Summary
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll till bild och kvantifiera mitotiska timingen av levande däggdjursceller vävnadskultur efter siRNA transfektion.
Abstract
Förändringar i cellulära organisation och dynamik kromosom som inträffar under mitos är nära samordnas för att säkerställa korrekt arv av genetiska och cellulära innehåll. Hallmark händelser mitos, såsom kromosom rörelse, lätt kan spåras på en enskild cell basis med tidsförlopp fluorescensmikroskopi av däggdjur cellinjer som uttrycker specifika GFP-märkta proteiner. I kombination med RNAi-baserade utarmning, kan detta vara en kraftfull metod för att ringa scenen (er) i mitosen där defekter uppstå efter nivåer av ett visst protein har sänkts. I detta protokoll presenterar vi en grundläggande metod för att bedöma effekten av brytande en potentiell mitotiska reglerande protein på tidpunkten för mitos. Celler är transfererats med siRNA, placeras i en fas-top inkubation kammare och avbildas med en automatiserad fluorescensmikroskop. Vi beskriver hur man använder programvara för att skapa en time-lapse experiment, hur man bearbeta bildsekvenser för att göra antingen stillbilder montage eller filmer, och hur man kan kvantifiera och analysera valet av tidpunkt för mitotiska steg med hjälp av en cellinje som uttrycker mCherry- taggade histon H2B. Slutligen diskuterar vi viktiga överväganden för att utforma en time-lapse experiment. Denna strategi är ett komplement till andra metoder och erbjuder fördelarna av 1) känslighet för förändringar i kinetik som kanske inte observeras när man tittar på celler som en population och 2) analys av mitos utan att behöva synkronisera cellcykeln med hjälp av läkemedelsbehandling. Den visuella informationen från en sådan avbildning experiment gör inte bara sub-stadier av mitos som skall bedömas, men kan också ge oväntade insikter som inte skulle framgå av cellcykeln analys av FACS.
Protocol
siRNA transfektion och cellberedningen
- Förbered en 4-väl LabTek II chambered coverglass genom att tillsätta 0,5 ml fibronektin (10μg/mL) i varje brunn som kommer att användas. Inkubera i 10-15 minuter i rumstemperatur.
- Förbered siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) komplex för omvänd transfektion enligt tillverkarens anvisningar. Använd de rekommenderade beloppen för en brunn på en 24-bra maträtt per kammare som ska användas (100μL totalt). En liknande produkt / protokoll för siRNA transfektion kan ersättas.
- Ta bort fibronektin från brunnarna i chambered coverglass. Tillsätt 100μL av siRNA / Lipofectamine RNAiMAX komplex i varje brunn som kommer att användas.
- Alikvotera 20.000 histon H2B-mCherry-uttryckande celler (i 500μL) per brunn som innehåller transfektion blandning.
- Låt cellerna att inkubera för ~ 24 timmar innan du byter transfektion blandning med 1 mL regelbundna cellodlingsmedium.
- Inkubera cellerna i ytterligare 24 timmar innan Image Acquisition (48 timmar efter transfektion).
Mikroskop installation och bildtagning
- Det finns tre huvudsakliga delar till bilden förvärvet setup: 1) en cell inkubator som passar på mikroskop scenen och håller en konstant fuktig miljö med 37 ° C och 5% CO 2, 2) ett inverterat mikroskop utrustat med en automatiserad skede, automatiserade fluorescens och brightfield fönsterluckor, och automatiserade filter hjul och 3) ett programpaket som integrerar och kontrollerar scenen, fönsterluckor, och filtrera hjul. I vår avbildning installationen använder vi en skräddarsydd cell inkubator från OKO Lab som kan användas med LabTek II chambered coverglass. Scenen, fönsterluckor, och filtrera hjulen styrs av metamorfa programvaran. Tips: Det OKO Lab steg-top inkubator system innehåller adaptrar för en mängd olika tallrik, skål, eller storlekar täckglas.
- Placera LabTek II chambered coverglass i inkubatorn genom att öppna locket på förvärmda och jämvikt inkubator, placera chambered coverglass i adaptern, och hålla på plats med modellera. Lämna luckan på chambered coverglass så att cellkulturmedium inte torkar ut. Stäng locket och placera hela inkubatorn på mikroskop scenen, se till att inkubatorn hålls stadigt på plats.
- Använda metamorfa, inställningar för experimentet genom att välja "Apps / Multidimensional Förvärvet" i menyraden av programvaran. Detta kommer att ta upp ett fönster där du kan välja frekvens och längd timelapse, exponeringstid för varje färg (om att göra flera inställningar), antal och placering av scenen positioner, och antalet Z-profiler (om önskas). . Välj var du vill spara datafiler Tips: Om du använder annan programvara än metamorfa, kan funktionerna vara något annorlunda, men det övergripande konceptet är detsamma. Micromanager, ett open source ImageJ-baserade förvärvet programvara som är kompatibel med de flesta hårdvara uppställningar, är ett utmärkt alternativ.
- . Vid tillämpningen av detta protokoll, kommer vi att få bilder vid två våglängder (brightfield och mCherry) var 15 minuter för 8 timmar vid 15 stadium positioner Tips: Om bättre tidsupplösning önskas, kan du förkorta tidsintervallet mellan förvärv, men kan färre steg positioner användas, och därmed färre mitotiska celler kommer att vara tillgängliga för analys. Det är viktigt när man överväger tidsintervall att ta hänsyn till den tid som krävs för filtret hjulet för att växla mellan filter set.
- Bestäm optimal exponering tiden för varje våglängd genom att först fokusera på ett område av celler med hjälp av brightfield belysning. I programmet, justera autofokus fungerar bara för brightfield kanal (detta gör att programvaran till autofokus på varje stadium läge innan varje förvärv). Tips: Vi använder en 40x torr faskontrast mål att ge utmärkt upplösning utan behov av olja . Andra mål kan användas beroende på önskad optisk upplösning.
- Växla till mCherry våglängd och knäppa en bild med en 50 ms exponering. Justera exponeringen tid till det minimum som krävs för att se en bra bild. Det är viktigt att begränsa mängden ljus exponering för att garantera fortsatt cellviabiliteten. I regel kan detta bäst uppnås genom att använda ett filter med neutral densitet (för att minska flödet excitation ljus) och en längre kamera exponeringstid snarare än att öka belysningen styrka. Upprepa proceduren för varje ytterligare våglängder som ska användas. Tips: För att fastställa långsiktiga cellviabiliteten vid en viss exponering för experimentet kan du förhandsgranska det totala antalet bilder som en cell kan överleva över önskat timelapse genom att tillfälligt justera tidpunkterna avstånd från minuter till sekunder (dvs 10 min. blir 10 sekunder). Om dina celler överlever 100-200 exponeringar (ellerlämpligt antal), så din exponering är bra. Om inte, minska din excitation ljus, exponeringstid, eller det totala antalet bilder för att simulera hela din experimentet.
- Nästa, välj och markera ett lämpligt antal steg positioner så att du kan uppnå adekvat provtagning av cellen befolkningen. Metamorfa kommer att spela in positioner och kommer att återvända dit för varje förvärv. Tips: Jag brukar försöka hitta positioner där det finns gott om celler till bild, men inte så många att de är för tät. Dessutom är det viktigt att välja tillräckligt positioner så att du har en god chans att observera ett stort antal celler utvecklas genom mitos.
- När allt Timelapse, våglängd exponeringstid, och scenen positionsinformation har registrerats, välj "Förhandsgranska" knappen på skärmen för att avgöra om programvaran är att kontrollera utrustningen på rätt sätt.
- När du är nöjd, välj "Hämta"-knappen på skärmen för att börja förvärvet. Luta dig tillbaka och låta datorn och mikroskop för att göra jobbet. Tips: Observera automatisering genom minst en hel runda av förvärvet att säkerställa att allt fungerar som det ska.
Bildbehandling och analys
- Efter förvärvet är klar är nästa steg att överföra bilddata till en form som är lättare att hantera. Vid tillämpningen av detta protokoll kommer jag dessförinnan styrka hur man skapar filmer med hjälp av metamorfa, sedan hur man skapar bilden montage med ImageJ programmet. Antingen format kommer att användas för kvantifiering ändamål.
- Det första steget är att granska uppgifterna. För att göra det, välj "apps / Granska flerdimensionella data" i menyraden. Välja plats för dina filer, välj sedan "Visa". Detta kommer att låta dig granska bunten med bilder från varje stadium plats individuellt. Välj önskad scenen läge, sedan "Load Images". Du kommer att kunna avancera genom de data bildruta för bildruta.
- För dem stadium positioner i vilka celler som går igenom mitos (som bestäms av både DNA och cellulära morfologi), kan du göra filmer och montage med hjälp av metamorfa, eller med andra program som ImageJ (tillgängliga gratis via NIH).
- För att göra en film i metamorfa, välj "Process / Spara film" i menyraden. Du kommer att kunna välja vilka bilder som ska användas, hastighet och filtyp av filmen. Välj sedan "Spara film".
- För att göra ett montage, sparar jag bilden stacken som en. Stk fil, som kan användas i andra program som ImageJ.
- Öppna filen i ImageJ och främja ramar tills du hittar en cell går igenom mitos. . Beskär området runt cellen och välj "Bild / Duplicera" Tips: Se till att kopiera alla ramar.
- För att göra ett montage, välj "Bild / Stacks / Gör Montage" i menyraden. Här kan du ange vilka bildrutor du vill inkludera, storlek och form av montage, och om du vill gränserna mellan ramarna. Välj dessa och tryck "Okej". .. Spara montage som en tif-fil och göra någon vidare bearbetning i antingen ImageJ eller Adobe Photoshop Tips: Ändra montage filer från 16-bitars format som används av metamorfa till 8-bitars format för enklare bildbehandling.
- För att beräkna tiden i olika stadier av mitos, bestämma t = 0 (första tecknet på DNA kondens eller cell avrundning), räkna antalet bilder tills kromosomer är justerade vid ekvatorn (tid i profas / prometaphase), ramar tills kromosomer börja segregera (tid i metafas), och ramar tills cellerna börjar platta (anafas / telofas / cytokines). Den beräknade tiden i varje mitotiska steg beror på tidsintervallet mellan varje bild.
Representativa resultat
Figur 1 visar resultaten från en typisk kontroll siRNA transfektion experiment med en HeLa cellinje som uttrycker histon H2B-mCherry. Denna metod för har använts på ett effektivt sätt att kvantifiera mitotiska timing, avslöjar en oväntad roll för nucleoporin Nup153 i tidsplanen för sent mitos 1. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Discussion
Med senaste framstegen inom bildbehandling och fluorescerande proteinet teknik har Bildproduktion blivit en rutinmässig del av cellulär analys 2. En mängd olika GFP (och andra färgvarianter 3)-märkta proteiner är allmänt tillgängliga eller relativt lätt att bygga och kan användas för att spåra ett antal kännetecken celldelning inklusive DNA / kromosom dynamik 4, 5, centrosome dubbelarbete 6, cyklin B dynamik 7, kärnhöljet uppdelning och ihopsättning 8, 9, mitotiska spindeln bildning 10, och olika stadier av cytokines 11. Taggade proteiner kan användas ensamt eller i kombination när excitation / emission spektra av fluorescerande taggar är kompatibla, vilket gör att samordningen mellan specifika händelser som ska bedömas. Om större rumsliga och / eller tidsmässig är / önskas, fortsätter konfokalmikroskopiska om laserscanning, spinning disk eller resonans skanning kan användas, och listan över sofistikerade mikroskopi alternativ med allt större upplösning att växa. Live avbildning av mitosen i däggdjursceller har också anpassats för användning i high-throughput RNAi och små skärmar molekyl 12-14. Således, medan en s första försök med denna teknik kan vara förhållandevis enkla, möjligheterna att bygga vidare på denna strategi är omfattande.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), National Institutes of Health (R01 GM61275 och P30 CA042014), den leukemi och lymfom samhället, och Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
