Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a imagem e quantificar o tempo de mitose de células vivas de tecidos de mamíferos cultura após transfecção siRNA.
Abstract
Mudanças na organização celular e dinâmica cromossomo que ocorrem durante a mitose são fortemente coordenada para garantir a herança precisa do conteúdo genômico e celular. Hallmark eventos da mitose, como o movimento de cromossomos, podem ser facilmente rastreados em uma base de células individuais usando lapso de tempo de microscopia de fluorescência de linhas de células de mamíferos expressar específicas proteínas GFP. Em combinação com RNAi baseado esgotamento, este pode ser um método poderoso para identificar o estágio (s) da mitose, onde os defeitos ocorrem após os níveis de uma proteína particular, têm sido reduzidos. Neste protocolo, apresentamos um método básico para avaliar o efeito de esgotar uma proteína mitótica potencial regulatório sobre o momento da mitose. Células são transfectadas com siRNA, colocados em uma câmara de incubação em estágio superior, e fotografada usando um microscópio de fluorescência automatizado. Descrevemos como usar o software para criar uma experiência de lapso de tempo, como o processo de sequências de imagens para fazer qualquer imagem estática-montagens ou filmes, e como quantificar e analisar o timing das etapas mitóticas usando uma linha de células expressando-mCherry tagged H2B histonas. Finalmente, discute considerações importantes para a concepção de um experimento de lapso de tempo. Esta estratégia é complementar a outras abordagens e oferece as vantagens de 1) sensibilidade a mudanças na cinética que pode não ser observada quando se olha para as células de uma população e 2) Análise da mitose sem a necessidade de sincronizar o ciclo celular utilizando tratamentos medicamentosos. A informação visual a partir de experimentos de imagem, não só permite que as fases sub-da mitose de ser avaliado, mas também pode fornecer uma visão inesperada que não seria aparente a partir da análise do ciclo celular por FACS.
Protocol
transfecção siRNA e preparação celular
- Prepare um 4-bem LabTek II lamela chambered adicionando 0,5 mL de fibronectina (10μg/mL) a cada poço que será usado. Incubar por 10-15 minutos em temperatura ambiente.
- Prepare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complexos para reverter transfecção de acordo com as instruções do fabricante s. Use a quantidade recomendada para um poço de um prato de 24 poços por câmara a ser utilizada (100μL total). Um produto análogo / protocolo de transfecção siRNA pode ser substituído.
- Remova a fibronectina dos poços da lamela câmaras. Adicionar 100μL de siRNA / Lipofectamine complexos RNAiMAX a cada poço que será usado.
- Alíquota de 20 mil histona H2B-mCherry células que expressam (em 500μL) por poço contendo mistura de transfecção.
- Permitir que as células incubar por ~ 24 horas antes de substituir a mistura de transfecção com 1 mL de meio de cultura de células regulares.
- Células incubar mais 24 horas antes da aquisição da imagem (48 horas pós-transfecção).
Configuração do microscópio e de aquisição de imagem
- Há três partes principais para a configuração de aquisição de imagem: 1) uma célula incubadora que se encaixa no palco microscópio e mantém um ambiente úmido constante de 37 ° C, e 5% CO 2, 2) um microscópio invertido equipado com um palco automatizado, automatizado obturadores de fluorescência e campo claro, e rodas de filtros automáticos e 3) um pacote de software que integra e controla o palco, persianas, e rodas de filtros. Em nossa configuração de imagem, usamos um celular personalizado incubadora de OKO Lab que pode ser usado com o II LabTek chambered lamínula. O palco, persianas, e rodas de filtros são controladas pelo software Metamorph Dica:. O Laboratório OKO fase superior do sistema de incubadora inclui adaptadores para uma variedade de placas diferentes, prato, ou tamanhos lamela.
- Posição do LabTek II lamela chambered na incubadora, abrindo a tampa da incubadora pré-aquecido e equilibrado, colocando a lamela chambered no adaptador, e segurando no lugar com massa de modelar. Deixar a tampa do lamela câmaras para que o meio de cultura celular não vai secar. Feche a tampa e posicione a incubadora inteira no palco microscópio, assegurando que a incubadora é mantida firmemente no lugar.
- Usando Metamorph, configure seu experimento, selecionando "Apps / Aquisição Multidimensional" na barra de menus do software. Isso fará com que uma janela na qual você pode selecionar a freqüência ea duração do timelapse, o tempo de exposição para cada cor (se fazendo várias configurações), o número ea localização das posições de estágio, eo número de z-seções (se ) desejado. Selecione onde deseja salvar os arquivos de dados Dica:. Se estiver usando outro software que não Metamorph, as funções podem ser ligeiramente diferentes, mas o conceito geral é o mesmo. Micromanager, um software de código aberto baseado em aquisição ImageJ que seja compatível com a maioria das configurações de hardware, é uma excelente alternativa.
- . Para efeitos do presente protocolo, iremos adquirir imagens em dois comprimentos de onda (claro e mCherry) a cada 15 minutos para 8 horas a 15 posições estágio Dica: Se a resolução melhor momento é desejada, então você pode encurtar o intervalo de tempo entre as aquisições, no entanto , as posições menos estágio pode ser usado, e células mitóticas, assim, menos estarão disponíveis para análise. É importante quando considerando os intervalos de tempo para ter em conta o tempo necessário para a roda de filtros para alternar entre conjuntos de filtros.
- Determine o tempo de exposição ideal para cada comprimento de onda pela primeira foco em um campo de células com uma iluminação de campo claro. No software, ajustar a função de focagem automática apenas para o canal de campo claro (isso vai permitir que o software de focagem automática em cada posição palco antes de cada aquisição) Dica:. Usamos um 40x objetivo de contraste de fase e seco para dar excelente resolução, sem a necessidade de petróleo . Outros objetivos podem ser usados dependendo da resolução óptica desejada.
- Mude para o comprimento de onda mCherry e encaixe uma imagem usando a 50 msec exposição. Ajustar o tempo de exposição ao mínimo necessário para ver uma boa imagem. É essencial para limitar a quantidade de exposição à luz para garantir a viabilidade celular sustentável. Como regra geral, esta pode ser alcançada usando um filtro de densidade neutra (para reduzir o fluxo de luz de excitação) e um maior tempo de exposição da câmera ao invés de aumentar a força de iluminação. Repita este procedimento para qualquer comprimentos de onda adicionais para serem usados Dica:. Para determinar a longo prazo a viabilidade celular em uma determinada exposição para a sua experiência, você pode visualizar o número total de imagens de uma célula pode sobreviver ao longo dos timelapse desejado adaptando temporariamente o espaçamento timepoint de minutos para segundos (ou seja, 10 min. torna-se 10 segundos). Se suas células sobrevivem 100-200 exposições (ou onúmero apropriado), então sua exposição é muito bem. Se não, reduzir a sua luz de excitação, tempo de exposição, ou o número total de imagens para simular sua experiência completa.
- Em seguida, selecione e marca um número adequado de posições estágio para que você possa obter uma amostragem adequada da população celular. Metamorph irá gravar as posições e vai voltar lá para cada aquisição Dica:. Eu geralmente tentar encontrar posições em que há uma abundância de células a imagem, mas não tantos que eles são muito densos. Além disso, é importante selecionar posições suficiente para que você terá uma boa chance de observar um grande número de células progredindo através de mitose.
- Afinal timelapse, tempo de exposição de comprimento de onda, e informações sobre a posição estágio foram gravadas, selecione a opção "Preview" botão na tela para determinar se o software está controlando o equipamento adequadamente.
- Quando estiver satisfeito, selecione a opção "Adquirir" botão na tela para começar a aquisição. Depois sentar e permitir que o computador e microscópio para fazer o trabalho Sugestão:. Observe a automação através de pelo menos uma rodada cheia de aquisição para garantir que tudo está funcionando corretamente.
Processamento de imagem e análise
- Após a aquisição for concluída, o próximo passo é transferir os dados de imagem em uma forma que é mais fácil de manusear. Para efeitos do presente protocolo, vou demonstrar primeiro como gerar filmes com Metamorph, então, como para gerar montagens de imagens utilizando o programa ImageJ. O formato será útil para fins de quantificação.
- O primeiro passo é rever os dados. Para fazer isso, selecione "Dados de Aplicativos / Revisão Multidimensional" na barra de menu. Selecione o local de seus arquivos, em seguida, selecione "View". Isto irá permitir que você reveja a pilha de imagens de cada posição etapa individualmente. Selecione a posição estágio desejado, depois em "Load Images". Você será capaz de avançar através dos dados de quadro a quadro.
- Para essas posições estágio em que as células passam por mitose (conforme determinado pelo DNA e morfologia celular), você pode fazer filmes e montagens usando Metamorph, ou com outros programas como o ImageJ (disponível gratuitamente através do NIH).
- Para fazer um filme em Metamorph, selecione "Processo / Save filme" na barra de menu. Você será capaz de selecionar quais quadros de usar, a velocidade e tipo de arquivo do filme. Em seguida, selecione "Salvar Filme".
- Para fazer uma montagem, eu salvo a pilha imagem como um arquivo stk., Que pode ser usado em outros programas como o ImageJ.
- Abra o arquivo no ImageJ e avançar os quadros até encontrar uma célula passando por mitose. . Recortar a área ao redor da célula e selecione "Image / Duplicate" Dica: Certifique-se de duplicar todos os quadros.
- Para fazer uma montagem, selecione "Image / Pilhas / Make Montage" na barra de menu. Aqui você pode especificar os quadros que você deseja incluir, o tamanho ea forma da montagem, e se você quer fronteiras entre os frames. Selecione essas e clique em "Ok". .. Salvar a montagem como um arquivo tif e qualquer outro tratamento em qualquer ImageJ ou Adobe Photoshop Dica: Alterar arquivos montagem do formato de 16 bits usado por Metamorph a 8 bits formato para o processamento de imagem mais fácil.
- Para calcular o tempo em diferentes estágios de mitose, determinar t = 0 (primeiro sinal de condensação de DNA ou arredondamento das células), contar o número de quadros até cromossomos estão alinhados no equador (tempo em prófase / prometáfase), até quadros cromossomos começam a segregar (tempo em metáfase) e quadros até que as células começam a se achatar (anáfase / telófase / citocinese). O tempo calculado em cada fase mitótica depende do intervalo de tempo entre cada quadro.
Resultados representante
A figura 1 ilustra os resultados de um experimento típico transfecção controle siRNA usando uma linhagem de células HeLa expressar histona H2B-mCherry. Este método tem sido utilizado de forma eficaz para quantificar tempo mitótico, revelando um inesperado papel para o Nup153 nucleoporin no sincronismo da mitose final 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Discussion
Com os recentes avanços na tecnologia de imagem e proteína fluorescente, imagens ao vivo tornou-se um aspecto de análise de rotina celular 2. Uma variedade de GFP (e suas variantes outra cor 3)-tagged proteínas são amplamente disponíveis e relativamente fáceis de construir e pode ser usado para controlar um número de marcas, incluindo a divisão celular DNA / dinâmica cromossomo 4, 5, 6 duplicação centrossoma, ciclina B dinâmica 7, desagregação envelope nuclear e remontagem 8, 9, a formação do fuso mitótico 10, e vários estágios de citocinese 11. Tagged proteínas pode ser usado sozinho ou em combinação, quando os espectros de excitação / emissão de etiquetas fluorescentes são compatíveis, permitindo a coordenação entre os eventos específicos a serem avaliados. Se a resolução espacial maior e / ou temporal é / são desejada, microscopia confocal de varredura se varredura a laser, disco giratório, ou ressonância pode ser utilizado, bem como a lista de opções sofisticadas de microscopia, com cada vez maior a resolução continua a crescer. Imagens ao vivo da mitose em células de mamíferos também foi adaptado para uso em alto rendimento RNAi e telas de pequena molécula 12-14. Assim, enquanto uma experimentos iniciais s usando esta técnica pode ser relativamente simples, as possibilidades de construção desta estratégia são extensas.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), o National Institutes of Health (R01 e P30 GM61275 CA042014), a Leucemia and Lymphoma Society, eo Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
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