Biology

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

חלקים פלסטיק לשמור מורפולוגיה רקמות נכון בסעיפים דקה של רקמה שניתן immunostained עם נוגדנים משני פלורסנט, מה שהופך שיטה זו יעילה יותר מאשר חלקים פרפין, מוטבע או קפואים עבור סוגים רבים של רקמות. השיטה עבור מכתים, הטבעה פלסטיק, חתך מודגם וידאו.

Protocol

קיבוע

העברת עוברים כולו או explants גזור לתוך MEMFA או 3.7% FA + PBS ב בקבוקון scintillation (חתול פישר # 03-339-25B). לדגור על בקבוקון nutator ב RT, רק 2 שעות, ולא יותר מזה. אין להשאיר את העובר ב-FA במשך יותר מ 2 שעות. הדגירה כבר FA יהפכו את הרקמה העוברית קשה לגרום חדירה עני של נוגדנים בתהליך זיהוי.
ישאפו רוב FA ולהוסיף מקבע של דנט עד העליון של הבקבוקון (~ 4.5ml). בעדינות להפוך את הבקבוקון עבור כמה פעמים כדי לשטוף את העוברים של דנט, חילופי עם 4.5ml אחר טריים של דנט, ו דגירה אותו -20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפחות. לילה זה לא מספיק. צעד זה הופך את העוברים חדיר יותר הנוגדן. העוברים יכולים להישמר במצב זה למשך מספר שבועות.

Immunofluorescence

רעננותם את הדגימה. דגירה זה בסדרה מדורגת של מתנול, כדלקמן:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
בצע 1.5% agarose / PBS צלחות עם מנות פלסטיק 60mm. יוצקים PBS על גבי agarose אחרי זה הפך להיות מוצק.
חמי, חתך של העוברים: שים את העוברים בתוך צלחת agarose / PBS 1.5%. גזל עובר עם זוג מלקחיים ולחתוך אותה לשניים דרך מרכז של העובר באמצעות סכין גילוח דק. בחר את אלה שיש לך לחתוך בהצלחה עם מטוס חיתוך ישר במחצית.
העברת עוברים נחצה לתוך בקבוקון זכוכית עם הנצנץ PBT. Exchange עם 4.5ml של עז 20% נסיוב + PBT. לדגור על RT עבור 2 שעות על nutator (חסימה).
הכן דילול המתאים הנוגדן העיקרי PBT. 0.5ml זה דגימות לכל צורך. למשל, השתמשתי 1 / 200 דילול PAB ארנב נגד C-cadherin ללמוד את לוקליזציה subcellular של C-cadherin בסעיפים פלסטיק 5mm.
לשאוב את הפתרון חוסם ולהוסיף 0.5ml של הנוגדן העיקרי בדילול מלא. שימו את צלוחיות בעמדה בעמידה על בעל צינורית קלקר. דגירה לילה ב-C º 4 על nutator.
הסר את הנוגדן העיקרי מדולל (זה נוגדן ראשוני המדולל ניתן לשמור ולעשות בהם שימוש חוזר ב 1-2 השבועות הקרובים). לשטוף עם 4.5ml של PBT במשך 4 פעמים (40-60 דקות כל אחד) ב RT.
Exchange עם 0.5ml של דילול 1 / 100 של נוגדן ביוטין, מצומדות משני PBT. דגירה לילה ב-C º 4 על nutator. מכסים את צלוחיות עם נייר אלומיניום כדי להגן על ביוטין מן האור.
מנקודה זו, יש להקפיד להגן על מדגם של אור כלומר, לשמור על צלוחיות מתחת לכיסוי חלק או רדיד אלומיניום.
הסר את הנוגדן ביוטין, משני (זה ניתן לעשות שימוש חוזר גם את 1-2 השבועות הקרובים). לשטוף עם או 4.5ml של PBT במשך 4 פעמים (40-60 דקות כל אחד) ב RT.
Exchange עם 0.5ml של דילול 1 / 200 של fluorescently שכותרתו (FITC, טקסס אדום וכו ') streptavidin ב PBT. דגירה לילה ב-C º 4 על nutator.
הסר את streptavidin (זה ניתן לעשות שימוש חוזר, מדי). לשטוף עם 4.5ml של PBT במשך 3 פעמים (15 - 30 דקות כל אחת) ב RT.
תקן את העוברים 4.5ml של 3.7% FA + PBS במשך 30 דקות ב RT.
לשטוף עם 4.5ml של PBS פעמיים.
ליבש את הדגימה. דגירה זה בסדרה מדורגת של אתנול, כדלקמן:

30% EtOH / H ₂ O 10 דקות
50% EtOH / H ₂ O 10 דקות
75% EtOH / H ₂ O 10 דקות
100% EtOH 10 דקות
הדגימה ניתן לאחסן 100% EtOH ב-C º 4 עם כיסוי כדי להגן עליו מפני האור.

הסתננות

הפוך את Technovit 7100 לערבב הסתננות. אני בדרך כלל לוקח 15 מ"ל של הנוזל בצינור 50 מ"ל בסיס חרוטי, להוסיף 150 מ"ג של hardener אני ומערבבים אותו מתנדנד על nutator במשך 15 דקות. תערובת זו חדירה יכולים להישמר על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.
חדור את הדגימה עם תערובת חדירת ידי החלפת עם סדרה מדורגת משולבת של חדירה Technovit לערבב / EtOH, כדלקמן:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 שעה
2. 100 Technovit% - 1 שעה
3. 100 Technovit% - לילה
Specimen ניתן לאחסן תערובת חדירה של 100% לתקופה של עד חודש אחד בכל 4 º C. לשים כיסוי על דגימות כדי להגן עליהם מפני האור.

הטבעת

הפוך את Technovit 7100 לערבב הטבעה: קח 0.75ml של תמהיל חדירה בצינור 1.5ml ולהוסיף 50 מ"ל של hardener השנייה. מערבבים אותו פעמים את הצינור היפוך מספר.
בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, לקחת אחד הדגימה הסתננו לתוך הלילה 0.5ml צינור דק PCR הקיר. הסר את רוב supernatant.
הוסף 0.25ml של תמהיל הטבעה עשה צעד # 1 של סעיף זה, "הטבעת", כדי הדגימה. המזרח העובר נחצה להפוך את המטוס לנתיחה מול אל החלק התחתון של הצינור, על ידי נגעה בעדינות עם מחט עמום בקצה דיסקציה (עץ מחט לטפל דיסקציה).
סגור את הפקק דגירה הצינור במקום חשוך במשך כארבע שעות, כדי לאפשר הפלסטיק לפלמר.
הפוך את Technovit 3040 ומערבבים. קח 1 גרם של אבקת לצלחת במשקל, ולהוסיף 0.5ml של הנוזל. מיד לערבב אבקת נוזלי באמצעות bluetip. יוצקים על גבי spacimen מוקשה. זה Technovit הצהוב 3040 ימנע את גוש פלסטיק שלם יוצא מן הצינור.

חתך

נגב Histoknife H עם קסילן (EtOH הוא לעתים קרובות לא מספיק טוב) והעמיד אותו על microtome שלך. זווית הלהב על כ 45 °. נגב את אזור הבמה מול הלהב עם קסילן, גם בגלל הניקיון של אזור זה הוא קריטי לאיכות פרוסות מחולק.
חותכים את הצד של הצינור לקלף את קצה באמצעות סכין קרטון.
הגדר את הדגימה לתוך מחזיק צ'אק של microtome.
צרף "הקש אל חותם" מבדד סיליקון על זכוכית שקופית כדי ליצור תא גובר על סעיף פרוסות. היטב בעיתונות מבודדת לשקופית על benchtop נקי להסתכל מהצד השני כדי לוודא כי מבודדת מחוברת לחלוטין, ללא בועות אוויר. יוצקים נקי וחמים DH ₂ O (~ 40 ° C) לבריכה בשקופית באמצעות פיפטה פסטר, עד לרמה שבה ניתן לראות כי פני המים הופך שטוח, לא קעורה או קמורה בצורת.
התחל לעשות פרוסות סעיף. עבור מחקרים immunofluorescence, אני עושה 5 סעיף פרוסות מ"מ. עבור בדגימות הכלאה באתרו, עובי הפרוסות ניתן להתאים בטווח של ~ 3-8 מ"מ, בהתאם למטרת ואת עוצמות של אותות.
קח את פרוסות סעיף משלב מול להב לחדר גובר עם מים, באמצעות מכחול קטנות. החזק את המכחול עם פרוסה על גבי בריכת מים ולשחרר את הפרוסה אל המים על ידי לדפוק את זה עם מחט עמום בקצה לנתיחה. פרוסה תרחיב לצורה עגולה ברגע שהוא פוגע פני המים.
כאשר רוב שטח פני המים של החדר הרכבה מלא פרוסות סעיף, להתחנף כמעט מחצית מהמים באמצעות פיפטה פסטר. דגירה את השקופית שקופית לילה חם לעשות המדגם להתייבש לחלוטין.
Counter-כתם עם 1ml של DAPI (0.1mg/ml ב TE) במשך חמש דקות. לשאוב DAPI ויבש המדגם.
הסר את מבודדת גומי סיליקון מתוך השקופית. עכשיו ניתן לקחת תמונות של המדגם. חנות המדגם ב 4 ° C, מוגן מפני אור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.