Summary
Здесь мы опишем основные протокол к образу и количественно митотической сроки живых тканей млекопитающих культуре клеток после трансфекции миРНК.
Abstract
Изменения в клеточной организации и хромосомные динамики, которые происходят во время митоза тесно координироваться с целью обеспечения точного наследование генома и клеточного содержания. Hallmark событий митоза, такие, как хромосомы движения, могут быть легко отслеживаются на индивидуальной основе ячейки с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии из клеточных линий млекопитающих выражения конкретных GFP с метками белков. В сочетании с RNAi основе истощения, это может быть мощным инструментом для точного определения стадии (ы) митоза, где дефекты возникают после уровни конкретного белка были снижены. В этом протоколе, мы представляем Основным методом для оценки последствий истощения потенциальных митотической регуляторный белок от сроков митоза. Клетки трансфицированных миРНК, размещенных в стадии инкубации топ-камеры, и отображаемого использованием автоматизированного микроскопа флуоресценции. Мы опишем, как использовать программное обеспечение для создания покадровой эксперимент, как обрабатывать последовательности изображений, чтобы сделать либо неподвижных изображений монтажи или фильмы, и как количественно и анализировать временные этапы митотического использованием клеточных линий выражения mCherry- меткой гистонов H2B. Наконец, мы обсудим важные соображения по проектированию покадровой эксперимента. Эта стратегия дополняет другие подходы и предлагает преимущества 1) чувствительность к изменениям в области кинетики, которые не могут наблюдаться при взгляде на клетки, как население и 2) анализ митоза без необходимости синхронизации клеточного цикла использования медикаментозного лечения. Визуальной информации из таких экспериментов изображений позволяет не только к югу от стадии митоза предстоит оценить, но также может предоставить неожиданное понимание того, что не будет видно из клеточного цикла анализа FACS.
Protocol
трансфекции миРНК и клеточной подготовки
- Подготовка 4-а LabTek II патрон покровного стекла, добавляя 0,5 мл фибронектина (10μg/mL) в каждую ячейку, которая будет использоваться. Инкубируйте в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
- Подготовка миРНК / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) комплексы для обратного трансфекции соответствии с инструкциями производителя с. Используйте рекомендуемое количество для одной скважины из 24-и блюда на камеру, которые будут использоваться (100 мкл общего числа). Аналогичный продукт / протокол для трансфекции миРНК могут быть заменены.
- Удалить фибронектина из скважин покровного стекла патрон. Добавьте 100 мкл миРНК / Lipofectamine RNAiMAX комплексов в каждую ячейку, которая будет использоваться.
- Алиготе 20000 гистонов H2B-mCherry-клеток, экспрессирующих (в 500 мкл) в каждую лунку содержащие трансфекции смеси.
- Разрешить клетки инкубировать в течение ~ 24 часов, прежде чем заменять трансфекции смеси с 1 мл регулярной среде клеточной культуры.
- Инкубируйте клетки еще на 24 часа до захвата изображения (48 часов после трансфекции).
Установка микроскопа и получения изображений
- Существуют три основных частей установки захвата изображений: 1) клетка инкубатор, который подходит на столик микроскопа и поддерживает постоянную влажной среды 37 ° C и 5% CO 2, 2) инвертированный микроскоп оснащен автоматизированной этапе автоматизированные жалюзи флуоресценции и светлого поля, и автоматизированного фильтра колеса, и 3) программный пакет, который объединяет и контролирует стадию, ставни, и фильтр колеса. В нашей визуализации установки, мы используем индивидуальные ячейки инкубатор от ОКО Лаборатории, которые могут быть использованы с LabTek II патрон покровного стекла. Этапе, ставни, и фильтр колеса управляются программным обеспечением Метаморф Подсказка:. ОКО Лаборатории стадии топ-инкубатор системы включает в себя адаптеры для различных пластины, блюдо, или покровное размеров.
- Позиция LabTek II патрон покровного стекла в инкубаторе, открыв крышку подогретого и уравновешенной инкубатор, размещение покровного стекла на камеры в адаптер, а также проведение в месте с пластилин. Оставьте крышку покровного стекла патрон так, что среда культуры клеток не высохнут. Закрыть крышкой и позицию всей инкубатор на столике микроскопа, гарантируя, что инкубатор прочно удерживается на месте.
- Использование Метаморф, создать свой эксперимент, выбрав "Apps / Многомерные Приобретение" в строке меню программы. После этого появится окно, в котором вы можете выбрать частоту и продолжительность timelapse, время экспозиции для каждого цвета (если это несколько параметров), количество и расположение этапе позиций, а число Z-секции (если желательно). . Выберите путь для сохранения файлов данных Подсказка: Если вы используете программное обеспечение, отличное Метаморф, функции могут несколько отличаться, но общая концепция та же. Микроменеджер, с открытым исходным кодом ImageJ основе приобретения программного обеспечения, совместимого со всеми типами оборудования, является отличной альтернативой.
- . Для целей настоящего протокола, мы будем получать изображения на двух длинах волн (светлое и mCherry) каждые 15 минут в течение 8 часов при 15 этап позиции Подсказка: Если лучше временное разрешение требуется, то вы можете сократить временной интервал между приобретений, однако , меньше позиции этапе могут быть использованы, и, следовательно, меньшее число клеток митотической будут доступны для анализа. Очень важно при рассмотрении временных интервалов учитывать время, необходимое для фильтра колесо для переключения между наборами фильтров.
- Определить оптимальное время экспозиции для каждой длины волны по первому упором на область ячеек с помощью светлого освещения. В программное обеспечение, настраивать автофокус функция доступна только для светлого канала (это позволит программное обеспечение для автофокус на каждом этапе позицию до каждого приобретения) Подсказка:. Мы используем сухой 40x фазоконтрастной цель дать превосходное разрешение, без необходимости на нефть . Другие цели могут быть использованы в зависимости от оптического разрешения лучшего.
- Переключить на длине волны mCherry и оснастки изображения, используя 50 мс экспозиции. Отрегулируйте время экспозиции до минимума, необходимого, чтобы увидеть хороший имидж. Важно, чтобы ограничить количество освещенности для обеспечения устойчивой жизнеспособности клетки. Как правило, это лучше всего можно достичь, используя фильтр нейтральной плотности (для уменьшения потока возбуждающего света) и более длительное время экспозиции камеры, а не за счет увеличения освещенности силы. Повторите эту процедуру для дополнительных длин волн, которые будут использоваться Подсказка:. Для определения долгосрочной жизнеспособности клеток при данной экспозиции для вашего эксперимента, вы можете просмотреть общее количество изображений клетка может выжить в течение желаемого timelapse, временно регулировка расстояния timepoint от нескольких минут до нескольких секунд (то есть, 10 мин. станет 10 секунд). Если ваши клетки выживают 100-200 экспозиций (илисоответствующее число), то ваша экспозиция в порядке. Если нет, то уменьшить возбуждающего света, время экспозиции, или общее количество изображений, чтобы имитировать ваше полное эксперимента.
- Далее, выберите и отметьте соответствующее количество позиций стадии, так что вы можете достичь адекватной выборки клеточной популяции. Метаморф будет фиксировать позиции и вернуться туда для каждого случая получения Подсказка:. Я вообще пытаюсь найти позицию, в которой Есть много клеток, чтобы изображение, но не так много, что они слишком плотным. Кроме того, важно, чтобы выбрать достаточно позиций, с тем, что у вас будет хороший шанс наблюдения большого числа клеток прогрессирует через митоз.
- В конце концов timelapse, время воздействия волны, а также информацию этапе положение было записано, выберите "Предварительный просмотр" на экран, чтобы определить, является ли программное обеспечение управления оборудованием соответствующим образом.
- Если вас устраивает, выберите "приобретает" кнопки на экране, чтобы начать покупки. Потом сидеть сложа руки и дайте компьютеру и микроскоп, чтобы сделать работу Подсказка:. Соблюдать автоматизации по крайней мере один полный раунд приобретения до гарантировать, что все работает правильно.
Обработки и анализа изображений
- После приобретения завершена, следующим шагом является передача данных изображения в форме, которая проще в обращении. Для целей настоящего протокола, я продемонстрирую первых, как создавать фильмы с помощью Метаморф, то, как создавать изображения монтажи с помощью программы ImageJ. Либо формат будет полезна для количественной цели.
- Первый шаг заключается в анализе данных. Для этого выберите "Apps / Обзор многомерных данных" в строке меню. Выберите местоположение ваших файлов, затем выберите "Вид". Это позволит вам просматривать стек изображений из каждого этапа позиции в индивидуальном порядке. Выберите нужный этап положение, затем "Загружать изображения". Вы сможете перемещаться по данным кадр за кадром.
- Для тех, кто этапе позиций, при котором клетки проходят через митоз (определяется как ДНК и клеточной морфологии), вы можете снимать фильмы и монтажи использованием Метаморф, или с другими программами, такими как ImageJ (доступны бесплатно через NIH).
- Чтобы сделать фильм в Метаморф, выберите "Процесс / Сохранить фильм" в строке меню. Вы сможете выбрать, какие кадры для использования, скорость и тип файла фильма. Затем выберите "Записать фильм».
- Чтобы сделать монтаж, я сохраняю изображение стека. Файла STK, которые могут быть использованы в других программах, таких как ImageJ.
- Откройте файл в ImageJ и продвижения кадров, пока не найдете клетка проходит митоз. . Crop область вокруг клеток и выберите "Image / Duplicate" Подсказка: Убедитесь, что дублировать все кадры.
- Чтобы сделать монтаж, выберите "Image / Стеки / Сделать Монтаж" в строке меню. Здесь вы можете указать, какие кадры нужно включить, размер и форму монтаж, и хотите ли вы границы между фреймами. Выберите эти и нажмите "Хорошо". .. Сохранить монтаж в виде файла TIF и сделать какой-либо дальнейшей обработки в любом ImageJ или Adobe Photoshop Подсказка: Изменение монтаж файлов из 16-битного формата, используемого Метаморф в 8-битном формате для облегчения обработки изображений.
- Чтобы рассчитать время на разных стадиях митоза, определить т = 0 (первый признак конденсации ДНК или клеточных округления), подсчитать количество кадров до хромосомы выравниваются по экватору (время в профазе / прометафазе), кадры, пока хромосомы начинают отделять (время в метафазе), и кадры, пока клетки начинают сглаживаться (анафазе / телофазе / цитокинеза). Расчетное время в каждом митотической стадии зависит от временного интервала между кадрами.
Представитель Результаты
На рисунке 1 показаны результаты типичного контроля трансфекции миРНК эксперимент с использованием линии HeLa ячейки выражения гистонов H2B-mCherry. Этот метод был использован эффективно количественно митотической времени, открывая неожиданные роли nucleoporin Nup153 в сроках конце митоза 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Discussion
С учетом последних достижений в области обработки изображений и флуоресцентного белка технологии, живые изображения стало обычным аспект сотовой анализа 2. Разнообразие GFP (и других цветовых вариантах 3)-меткой белки широко доступны и относительно легко построить, и может быть использована для отслеживания числа признаков деления клеток, включая ДНК / хромосомы динамики 4, 5, 6 центросомы дублирования, циклин B динамики 7, ядерной пробоя оболочки и сборка 8, 9, формирование митотического веретена 10, а также различных этапах цитокинеза 11. Меткой белки могут быть использованы отдельно или в комбинации, когда возбуждение / спектры излучения флуоресцентных меток совместимы, что позволяет координацию между конкретными событиями предстоит оценить. Если большую пространственную и / или временное разрешение будет / желательны, конфокальной микроскопии ли лазерного сканирования, вращающийся диск, или резонанс сканирования могут быть использованы, и перечень сложных вариантов микроскопии с все возрастающей разрешение продолжает расти. Живая изображений митоза в клетках млекопитающих, также была адаптирована для использования в высокопроизводительных RNAi и малых экранов молекулы 12-14. Таким образом, хотя начальная экспериментах с помощью этой техники может быть относительно простой, возможности для построения на этой стратегии весьма обширны.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Американского онкологического общества (PF-07-103-01-CSM), Национального института здоровья (R01 GM61275 и P30 CA042014), лейкемии и лимфомы общества, и Охотник Фонд рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
