Summary
Aquí se describe un protocolo básico de la imagen y cuantificar el tiempo mitótico de las células de mamíferos viven de cultivo de tejidos después de la transfección de siRNA.
Abstract
Cambios en la organización celular y la dinámica de los cromosomas que ocurren durante la mitosis están estrechamente coordinadas para garantizar la herencia exacta del contenido genómico y celular. Hallmark eventos de la mitosis, como el movimiento de los cromosomas, pueden ser fácilmente seguidos en forma de células individuales con time-lapse microscopía de fluorescencia de las líneas de células de mamíferos que expresen proteínas GFP-etiquetados. En combinación con RNAi basado en el agotamiento, esto puede ser un poderoso método para localizar la etapa (s) de la mitosis, donde los defectos se producen después de los niveles de una proteína en particular se han reducido. En este protocolo, se presenta un método básico para evaluar el efecto del agotamiento de una proteína de regulación potencial mitótico en el momento de la mitosis. Las células son transfectadas con siRNA, colocado en una cámara de incubación etapa superior, y la imagen usando un microscopio de fluorescencia automatizado. Se describe cómo utilizar el software para crear una experiencia de lapso de tiempo, la forma de procesar las secuencias de imágenes para que sea imagen fija o montajes de películas, y la forma de cuantificar y analizar el calendario de las etapas de mitosis con una línea celular que expresa mCherry- etiquetados histona H2B. Finalmente, se discuten aspectos importantes para el diseño de un experimento de time-lapse. Esta estrategia se complementa con otros enfoques y ofrece las ventajas de 1) la sensibilidad a los cambios en la cinética de que no pueda ser observado cuando se mira en las células como la población y el análisis de 2) de la mitosis sin la necesidad de sincronizar el ciclo celular utilizando tratamientos farmacológicos. La información visual de los experimentos de imagen, no sólo se permite la sub-etapas de la mitosis a ser evaluados, pero también puede dar una idea inesperada que no se desprende del análisis del ciclo celular por FACS.
Protocol
siRNA transfección y la preparación de células
- Prepare un 4-así Labtek II cubre objetos de cámara mediante la adición de 0,5 ml de fibronectina (10μg/mL) a cada pozo que se utilizará. Incubar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
- Prepare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) de los complejos de transfección invertir de acuerdo a las instrucciones del fabricante s. Use la cantidad recomendada para un bien de un plato de 24 pozos en cada cámara para ser utilizado (100μL total). Un producto análogo / protocolo de transfección de siRNA puede ser sustituido.
- Retire la fibronectina de los pozos de la cámara cubre objetos. Añadir 100μL de siRNA / Lipofectamine complejos RNAiMAX a cada uno, así que se utilizará.
- Alícuota de 20.000 histona H2B-mCherry células que expresan (en 500μL) por pocillo que contiene la mezcla de transfección.
- Permitir que las células se incuba durante ~ 24 horas antes de volver a la mezcla de transfección con 1 ml de medio de cultivo celular normal.
- Incubar las células de un adicional de 24 horas antes de la adquisición de la imagen (48 horas después de la transfección).
Microscopio de instalación y adquisición de imágenes
- Hay tres partes principales en la configuración de la adquisición de imágenes: 1) una célula de la incubadora que cabe en la platina del microscopio y mantiene un ambiente húmedo constante de 37 º C y 5% de CO 2, 2) un microscopio invertido equipado con una etapa automática, persianas automatizadas de fluorescencia y campo claro, y las ruedas de filtros automáticos, y 3) un paquete de software que integra y controla la etapa, persianas, y las ruedas de filtros. En nuestra configuración de imagen, se utiliza una medida de células incubadora de OKO de laboratorio que se pueden utilizar con la cámara Labtek II cubre objetos. La etapa, persianas, y las ruedas de filtros son controlados por el software Metamorph Sugerencia:. El Laboratorio de OKO etapa superior del sistema incubadora incluye adaptadores para una variedad de diferentes placas, plato, o el tamaño de cubreobjetos.
- La posición de la cámara Labtek II cubre objetos en la incubadora por la apertura de la tapa de la pre-calentado y equilibrado incubadora, colocar el cubre cámara en el adaptador, y manteniendo en su lugar con plastilina. Deje la tapa de la cámara cubre objetos para que el medio de cultivo celular no se seque. Cierre la tapa y la posición de la totalidad de la incubadora en la platina del microscopio, lo que garantiza que la incubadora se mantiene firmemente en su lugar.
- Utilizando Metamorph, configurar la prueba mediante la opción "Aplicaciones / Adquisición multidimensionales" en la barra de menús del software. Con ello se abre una ventana en la que puede seleccionar la frecuencia y duración de la intervalo, el tiempo de exposición para cada color (si se hacen ajustes múltiples), el número y ubicación de las posiciones de la etapa, y el número de z-secciones (si ) deseado. . Seleccionar dónde guardar los archivos de datos Sugerencia: Si se utiliza otro software de Metamorph, las funciones pueden variar ligeramente, pero el concepto general es el mismo. Micromanager, una fuente abierta ImageJ software basado en la adquisición, que es compatible con la mayoría de configuraciones de hardware, es una excelente alternativa.
- . A los efectos de este protocolo, vamos a adquirir imágenes en dos longitudes de onda (claro y mCherry) cada 15 minutos durante 8 horas a 15 posiciones de escena Sugerencia: Si mejor el tiempo de resolución es deseado, entonces se puede acortar el intervalo de tiempo entre la adquisición, sin embargo , menos puestos de fase se puede utilizar, y por lo tanto menor cantidad de células mitóticas estará disponible para su análisis. Es importante cuando se consideran los intervalos de tiempo para tener en cuenta el tiempo necesario para que la rueda de filtros para cambiar entre los conjuntos de filtros.
- Determinar el tiempo de exposición óptimo para cada longitud de onda, en primer lugar se centra en un campo de las células utilizando iluminación campo claro. En el software, ajustar la función de enfoque automático sólo para el canal de campo claro (esto permitirá que el software para el enfoque automático en cada posición antes de cada etapa de la adquisición) Sugerencia:. Utilizamos un 40x seco de contraste de fase objetivo de dar una excelente resolución, sin necesidad de aceite . Otros objetivos pueden ser utilizados en función de la resolución óptica deseada.
- Cambiar a la longitud de onda mCherry y complemento de una imagen mediante una exposición de 50 ms. Ajustar el tiempo de exposición al mínimo necesario para ver una buena imagen. Es esencial para limitar la cantidad de exposición a la luz para asegurar la viabilidad celular sostenido. Como regla general, esto puede lograrse mejor mediante el uso de un filtro de densidad neutral (para reducir el flujo de luz de excitación) y un tiempo de exposición de la cámara ya no por el aumento de la fuerza de la iluminación. Repita este procedimiento para cualquier longitud de onda adicional que se utilizará Sugerencia:. Para determinar la viabilidad a largo plazo de células en una exposición dada por su experiencia, usted puede ver el número total de imágenes que una célula pueda sobrevivir en el timelapse deseado mediante una adaptación provisional de la separación punto de tiempo de minutos a segundos (es decir, 10 min. se convierte en 10 segundos). Si las células sobrevivir 100-200 exposures (o el número apropiado), entonces la exposición está muy bien. Si no es así, reducir su luz de excitación, el tiempo de exposición, o el número total de imágenes para simular el experimento completo.
- A continuación, seleccionar y marcar un número adecuado de puestos de fase de modo que usted pueda lograr un muestreo adecuado de la población de células. Metamorph registrará las posiciones y volverá allí para cada adquisición Sugerencia:. Yo generalmente tratar de encontrar posiciones en las que hay un montón de células de la imagen, pero no tantos que son demasiado densos. Además, es importante seleccionar posiciones lo suficiente para que usted tendrá una buena oportunidad de observar un gran número de células progresando a través de la mitosis.
- Después de todo intervalo, el tiempo de exposición de longitud de onda, y la posición de la etapa se han registrado, seleccione el botón "Preview" en la pantalla para determinar si el software está controlando el equipo adecuado.
- Una vez que esté satisfecho, seleccione la opción "Adquirir" botón en la pantalla para comenzar la adquisición. A continuación, sentarse y dejar el ordenador y el microscopio para hacer el trabajo Sugerencia:. Observar la automatización a través de al menos una ronda completa de adquisición para asegurarse de que todo funciona correctamente.
Procesamiento de imágenes y análisis
- Después de la adquisición ha terminado, el siguiente paso es transferir los datos de imagen en una forma que es más fácil de manejar. A los efectos de este protocolo, primero voy a demostrar cómo generar películas con Metamorph, entonces cómo generar montajes de imágenes utilizando el programa ImageJ. Ya sea en formato será útil para propósitos de cuantificación.
- El primer paso es revisar los datos. Para ello, seleccione "Aplicaciones / Revisión de datos multidimensionales" en la barra de menú. Seleccione la ubicación de sus archivos, a continuación, seleccione "Ver". Esto le permitirá revisar la pila de imágenes de cada posición de la etapa de forma individual. Seleccione la posición de la etapa deseada, y luego "Cargar imágenes". Usted será capaz de avanzar a través de los datos de cuadro por cuadro.
- Para los puestos de fase en la que las células pasan por mitosis (según lo determinado por el ADN y la morfología celular), puede hacer que las películas y montajes utilizando Metamorph, o con otros programas como ImageJ (disponible de forma gratuita a través de los NIH).
- Para hacer una película en Metamorph, seleccione "Proceso / Guardar película" en la barra de menú. Usted será capaz de seleccionar los cuadros de uso, velocidad y tipo de archivo de la película. A continuación, seleccione "Guardar película".
- Para hacer un montaje, ahorro de la pila de la imagen como un archivo. STK, que puede ser utilizado en otros programas como ImageJ.
- Abra el archivo en ImageJ y avanzar en los marcos hasta que encuentre una célula pasa por mitosis. . Recortar el área alrededor de la celda y seleccione "Imagen / Duplicar" Sugerencia: Asegúrese de que duplicar todos los fotogramas.
- Para hacer un montaje, seleccione "Imagen / pilas / Hacer montaje" en la barra de menú. Aquí puede especificar los fotogramas que desee incluir, el tamaño y la forma del montaje, y si desea que las fronteras entre los cuadros. Seleccione estas y pulse "Aceptar". .. Guarde el montaje como un archivo tif y no cualquier otro tratamiento o ImageJ o Adobe Photoshop Consejo: cambia los archivos de montaje desde el formato de 16-bit utilizada por Metamorph en formato de 8-bits de procesamiento de imágenes más fácil.
- Para calcular el tiempo en las diferentes fases de la mitosis, determinar t = 0 (primer signo de la condensación del ADN o el redondeo de células), cuente el número de fotogramas hasta que los cromosomas se alinean en el ecuador (el tiempo en la profase / prometafase), marcos hasta que los cromosomas comienzan a segregar (tiempo en la metafase), y los marcos hasta que las células comienzan a aplanarse (anafase / telofase / citocinesis). El tiempo calculado en cada etapa de mitosis depende del intervalo de tiempo entre cada fotograma.
Resultados representante
La Figura 1 ilustra los resultados de un experimento de transfección de control típico de siRNA utilizando una línea celular HeLa que expresan la histona H2B-mCherry. Este método ha sido utilizado de manera efectiva para cuantificar el tiempo mitótico, revelando un inesperado papel para el nucleoporin Nup153 en el momento de finales de la mitosis 1.
Discussion
Con los últimos avances en imagen y tecnología de la proteína fluorescente, imágenes en vivo se ha convertido en un aspecto rutinario de análisis celular 2. Una variedad de buenas prácticas agrarias (y otras variantes de color 3)-etiquetados proteínas están ampliamente disponibles y relativamente fácil de construir y se puede utilizar para rastrear una serie de características, incluyendo la dinámica de división celular del ADN / cromosoma 4, 5, 6 centrosoma la duplicación, la dinámica de la ciclina B 7, desglose envoltura nuclear y 8 de montaje, 9, 10 la formación del huso mitótico, y las distintas etapas de la citocinesis 11. Proteínas etiquetadas se pueden utilizar solos o en combinación, cuando los espectros de excitación / emisión de etiquetas fluorescentes son compatibles, lo que permite la coordinación entre los eventos específicos que deben evaluarse. Si mayor resolución espacial y / o temporal es / son deseados, la microscopía confocal de barrido láser de exploración si, disco giratorio, o la resonancia se puede utilizar, y la lista de opciones sofisticadas de microscopía cada vez con mayor resolución sigue creciendo. Imágenes en vivo de la mitosis en células de mamíferos también ha sido adaptado para su uso en alto rendimiento y pantallas de RNAi pequeña molécula 12-14. Así, mientras que los experimentos iniciales s un uso de esta técnica puede ser relativamente simple, las posibilidades de construir en esta estrategia son extensos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Americana del Cáncer (PF-07-103-01-CSM), los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM61275 y CA042014 P30), la Sociedad de Leucemia y Linfoma, y la Fundación de Cáncer Huntsman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
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