gran parte delle configurazioni hardware, è un'ottima alternativa.
- . Ai fini di questo protocollo, che acquisirà le immagini a due lunghezze d'onda (campo chiaro e mCherry) ogni 15 minuti per 8 ore a 15 posizioni fase Suggerimento: Se la risoluzione del momento migliore è desiderato, quindi si può ridurre l'intervallo di tempo tra le acquisizioni, ma , le posizioni fase meno può essere utilizzato, e quindi un minor numero di cellule mitotiche saranno disponibili per l'analisi. E 'importante quando si considera intervalli di tempo di prendere in considerazione il tempo necessario per la ruota filtro per passare da un set di filtri.
- Determinare il momento ottimale di esposizione per ogni lunghezza d'onda dapprima concentrandosi su un campo di cellule con illuminazione campo chiaro. Nel software, regolare la funzione di messa a fuoco automatica solo per il channel campo chiaro (questo permetterà al software di messa a fuoco automatica ad ogni posizione stadio prima di ogni acquisto). Suggerimento: Si utilizza un 40x a contrasto di fase obiettivo di dare resolution eccellente senza la necessità di petrolio . Altri obiettivi possono essere utilizzati a seconda della risoluzione ottica desiderata.
- Passare alla lunghezza d'onda mCherry e scattare un'immagine utilizzando un 50 esposizione msec. Regolare il tempo di esposizione al minimo indispensabile per vedere una buona immagine. È essenziale per limitare la quantità di esposizione alla luce per garantire la vitalità delle cellule sostenuta. Come regola generale, questo può essere realizzato utilizzando un filtro a densità neutra (per ridurre il flusso luminoso eccitazione) e più a lungo un tempo di esposizione della fotocamera, piuttosto che aumentando la resistenza illuminazione. Ripetere questa procedura per ogni lunghezza d'onda aggiuntive da utilizzare. Suggerimento: Per determinare la redditività a lungo termine delle cellule in una data esposizione per l'esperimento, è possibile visualizzare in anteprima il numero totale di immagini una cella può sopravvivere a Timelapse desiderato modificando temporaneamente la spaziatura timepoint da minuti a secondi (cioè, 10 min. diventa 10 secondi). Se le cellule sopravvivono 100-200 esposizioni (o ilnumero appropriato), quindi l'esposizione è bene. In caso contrario, ridurre la luce di eccitazione, tempo di esposizione, o il numero totale di immagini per simulare l'esperimento completo.
- Poi, selezionare e segnare un numero adeguato di posizioni fase in modo che si può ottenere adeguato campionamento della popolazione di cellule. Metamorph registrerà le posizioni e farvi ritorno per ogni acquisizione. Suggerimento: io in genere cercano di trovare posizioni in cui ci sono molte cellule di immagine, ma non così tanti che sono troppo densi. Inoltre, è importante scegliere posizioni abbastanza in modo che si hanno buone possibilità di osservare un gran numero di cellule progredendo attraverso la mitosi.
- Dopo tutto Timelapse, tempo di esposizione lunghezza d'onda, e la posizione informazione fase sono stati registrati, selezionare il pulsante "Anteprima" sullo schermo per determinare se il software è il controllo delle attrezzature in modo appropriato.
- Una volta soddisfatti, selezionare il pulsante "Acquisisci" sullo schermo per iniziare l'acquisizione. Poi sedersi e consentire al computer e il microscopio per fare il lavoro. Suggerimento: Osservare l'automazione attraverso almeno un giro completo di acquisizione per garantire che tutto funzioni correttamente.
Elaborazione delle immagini e analisi
- Dopo l'acquisizione è terminata, il passo successivo è quello di trasferire i dati immagine in una forma che è più facile da gestire. Ai fini di questo protocollo, voglio dimostrare prima come generare filmati utilizzando Metamorph, poi come generare montaggi immagine utilizzando il programma ImageJ. Sia in formato sarà utile ai fini di quantificazione.
- Il primo passo è quello di rivedere i dati. Per farlo, selezionare "Applicazioni / Rassegna dati multidimensionali" nella barra dei menu. Selezionare la posizione del file, quindi selezionare "View". Questo vi permetterà di rivedere la pila di immagini da ogni posizione stadio individualmente. Selezionare la posizione di fase desiderata, quindi "Carica Immagini". Sarete in grado di avanzare attraverso i dati fotogramma per fotogramma.
- Per quelle posizioni fase in cui le cellule passano attraverso la mitosi (come determinato da entrambi i DNA e morfologia cellulare), è possibile realizzare filmati e montaggi utilizzando Metamorph, o con altri programmi come ImageJ (disponibile gratuitamente attraverso NIH).
- Per fare un film in Metamorph, selezionare "Processo / Save film" nella barra dei menu. Sarete in grado di selezionare i fotogrammi da utilizzare, la velocità e il tipo di file del film. Quindi selezionare "Salva filmato".
- Per fare un montaggio, risparmio il serie di immagini come file. Stk, che possono essere utilizzati in altri programmi come ImageJ.
- Aprire il file in ImageJ e far avanzare i telai fino a trovare una cellula passa attraverso la mitosi. . Raccolto l'area intorno alla cella e selezionare "Immagine / Duplica" Suggerimento: assicurarsi di duplicare tutti i fotogrammi.
- Per fare un montaggio, selezionare "Immagine / stack / Fai Montage", nella barra dei menu. Qui è possibile specificare quali fotogrammi che si desidera includere, la dimensione e la forma del montaggio, e se si desidera confini tra i fotogrammi. Selezionare queste e clicca su "Ok". .. Salvare il montaggio come file tif e fare ogni ulteriore elaborazione sia in ImageJ o Adobe Photoshop Suggerimento: Modificare i file di montaggio da 16-bit formato utilizzato da Metamorph a 8-bit per l'elaborazione delle immagini più facile.
- Per calcolare il tempo in diverse fasi della mitosi, determinare t = 0 (primo segno di condensa DNA o arrotondamento delle cellule), contare il numero di fotogrammi fino cromosomi si allineano all'equatore (tempo in profase / prometafase), cornici fino cromosomi cominciano a segregare (tempo in metafase), e le cornici fino cellule cominciano ad appiattirsi (anafase / telofase / citodieresi). Il tempo calcolato in ogni fase mitotica dipende dall'intervallo di tempo tra ogni fotogramma.
Rappresentante Risultati
La figura 1 illustra i risultati di un tipico esperimento di trasfezione di siRNA di controllo utilizzando una linea cellulare HeLa che esprimono istone H2B-mCherry. Questo metodo di è stato effettivamente utilizzato per quantificare tempi mitotica, rivelando un ruolo inaspettato per la nucleoporin Nup153 nei tempi della tarda mitosi 1. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Discussion
Con i recenti progressi nel campo dell'imaging e della tecnologia proteina fluorescente, immagini dal vivo è diventato un aspetto di routine di analisi cellulare 2. Una varietà di GFP (e altre varianti di colore 3)-tagged proteine sono ampiamente disponibili e relativamente facile da realizzare e può essere usato per tenere traccia di un certo numero di caratteristiche tra cui la divisione cellulare DNA / dinamiche cromosoma 4, 5, centrosoma duplicazione 6, ciclina dinamiche B 7, ripartizione involucro nucleare e rimontaggio 8, 9, fuso mitotico formazione di 10, e varie fasi di citocinesi 11. Proteine tag possono essere usati da soli o in combinazione, quando l'eccitazione / emissione spettri di tag fluorescenti sono compatibili, permettendo il coordinamento tra gli eventi specifici da valutare. Se la risoluzione spaziale maggiore e / o temporale è / sono desiderati, se microscopia confocale a scansione laser scanning, disco rotante, o risonanza può essere utilizzata, e l'elenco delle opzioni di microscopia sofisticate con sempre maggiore risoluzione continua a crescere. Immagini dal vivo della mitosi nelle cellule di mammifero è stato adattato per l'uso in high-throughput RNAi e gli schermi di piccole molecole 12-14. Così, mentre gli esperimenti iniziale di un s utilizzando questa tecnica può essere relativamente semplice, le possibilità di costruire su questa strategia sono molteplici.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), il National Institutes of Health (R01 GM61275 e P30 CA042014), la Leukemia and Lymphoma Society, e la Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
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