Biology

Plastic Inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo's

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Plastic onderdelen te behouden waar weefsel morfologie in dunne secties van weefsel dat kan worden immunostained met fluorescerende secundaire antilichamen, waardoor deze methode meer nuttiger dan in paraffine ingebedde of bevroren secties voor vele soorten weefsel. De methode voor het kleuren, plastic inbedding, en snijden wordt gedemonstreerd in deze video.

Protocol

Bevestiging

Overdracht gehele embryo's of ontleed explanten in MEMFA of 3,7% FA + PBS in een kleine glazen scintillatieflesje (Fisher cat # 03 tot 339-25B). Incubeer flacon op de nutator bij kamertemperatuur, alleen voor 2 uur, en niet meer dan dat. Laat de embryo in de FA voor meer dan 2 uur. Langere incubatietijd in FA zal de embryonale weefsel harder en resulteren in een slechte penetratie van antilichamen in de detectie proces.
Aspireren het grootste deel van FA en voeg Dent's fixatief naar de top van de flacon (~ 4.5ml). Zwenk de flacon voor een paar keer om de embryo's wassen in Dent's, uitwisseling met een andere 4.5ml van verse Dent, en incuberen in -20 º C gedurende ten minste 48 uur. 'S nachts is niet genoeg. Deze stap maakt de embryo's meer doorlaatbaar voor het antilichaam. Embryo's kunnen worden gehouden in deze toestand gedurende enkele weken.

Immunofluorescentie

Hydrateren het monster. Incubeer het in een gegradeerde reeks van methanol, als volgt:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Maak 1,5% agarose / PBS platen met 60mm plastic schaaltjes. Giet PBS op de top van de agarose nadat deze is geworden solide.
Hemi-snijden van de embryo's: Zet de embryo's in een 1,5% agarose / PBS plaat. Pak een embryo met een pincet en snijd het in half door het centrum van het embryo met behulp van een dun scheermesje. Kies degene die je succes hebben in de helft gesneden met een rechte snijvlak.
Breng de doorsneden embryo's in een glazen scintillatieflesje met PBT. Uitwisseling met 4.5ml van 20% geit serum + PBT. Incubeer bij RT gedurende 2 uur op een nutator (Blocking).
Bereid een geschikte verdunning van het primaire antilichaam in PBT. 0,5 ml van deze per monsters nodig. Zo gebruikte ik 1 / 200 verdunning van konijn anti-C-cadherine pAb om de subcellulaire lokalisatie van C-cadherine in 5mm plastic delen te bestuderen.
Aspireren de blockingbuffer en voeg 0,5 ml van de verdunde primaire antilichaam. Zet de flacons in de stand-up positie op een piepschuim buis houder. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator.
Verwijder de verdunde primaire antilichaam (deze verdunde primaire antistof kunnen worden opgeslagen en hergebruikt in de komende 1-2 weken). Wassen met 4.5ml van PBT voor 4 keer (40-60 minuten per stuk) bij RT.
Uitwisseling met 0,5 ml van 1 / 100 verdunning van biotine-geconjugeerd secundair antilichaam in PBT. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator. Bedek de flacons met aluminiumfolie om biotine te beschermen tegen licht.
Vanaf dit punt moet erop worden genomen om het monster te beschermen tegen licht, dat wil zeggen, houd de vaatjes onder een deksel of aluminiumfolie.
Verwijder de biotine-secundair antilichaam (dit kan ook worden hergebruikt in de komende 1-2 weken). Wassen met of 4.5ml van PBT voor 4 keer (40-60 minuten per stuk) bij RT.
Uitwisseling met 0,5 ml van 1 / 200 verdunning van fluorescent-gelabeld (FITC, Texas-rood, etc.) Streptavidine in PBT. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator.
Verwijder de streptavidine (dit kan worden hergebruikt, ook). Wassen met 4.5ml van PBT voor de 3 keer (15 - 30 minuten per stuk) bij RT.
Bevestig de embryo's in 4.5ml van 3,7% FA + PBS gedurende 30 minuten bij RT.
Twee keer wassen met 4.5ml van PBS.
Uitdrogen van het preparaat. Incubeer het in een gegradeerde reeks van ethanol, als volgt:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
Het monster kan worden opgeslagen in 100% EtOH bij 4 º C met een dekking van het te beschermen tegen licht.

Infiltratie

Maak Technovit 7100 infiltratie mix. Ik heb meestal 15 ml van de basis vloeistof in een 50 ml conische buis, voeg 150 mg van de verharder I en meng het door schommelen op een nutator gedurende 15 minuten. Deze infiltratie mix kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
Infiltreren het exemplaar met de infiltratie mix door het uitwisselen met een gesorteerde reeks Technovit infiltratie mix / EtOH combo, als volgt:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 uur
2. 100% Technovit - 1 uur
3. 100% Technovit - 's nachts
De specimen kan worden opgeslagen in de 100% infiltratie mix voor maximaal een maand bij 4 º C. Leg een deksel op de monsters om ze te beschermen tegen licht.

Inbedding

Maak Technovit 7100 embedding mix: Neem 0.75ml van de infiltratie mix in een 1,5 ml tube en voeg 50 ml verharder II. Meng het door het omkeren van de buis een paar keer.
Met behulp van een plastic overdracht Pipetteer een exemplaar geïnfiltreerd 's nachts in 0,5 ml dunne wand PCR-buis. Verwijder het merendeel van het supernatant.
Voeg 0,25 ml van de inbedding mix gemaakt in stap 1 van deze paragraaf, "Embedding ', het model. Orient de embryo doorkruist om de dissectie vliegtuig gericht naar de bodem van de buis te maken, door zachtjes wenkt met een doffe-tip dissectie naald (houten handvat dissectie naald).
Sluit de dop en incubeer de buis in een donkere plaats voor ongeveer vier uur om de plastic polymeriseren.
Maak Technovit 3040 mix. Neem 1 gram van het poeder om een droogschaal, en voeg 0,5 ml van de vloeistof. Onmiddellijk, mix poeder en vloeistof met behulp van een bluetip. Giet op de top van de geharde spacimen. Deze gele Technovit 3040 wordt voorkomen dat de hele plastic blok van coming out van de buis.

Snijden

Veeg Histoknife H met xyleen (EtOH is vaak niet goed genoeg) en zet het op uw microtoom. Hoek van het blad op ongeveer 45 °. Veeg het toneel in de voorkant van het blad met xyleen, ook, omdat de zuiverheid van dit gebied is cruciaal voor de kwaliteit van de doorsnede plakjes.
Snijd de zijkant van de buis en schil de tip uit met een kartonnen mes.
Zet het preparaat in de klauw houder van het microtoom.
Bevestig een "pers-to-seal" silicon isolator op een dia glas om een bevestiging kamer voor sectie plakjes te maken. Druk stevig op de isolator op de dia op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen. Giet schoon en warm dH ₂ O (~ 40 ° C) naar het zwembad op de dia met behulp van een Pasteur pipet, tot op het niveau waar het kan worden gezien dat het wateroppervlak wordt plat, geen holle of bolle vorm.
Begin met het maken sectie plakjes. Voor de immunofluorescentie studies, Ik maak 5 mm sectie plakjes. Voor de in situ hybridisatie monsters, kan de dikte van de plakjes worden ingesteld in het bereik van ~ 3 - 8 mm, afhankelijk van het doel en de intensiteit van de signalen.
Draag de sectie plakjes vanaf het podium in de voorkant van het blad aan de montage kamer met water, met behulp van een klein penseel. Houd de kwast met een schijfje op de top van het water zwembad en laat de slice naar het water door kloppen met een dof-tip dissectie naald. Het schijfje zal uitgroeien tot een ronde vorm zodra hij raakt het oppervlak van het water.
Wanneer de meeste van het water oppervlakte van de montage-kamer gevuld is met sectie plakken, zuigen bijna de helft van het water met behulp van een Pasteur pipet. Incubeer de foto op een dia warmere 's nachts om de sample volledig droog is.
Counter-vlek met 1 ml van DAPI (0.1mg/ml in TE) gedurende vijf minuten. Aspireren DAPI en droog het monster.
Verwijder de siliconen rubber isolatie uit de dia. Nu foto's kunnen worden genomen van het monster. Bewaar het monster bij 4 ° C, beschermd tegen licht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.