Biology

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Perfiles de plástico para mantener la morfología real del tejido en secciones finas de tejido que puede ser immunostained con anticuerpos fluorescentes secundaria, lo que hace este método más útil que las secciones incluidas en parafina o congelado para muchos tipos de tejido. El método de tinción, la incorporación de plástico, y la sección se demuestra en este vídeo.

Protocol

Fijación

La transferencia de embriones enteros o disecados en explantes MEMFA o 3,7% FA + PBS en un frasco de cristal de centelleo pequeño (gato Fisher # 03-339-25B). Incubar vial en el nutator a temperatura ambiente, sólo durante 2 horas, y no más que eso. No deje que el embrión en el FA por más de 2 horas. Ya de incubación en el FA hará que el tejido embrionario más difícil y el resultado de una pobre penetración de anticuerpos en el proceso de detección.
Aspirar la mayor parte de FA y añadir el fijador de Dent hasta la parte superior del vial (~ 4.5ml). Invierta suavemente el vial durante un par de veces para lavar los embriones en Dent, el intercambio con otros 4.5ml de la Dent fresca, y se incuba en -20 º C durante al menos 48 horas. Durante la noche no es suficiente. Con este paso, los embriones más permeable para el anticuerpo. Los embriones pueden mantenerse en este estado durante varias semanas.

Inmunofluorescencia

Rehidratar la muestra. Incubar en una serie gradual de metanol, de la siguiente manera:

75% MeOH / H ₂ O 10 minutos
50% MeOH / PBS 10 minutos
25% MeOH / PBS 10 minutos
PBS 10 minutos
PBS 10 minutos
Hacer agarosa al 1,5% / PBS con placas de 60 mm platos de plástico. Vierta la PBS en la parte superior de la agarosa después de que se ha convertido en sólidos.
Hemi-sección de los embriones: Poner a los embriones en un 1,5% de agarosa / PBS plato. Coge un embrión con un par de pinzas y cortar por la mitad a través del centro del embrión utilizando una hoja de afeitar delgada. Elegir los que ya ha reducido a la mitad con un plano de corte recto.
La transferencia de los embriones atravesada en un vial de centelleo de vidrio con PBT. Intercambio con 4.5ml del 20% de suero de cabra + PBT. Se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas en un nutator (bloqueo).
Preparar una dilución apropiada de anticuerpo primario en PBT. 0,5 ml de esta muestra por que se necesita. Por ejemplo, he utilizado una dilución 1 / 200 de conejo anti-C-cadherina pab para estudiar la localización subcelular de la C-cadherina en las secciones de 5 mm de plástico.
Aspirar la solución de bloqueo y añadir 0,5 ml del anticuerpo primario diluido. Ponga los frascos en posición de stand-up en un soporte de tubo de espuma de poliestireno. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator.
Eliminar el anticuerpo primario diluido (este anticuerpo primario diluido se pueden guardar y volver a utilizar en los próximos 1-2 semanas). Lavar con 4.5ml de PBT de 4 veces (40-60 minutos) a temperatura ambiente.
Intercambio con 0,5 ml de la dilución 1 / 100 de biotina-anticuerpo secundario conjugado en PBT. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator. Cubrir los frascos con papel de aluminio para proteger la biotina de la luz.
Desde este punto, se debe tener cuidado para proteger la muestra de la luz, es decir, mantener los viales bajo alguna cobertura o papel de aluminio.
Remover los anticuerpos con biotina secundaria (esto también se puede reutilizar en los próximos 1-2 semanas). Lavar con 4.5ml o de PBT de 4 veces (40-60 minutos) a temperatura ambiente.
Intercambio con 0,5 ml de 1 / 200 de dilución de fluorescencia con etiqueta (FITC, Texas-rojo, etc) estreptavidina en PBT. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator.
Retire la estreptavidina (este puede ser reutilizado, también). Lavar con 4.5ml de PBT para 3 veces (15 - 30 minutos cada uno) a temperatura ambiente.
Fijar los embriones en 4.5ml de FA del 3,7% + PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Lavar con 4.5ml de PBS dos veces.
Deshidratar la muestra. Incubar en una serie gradual de etanol, de la siguiente manera:

30% de EtOH / H ₂ O 10 min
50% de EtOH / H ₂ O 10 min
75% de EtOH / H ₂ O 10 min
EtOH al 100% 10 min
La muestra se puede almacenar en EtOH 100% a 4 º C con una cubierta para protegerlo de la luz.

Infiltración

Hacer Technovit 7100 mezcla de infiltración. Yo normalmente me echo 15 ml de líquido de base en un tubo de 50 ml Erlenmeyer y añadir 150 mg de catalizador que se mezcla y, colocándola en un nutator durante 15 minutos. Esta mezcla de infiltración pueden mantenerse a 4 ° C durante un máximo de un mes.
Se infiltran en la muestra con la mezcla de infiltración a través del intercambio con una serie gradual de la infiltración Technovit mezcla / EtOH combo, de la siguiente manera:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 hora
2. 100% Technovit - 1 hora
3. 100% Technovit - durante la noche
El specimen se pueden almacenar en la mezcla de infiltración al 100% para un máximo de un mes a 4 º C. Colocar una tapa sobre las muestras para protegerlo de la luz.

Incrustación

Hacer Technovit 7100 mezcla incrustación: Tome 0.75ml de la mezcla de infiltración en un tubo de 1.5 ml y añadir 50 ml de endurecedor II. Se mezcla por momentos invirtiendo el tubo varias.
Con una pipeta de transferencia de plástico, tomar una muestra infiltrado durante la noche en 0,5 ml delgada pared del tubo de PCR. Eliminar la mayor parte del sobrenadante.
Añadir 0,25 ml de la mezcla de la incrustación en el paso # 1 de esta sección, "Incorporación", a la muestra. Orientar el embrión dividido en dos para hacer el plano de disección se enfrenta a la parte inferior del tubo, empujando suavemente con una aguja de punta redondeada, la disección (de madera de mango aguja de disección).
Cierre la tapa e incubar el tubo en un lugar oscuro durante aproximadamente cuatro horas para permitir que el plástico se polimerizan.
Hacer Technovit 3040 mezcla. Tomar 1 gramo de polvo en un plato de pesaje, y añadir 0,5 ml del líquido. Inmediatamente, mezcla de polvo y líquido con un bluetip. Vierta en la parte superior de la spacimen endurecido. Este amarillo Technovit 3040 impedirá que el bloque de plástico, desde la que sale del tubo.

Seccionamiento

Limpie Histoknife H con xileno (EtOH a menudo no es lo suficientemente bueno) y lo puso en el microtomo. Ángulo de la hoja a unos 45 °. Limpie el área del escenario en frente de la cuchilla con xileno, también, porque la limpieza de esta área es fundamental para la calidad de los cortes seccionados.
Corte el extremo del tubo y la cáscara de la punta fuera con un cuchillo de cartón.
Establecer la muestra en el soporte de sujeción del microtomo.
Adjuntar un "press-a-seal" aislante de silicio en un portaobjetos de vidrio para hacer una cámara de montaje de cortes de sección. Presione firmemente el aislante de la diapositiva en la mesa de trabajo limpia y mira desde el otro lado para asegurarse de que el aislante está bien conectado, sin burbujas de aire. Vierta limpio y cálido dH ₂ O (~ 40 ° C) a la piscina en la diapositiva con una pipeta Pasteur, hasta el nivel donde se puede observar que la superficie del agua se vuelve plano, cóncavo o convexo, no en forma.
Empezar a hacer cortes de sección. Para los estudios de inmunofluorescencia, hago 5 rebanadas mm de sección. En las muestras de hibridación in situ, el grosor de las rodajas puede ser ajustado en el rango de ~ 3-8 mm, dependiendo del propósito y la intensidad de las señales.
Llevar a las rodajas de sección de la etapa por delante de la hoja a la cámara de montaje con agua, usando una brocha pequeña. Sujete la brocha con una rodaja en la parte superior de la piscina de agua y colocar el trozo hasta el agua golpeando con una aguja de punta redondeada, la disección. El corte se extenderá en forma circular tan pronto como se llega a la superficie del agua.
Cuando la mayoría de la superficie del agua de la cámara de montaje está lleno de rebanadas de sección, absorben casi la mitad del agua con una pipeta Pasteur. Incubar el portaobjetos en una noche caliente de diapositivas para que la muestra esté completamente seco.
Tinción de contraste con 1 ml de DAPI (0.1mg/ml en TE) durante cinco minutos. Aspirar DAPI y seco de la muestra.
Quitar el aislante de goma de silicona de la diapositiva. Ahora se pueden tomar fotografías de la muestra. Conservar la muestra a 4 ° C, protegido de la luz.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.