Summary
İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.
Abstract
Genomik ve hücresel içeriği doğru miras sağlamak için hücresel organizasyonu ve mitoz sırasında oluşan kromozom dinamikleri değişiklikler sıkıca koordine edilmektedir. Hallmark mitoz kromozom hareketi gibi olaylar, GFP etiketli özel proteinleri ifade memeli hücre hatlarının zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak bireysel bir hücre bazında kolayca takip edilebilir. RNAi tabanlı tükenmesi ile birlikte, bu belirli bir protein düzeyi düşürüldü sonra kusurları meydana gelen mitoz aşamasında saptayarak (ler) için güçlü bir yöntem olabilir. Bu protokol, mitoz zamanlaması üzerinde potansiyel bir mitotik düzenleyici protein tüketen etkisini değerlendirmek için basit bir yöntem mevcut. Hücreler, siRNA transfekte bir sahne üstü kuluçka odasına yerleştirilen ve otomatik bir floresan mikroskop kullanarak görüntülü. Biz nasıl hareketsiz görüntü montajı ya da film ya da yapmak için görüntüyü dizileri işlemek için zaman atlamalı bir deney, yazılımı kurmak için nasıl kullanılacağını tanımlamak, ölçmek ve ifade eden bir hücre hattı kullanarak mitotik aşamaları zamanlama nasıl analiz mCherry histon H2B etiketli. Sonuç olarak, zaman atlamalı bir deney tasarımı için önemli noktalar tartışacağız. Bu strateji, diğer yaklaşımlar tamamlayıcı ve hücre döngüsü, ilaç tedavileri ile senkronize etmek için gerek kalmadan bir nüfus ve mitoz 2) analizi gibi hücre bakarken gözlenen olmayabilir kinetiği) hassasiyeti 1 avantajlar sunuyor. Gibi görüntüleme deneylerinden elde edilen görsel bilgi sadece mitoz alt aşamalarda değerlendirilebilir sağlar, ama aynı zamanda FACS hücre döngüsü analizi ortaya olmazdı beklenmedik içgörü sağlayabilir.
Protocol
siRNA transfeksiyon ve hücre hazırlama
- 4-iyi LABTEK II odacıklı coverglass fibronektin (10μg/mL) kullanılacak her bir kuyunun 0.5mL ekleyerek hazırlayın. 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarına göre ters transfeksiyon siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) kompleksleri hazırlayın. (100μL toplam) kullanılmak üzere odasına başına 24-iyi bir yemeğin iyi biri için önerilen miktarda kullanın. SiRNA transfeksiyon için benzer bir ürün / protokol ikame edilebilir.
- Odacıklı coverglass kuyulardan fibronektin çıkarın. SiRNA / Lipofectamine RNAiMAX kompleksleri olacak her kuyuya 100μL ekleyin.
- Kısım 20.000 histon H2B mCherry-ifade transfeksiyon karışımı içeren başına hücreleri (500μL).
- Hücrelerin normal hücre kültür ortamı 1mL transfeksiyon karışımı değiştirmeden önce ~ 24 saat süreyle inkübe için izin verin.
- Görüntü elde etme önce inkübe hücreler ilave bir 24 saat (48 saat sonrası transfeksiyon).
Mikroskop kurulum ve görüntü alımı
- Görüntü elde etme kurulumu için üç ana bölümü vardır: 1) mikroskop sahnede oturuyor ve 37 sabit bir nemli ortamlarda muhafaza hücre inkübatör ° C ve% 5 CO 2; 2) otomatik bir sahne ile donatılmış bir inverted mikroskop, floresans ve aydınlık otomatik kepenkler ve otomatik filtre jantlar ve 3) bir yazılım aşamasında entegre ve kontrol paketi, panjurlar, ve filtre tekerlekler. Görüntüleme kurulumda, LABTEK II odacıklı coverglass kullanılabilir OKO Lab özelleştirilmiş bir hücre inkübatör kullanın. Sahne, panjurlar, ve filtre çarklarını Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir İpucu: OKO Lab sahne top inkübatör sistemi farklı tabak, çanak, veya lamel boyutları çeşitli adaptörler içerir.
- Inkübatör, önceden ısıtılmış ve dengelenir kuluçka kapak açma, adaptör odacıklı coverglass yerleştirerek ve modelleme kil ile yer tutan LABTEK II odacıklı coverglass Pozisyonu. Hücre kültürü orta kurumasına olacağını odacıklı coverglass kapağı bırakın. Kapağını kapatın ve yerinde inkübatör sıkıca tutulur sağlanması, mikroskop sahnede tüm inkübatör pozisyon.
- Metamorph kullanarak, yazılım menü çubuğunda "Apps / çok boyutlu Toplama" seçerek deney kurdu. Bu, timelapse sıklığını ve uzunluğunu seçebileceğiniz bir pencere açılacaktır, her renk için, pozlama süresi (eğer birden fazla ayar yapıyor), sayısı ve konumu sahne pozisyonları ve z bölümlerin sayısı (eğer arzulanan). Veri dosyaları nereye kaydedeceğinizi seçin İpucu: Eğer Metamorph başka yazılımı kullanarak, işlevleri biraz farklı olabilir, ama genel bir kavram aynıdır . Micromanager, çoğu donanım kurulumları ile uyumlu bir açık kaynak ImageJ tabanlı satın alma yazılımı, mükemmel bir alternatif.
- Bu protokolün amaçları için, biz iki dalga boylarında (aydınlık ve mCherry) 15 sahne pozisyonları İpucu az 8 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü kazanacaklardır: daha iyi bir zaman çözünürlük istenirse, daha sonra satın almalar arasındaki zaman aralığını kısaltabilir, ancak , sahne pozisyonları daha az kullanılır ve böylece daha az mitotik hücrelerin analiz için uygun olacaktır. Zaman aralıklarında filtre setleri arasında geçiş yapmak için filtre tekerleği için gerekli olan süre dikkate almak dikkate alındığında önemlidir.
- Ilk hücreleri aydınlık aydınlatma kullanarak bir alanda odaklanarak her dalga boyu için en uygun pozlama süresi belirleyin. Yazılım, sadece aydınlık kanal (bu her ediniminden önce her aşamasında pozisyon için yazılım otofokus izin verecek) İpucu otofokus fonksiyonu ayarlayın: Biz petrol gerek kalmadan mükemmel çözünürlük vermek için 40x kuru faz-kontrast objektif . Diğer hedefler istenilen optik çözünürlüğe bağlı olarak kullanılıyor olabilir.
- MCherry dalga boyuna geçin ve 50 milisaniye maruz kullanarak bir görüntü ek bileşenini. Maruz kalma süresi, iyi bir görüntü görmek için gerekli minimum ayarlayın. Sürekli hücre canlılığı sağlamak için ışığa maruz kalma miktarı sınırlamak için esastır. Genel bir kural olarak, bu en iyi aydınlatma gücünü artırarak yerine nötral yoğunluk filtresi (ikaz ışık akısı azaltmak için) ve daha uzun bir kamera maruz kalma süresi ile elde edilebilir. Kullanılmak üzere herhangi bir ek dalga boyları için bu yordamı yineleyin İpucu: Denemeniz için belli bir maruz kalma, uzun süreli hücre canlılığını belirlemek için, geçici olarak timepoint boşluk ayarlayarak istenilen timelapse üzerinde bir hücrenin hayatta resimlerin toplam sayısı önizleme. saniyeye kadar dakika (yani, 10 dakika 10 saniye olur). Hücreleri 100-200 maruz kalma (ya da hayattauygun sayıda), daha sonra pozlama. Aksi takdirde, uyarma ışık, maruz kalma süresi, ya da tam deneyi simüle etmek için resimlerin toplam sayısını azaltır.
- Sonraki seçin ve uygun sayıda hücre popülasyonu yeterli örnekleme ulaşmak böylece bir sahne pozisyonları işareti. Metamorph pozisyonlar kaydetmek ve her elde etmek için orada dönecektir İpucu: Ben genellikle bol hücre görüntü var olan konumlarını bulmak için çok yoğun olduğu pek çok deneyin değil. Ayrıca, hücrelerin mitoz yoluyla ilerleyen çok sayıda gözlemleyerek iyi bir şans olacak, böylece yeterli pozisyonları seçmek için önemlidir.
- Tüm timelapse, dalga boyu maruz kalma süresi ve sahne konum bilgisi kaydedildikten sonra, yazılımın uygun ekipman kontrolü olup olmadığını belirlemek için ekrandaki "Önizleme" butonunu seçin.
- Gibiyse, satın alma başlamak için ekranda "Acquire" düğmesini seçin. Sonra arkanıza yaslanın ve işi yapmak için bilgisayar ve mikroskop izin İpucu: her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için en az bir tam tur satın alma yoluyla otomasyon dikkat edin.
Görüntü işleme ve analiz
- Satın alma işlemi tamamlandıktan sonra, bir sonraki adım, görüntü veri aktarmak için kolay bir forma. Bu protokolün amaçları için, ben sonra ImageJ programı kullanarak görüntü montajı nasıl oluşturmak için, sinema Metamorph kullanarak nasıl oluşturmak için ilk olarak gösterecektir. Her iki formatı kantifikasyon amaçlar için faydalı olacaktır.
- Verileri gözden geçirmek için ilk adımı. Bunu yapmak için, menü çubuğunda "Apps / İnceleme çok boyutlu Data" seçeneğini seçin. Dosyalarınızı konumu seçin, daha sonra "Görünüm" seçin. Bu görüntülerin yığınını tek tek her aşamasında pozisyonunu gözden geçirmek için izin verecektir. Istenilen sahne konumu seçin, daha sonra "Görüntüler Load". Veri kare kare ilerlemek mümkün olacaktır.
- Hücreleri mitoz (as hem de DNA ve hücresel morfoloji tarafından belirlenir) geçmesi, bu aşamada pozisyonlar için, sinema ve montajı Metamorph kullanarak yapmak veya ImageJ (NIH üzerinden ücretsiz kullanılabilir) gibi diğer programlar ile yapabilirsiniz.
- Metamorph bir film yapmak için, "Süreç / film kaydet" seçeneğini menü çubuğu. Kullanmak üzere kare, hız ve film dosya türünü seçmek mümkün olacak. Daha sonra "Kaydet Movie" seçeneğini seçin.
- Bir montaj yapmak için, ben, ImageJ gibi diğer programlar kullanılabilir. Stk dosyası olarak resim yığını.
- ImageJ dosyayı açın ve mitoz geçiyor bir hücre bulana kadar kare ilerlemek. Bitkisel ve hücre çevresindeki alan "Resim / Duplicate" seçeneğini seçin İpucu: tüm kareleri çoğaltmak için emin olun.
- Bir montaj yapmak için, "Görüntü / Bacalar / Montaj yapma" seçin menü çubuğunda. Burada montaj boyutu ve şekli dahil etmek istediğiniz kareleri belirtmek ve çerçeveleri arasındaki sınırları isteyip istemediğiniz. Bu seçin ve "Tamam" tuşuna basın. İpucu:. Montaj tif dosyası olarak kaydedin ve ImageJ veya Adobe Photoshop ya da başka bir işlem yapmak daha kolay görüntü işleme için 8-bit formatına Metamorph tarafından kullanılan 16-bit formatında montaj dosyaları değiştirin .
- Mitoz farklı aşamalarında zamanını hesaplamak için, kromozomların ekvator (zaman profaz / prometafaz), çerçeveler hizalanır kadar kromozom tefrikine başlayana kadar t = 0 (DNA yoğuşma veya hücre yuvarlama ilk işareti), kare sayısını belirlemek (metafaz zaman), ve çerçeveler hücreleri (anafaz / telofaz / sitokinez) düzleştirmek için başlayana kadar. Her mitoz aşamasında hesaplanan zaman her kare arasındaki zaman aralığını bağlıdır.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 tipik bir kontrol siRNA transfeksiyon deneyi histon H2B mCherry ifade HeLa hücre satırını kullanarak elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu yöntem, mitotik zamanlama geç mitoz 1 zamanlaması nucleoporin Nup153 için beklenmedik bir rol açığa ölçmek için etkin olmuştur. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Discussion
Görüntüleme ve floresan protein teknolojisi son gelişmeler, canlı görüntüleme 2 hücresel analizi rutin bir özelliği haline gelmiştir. GFP, çeşitli (ve diğer renk çeşitleri 3) etiketli proteinlerin yaygın olarak kullanılabilir ya da inşa etmek nispeten kolay ve hücre bölünmesi işaretlerinden DNA / kromozom dinamikleri 4, 5, centrosome çoğaltılması 6, siklin B dinamikleri de dahil olmak üzere bir dizi izlemek için kullanılan olabilir 7, nükleer zarf arıza ve montajı 8, 9, mitotik iğsi oluşumu 10, ve 11 sitokinez çeşitli aşamalarında. Floresan etiketleri uyarma / emisyon spektrumları uyumlu Takip edilen proteinler, belirli olaylar arasında koordinasyon değerlendirilmelidir sağlayan tek başına veya birlikte olabilir. Büyük, mekansal ve / veya zamansal çözünürlük / istenirse, konfokal mikroskobu, lazer tarama, dönen disk, ya da rezonans tarama kullanılabilir olup olmadığını ve giderek artan çözünürlük ile gelişmiş mikroskopi seçenekleri listesi büyümeye devam ediyor. Memeli hücrelerinde mitoz Canlı görüntüleme de yüksek verimli RNAi ve küçük molekül ekranları 12-14 kullanım için adapte edilmiştir. Böylece, bu tekniği kullanarak ilk deneyler, nispeten basit olabilir iken, bu strateji üzerine inşa olanakları geniştir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği (PF-07-103-01-CSM), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM61275 ve P30 CA042014), Lösemi ve Lenfoma Derneği ve Huntsman Kanser Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
