Biology

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

أقسام البلاستيك الحفاظ على النسيج الحقيقي التشكل في الفروع رقيقة من الأنسجة التي يمكن immunostained مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، مما يجعل هذا الأسلوب أكثر فائدة من الفروع جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة لكثير من أنواع الأنسجة. ويتجلى أسلوب التلوين ، التضمين من البلاستيك ، وsectioning في هذا الفيديو.

Protocol

تثبيت

نقل الأجنة كليا أو explants تشريح في MEMFA أو 3.7 ٪ FA + برنامج تلفزيوني في قارورة زجاجية صغيرة التلألؤ (فيشر القط # 03-339 - 25B). احتضان فيال على nutator على RT ، فقط لمدة 2 ساعة ، وليس أكثر من ذلك. لا تترك الأجنة في كرة القدم لأكثر من 2 ساعة. وسوف تعد حضانة في كرة القدم جعل الأنسجة الجنينية أكثر صعوبة ويؤدي إلى انتشار سوء الأضداد في عملية الكشف.
نضح معظم FA وإضافة تثبيتي دنت لتصل إلى الجزء العلوي من القارورة (~ 4.5ml). عكس القارورة بلطف لعدة مرات لغسل الأجنة في دنت ، وتبادل مع آخر 4.5ml من دنت لالعذبة ، وذلك في احتضان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 48 ساعة. وبين عشية وضحاها لا يكفي. هذه الخطوة يجعل الأجنة أكثر نفاذا للجسم. يمكن الاحتفاظ الأجنة في هذه الحالة لعدة أسابيع.

المناعي

ترطيب العينة. احتضان في سلسلة متدرجة من الميثانول ، على النحو التالي :

75 ٪ MeOH / H ₂ O 10min
50 ٪ MeOH / PBS 10min
25 ٪ MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
جعل 1.5 ٪ agarose / برنامج تلفزيوني مع لوحات الصحون البلاستيكية 60mm. من أجل برنامج تلفزيوني على رأس agarose بعد أن أصبحت صلبة.
نصفي sectioning الأجنة : وضع الأجنة في لوحة agarose / PBS 1.5 ٪. الاستيلاء على الجنين مع زوج من الملقط وقطع عليه في النصف عن طريق مركز جنين باستخدام شفرة حلاقة رقيقة. اختيار تلك التي كنت قد قطعت بنجاح في نصف مع طائرة قطع مستقيمة.
نقل الأجنة شطر الى قنينة زجاجية مع PBT التلألؤ. تبادل مع 4.5ml من الماعز 20 ٪ + PBT المصل. RT في احتضان لمدة 2 ساعة على nutator (حجب).
يعد التخفيف المناسبة من الأجسام المضادة الأولية في PBT. وهناك حاجة لهذه العينات 0.5ml الواحد. على سبيل المثال ، كنت 1 / 200 تمييع أرنب المضادة - C - كادهيرين PAB لدراسة توطين التحت خلوية من طراز C - كادهيرين في الفروع البلاستيك 5mm.
نضح عرقلة الحل وإضافة 0.5ml من الأجسام المضادة الأولية المخففة. وضع قنينة في موقف متابعة الموقف على حامل أنبوب الستايروفوم. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على nutator.
إزالة الأجسام المضادة الأولية المخففة (ويمكن حفظ هذه الأضداد المخففة الأولية وإعادة استخدامها في الأسابيع المقبلة 1-2). يغسل مع 4.5ml من PBT لمدة 4 مرات (40-60 دقيقة لكل منهما) في RT.
تبادل مع 0.5ml من مخفف 1 / 100 من البيوتين ، مترافق الضد الثانوية في PBT. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على nutator. تغطية قارورة برقائق الألومنيوم لحماية البيوتين بعيدا عن الضوء.
من هذه النقطة ، ينبغي الحرص على حماية عينة من أي ضوء ، والحفاظ على بعض قوارير تحت غطاء أو رقائق الألومنيوم.
إزالة الأجسام المضادة البيوتين المرحلة الثانوية (ويمكن استخدامها أيضا في هذه الأسابيع القادمة 1-2). يغسل مع أو 4.5ml من PBT لمدة 4 مرات (40-60 دقيقة لكل منهما) في RT.
تبادل مع 0.5ml من 1 / 200 تمييع المسمى - fluorescently (FITC ، تكساس الحمراء ، الخ.) Streptavidin في PBT. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على nutator.
إزالة streptavidin (يمكن استخدامها هذا ، أيضا). يغسل مع 4.5ml من PBT لمدة 3 مرات (15 -- 30 دقيقة لكل منهما) في RT.
إصلاح الأجنة في 4.5ml من 3.7 ٪ + PBS الاتحاد لمدة 30 دقيقة في RT.
يغسل مع 4.5ml من برنامج تلفزيوني مرتين.
يذوى العينة. احتضان في سلسلة متدرجة من الايثانول ، على النحو التالي :

30 ٪ EtOH / H ₂ O 10 دقيقة
50 ٪ EtOH / H ₂ O 10 دقيقة
75 ٪ EtOH / H ₂ O 10 دقيقة
100 ٪ EtOH 10 دقيقة
ويمكن تخزين العينات في EtOH 100 ٪ في 4 درجات مئوية مع غطاء لحمايته من الضوء.

تسلل

جعل مزيج Technovit تسلل 7100. أنا عادة ما تأخذ 15ml السائل في أنبوب قاعدة 50ml المخروطية ، إضافة 150mg من تصليب الأول ومزجها التي تعصف على nutator لمدة 15 دقيقة. ويمكن الاحتفاظ بهذا المزيج التسلل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد.
التسلل العينة مع مزيج تسلل من خلال تبادل مع سلسلة متدرجة من السرد Technovit مزيج / EtOH تسلل ، على النحو التالي :
1. 50 ٪ Technovit / EtOH -- 1 ساعة
2. 100 Technovit ٪ -- 1 ساعة
3. Technovit 100 ٪ -- بين عشية وضحاها
وspecimeويمكن تخزين n في المزيج تسلل 100 ٪ لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجة مئوية. وضع غطاء على عينات لحمايتها من الضوء.

التضمين

جعل مزيج Technovit التضمين 7100 : خذ من هذا المزيج 0.75ml تسلل في أنبوب 1.5ml وإضافة 50ml الثاني تصليب. مزيج من قبل مرات عدة قلب الأنبوب.
باستخدام ماصة نقل البلاستيك وتأخذ واحدة تسللت ليلا إلى العينة 0.5ml أنبوب PCR رقيقة الجدار. إزالة معظم طاف.
إضافة 0.25ml من مزيج تضمين المحرز في الخطوة رقم 1 من هذا الباب ، "التضمين" ، لعينة. توجيه شطر الجنين لجعل الطائرة التي تواجه التشريح إلى أسفل الأنبوب ، وذلك بايعاز بلطف مع إبرة غيض مملة ، تشريح (خشبية التعامل مع إبرة تشريح).
إغلاق الغطاء واحتضان الأنبوب في مكان مظلم لمدة أربع ساعات تقريبا للسماح للتبلمر البلاستيك.
جعل Technovit 3040 المزيج. أخذ 1 غرام من مسحوق إلى صحن وزنها ، وإضافة 0.5ml من السائل. على الفور ، ومزيج من مسحوق والسائلة باستخدام bluetip. صب على رأس spacimen صلابة. وهذا Technovit الصفراء 3040 منع كتلة من البلاستيك بالكامل من الخروج من الأنبوب.

Sectioning

يمسح Histoknife H مع الزيلين (EtOH غالبا ما تكون غير جيدة بما فيه الكفاية) وضعها على مشراح الخاص. زاوية النصل في ما يقرب من 45 درجة. مسح المنطقة أمام مرحلة النصل مع الزيلين ، أيضا ، لأن النظافة في هذه المنطقة أمر بالغ الأهمية لنوعية شرائح مقطوع.
خفض الجانب من الأنبوب وقشر قبالة الطرف باستخدام سكين الكرتون.
مجموعة العينة في حامل تشوك للمشراح.
إرفاق "الصحافة إلى ختم" عازل السيليكون على الشريحة الزجاجية لجعل غرفة متزايدة لشرائح الباب. اضغط بقوة على عازل الشريحة الفوق نظيفة وتبدو من الجانب الآخر للتأكد من أن يتم إرفاق عازل تماما دون أي فقاعات الهواء. صب نظيفة ودافئة درهم ₂ O (~ 40 درجة مئوية) إلى تجمع على الشريحة باستخدام ماصة باستور ، وتصل إلى المستوى الذي يمكن أن نرى أن سطح الماء يصبح مسطح ، أو محدبة مقعرة لا في الشكل.
البدء في صنع شرائح الباب. المناعي للدراسات ، وأنا جعل شرائح الباب 5 ملم. لفي عينات الموقع التهجين ، يمكن تعديلها سمك الشرائح في نطاق ~ 3-8 ملم ، تبعا للغرض وشدة الإشارات.
حمل المقطع شرائح من المرحلة امام نصل إلى غرفة المتصاعد مع الماء ، وذلك باستخدام الفرشاة الصغيرة. عقد الفرشاة مع شريحة على رأس بركة ماء وإسقاط شريحة وصولا الى المياه يطرق مع إبرة غيض مملة ، تشريح. سيتم التوسع في شريحة شكل دائري بمجرد أن يضرب سطح الماء.
عندما يتم تعبئة معظم المياه السطحية للمنطقة الغرفة المتصاعد مع شرائح الباب ، تمتص ما يقرب من نصف المياه باستخدام ماصة باستور. احتضان الشريحة على الشريحة يؤدي ارتفاع درجة حرارة بين عشية وضحاها لجعل عينة يجف تماما.
مكافحة وصمة عار مع 1ml من دابي (0.1mg/ml في TE) لمدة خمس دقائق. نضح دابي والجافة العينة.
إزالة العازل المطاطي سيليكون من الشريحة. ويمكن الآن أن تؤخذ الصور من العينة. تخزين العينة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.