Biology

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Sections en plastique de maintenir la morphologie des tissus vrai dans des coupes minces de tissus qui peuvent être immunocolorées avec des anticorps secondaires fluorescents, rendant cette méthode plus utile que des sections de paraffine ou congelés pour de nombreux types de tissus. La méthode de coloration, d'inclusion plastique, et le sectionnement est démontré dans cette vidéo.

Protocol

Fixation

Transfert des embryons entiers ou disséqués en explants MEMFA ou 3,7% FA + PBS dans un flacon à scintillation en verre de petite taille (chat Fisher # 03-339-25B). Incuber sur le flacon nutator à TA, seulement pour 2 heures, et pas plus que cela. Ne laissez pas l'embryon dans la FA pendant plus de 2 heures. D'incubation plus longue dans FA rendra plus difficile le tissu embryonnaire et entraîner une mauvaise pénétration des anticorps dans le processus de détection.
Aspirer la plupart des FA et ajouter fixateur de Dent au sommet du flacon (4,5 ml ~). Retourner doucement le flacon pour quelques temps à se laver les embryons dans Dent, échange avec un autre 4,5 ml de produits frais de Dent, et il incuber en -20 º C pendant au moins 48 heures. Nuit n'est PAS suffisant. Cette étape permet les embryons plus perméable à l'anticorps. Les embryons peuvent être conservés dans cet état pendant plusieurs semaines.

Immunofluorescence

Réhydrater le spécimen. Il Incuber dans une série graduée de méthanol, comme suit:

75% de MeOH / H ₂ O 10min
50% de MeOH / PBS 10min
25% de MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Faire agarose à 1,5% / PBS plaques avec 60mm plats en plastique. Verser PBS sur le dessus de l'agarose après qu'il est devenu solide.
Hemi-sectionnement de l'embryon: Mettez les embryons dans un agarose à 1,5% / PBS assiette. Prenez un embryon avec une paire de pinces et le couper en deux par le centre de l'embryon à l'aide d'une lame de rasoir mince. Choisissez celles que vous avez réussi à réduire de moitié avec un plan de coupe droite.
Transfert des embryons traversée dans un flacon à scintillation en verre avec PBT. Echange avec 4,5 ml de lait de chèvre 20% de sérum + PBT. Incuber à température ambiante pendant 2 heures sur un nutator (blocage).
Préparer une dilution appropriée de l'anticorps primaire dans le PBT. 0.5ml de cette échantillons par est nécessaire. Par exemple, j'ai utilisé une dilution 1 / 200 de lapin anti-C-cadhérine pAb pour étudier la localisation subcellulaire de C-cadhérine dans 5mm sections en plastique.
Aspirer la solution de blocage et ajouter 0,5 ml de l'anticorps dilué primaire. Mettre les flacons en stand-up position sur un porte-tube en polystyrène. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator.
Retirez les anticorps dilué primaire (cet anticorps primaires dilués peuvent être sauvegardés et réutilisés dans les 1-2 prochaines semaines). Laver avec 4,5 ml de PBT pour 4 fois (40-60 minutes chacun) à température ambiante.
Echange avec 0,5 ml de dilution de 1 / 100 de biotine-anticorps secondaire conjugué au PBT. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator. Couvrir les flacons avec du papier aluminium pour protéger la biotine de la lumière.
De ce point, des précautions doivent être prises pour protéger l'échantillon de la lumière, c'est à dire, garder les flacons dans une certaine couverture ou du papier aluminium.
Retirez l'anticorps biotine-secondaire (ce peut être également réutilisés dans les 1-2 prochaines semaines). Laver avec ou 4,5 ml de PBT pour 4 fois (40-60 minutes chacun) à température ambiante.
Echange avec 0.5ml de 1 / 200 de dilution du marqués à la fluorescence (FITC, au Texas, rouge, etc) streptavidine en PBT. Incuber une nuit à 4 ° C sur une nutator.
Retirez la streptavidine (ce qui peut être réutilisé, aussi). Laver avec 4,5 ml de PBT pour 3 fois (15 - 30 minutes chacun) à température ambiante.
Fixer les embryons dans 4,5 ml de 3,7% FA + PBS pendant 30 minutes à température ambiante.
Laver avec 4,5 ml de PBS à deux reprises.
Déshydrater l'échantillon. Il Incuber dans une série graduée d'éthanol, comme suit:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
Le spécimen peut être stockée dans EtOH 100% à 4 º C avec une housse pour le protéger de la lumière.

L'infiltration

Faire mélangez Technovit infiltrations 7100. J'ai l'habitude de prendre 15ml de liquide de base dans un tube 50ml conique, ajouter 150 mg de durcisseur I et le mélanger en basculant sur un nutator pendant 15 minutes. Ce mélange infiltration peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
Infiltrez le spécimen avec le mélange de l'infiltration en échangeant avec une série graduée de l'infiltration Technovit mix / EtOH combo, comme suit:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 heure
2. 100 Technovit% - 1 heure
3. 100% Technovit - nuit
Le specimen peut être stocké dans le mélange infiltration de 100% jusqu'à un mois à 4 º C. Mettez un couvercle sur les échantillons afin de les protéger de la lumière.

Embedding

Faire mélangez Technovit intégration 7100: Prendre 0,75 ml du mélange d'infiltration dans un tube de 1,5 ml et ajouter 50 ml de durcisseur II. Mélangez-le par les temps le tube retournant plusieurs.
Avec une pipette de transfert en plastique, prenez un échantillon infiltré durant la nuit dans le tube mince mur de 0.5ml PCR. Retirez la plupart du surnageant.
Ajouter 0,25 ml du mélange intégration faite à l'étape n ° 1 du présent article, «Intégration», pour l'échantillon. Orienter l'embryon traversée de faire le plan de dissection face vers le bas du tube, en poussant délicatement avec une aiguille à pointe de dissection ternes (bois poignée d'aiguilles de dissection).
Fermer le capuchon et incuber le tube dans un endroit sombre pendant environ quatre heures pour permettre le plastique polymériser.
Faire Technovit 3040 mix. Prendre 1 gramme de la poudre dans un plat de pesage, et ajouter 0,5 ml de liquide. Immédiatement, mélanger la poudre et liquide en utilisant un bluetip. Verser sur le dessus du spacimen durci. Ce jaune Technovit 3040 permettra d'éviter l'ensemble du bloc en plastique de sortir du tube.

Sectionnement

Essuyez Histoknife H avec du xylène (EtOH n'est souvent pas assez bon) et le mettre sur votre microtome. Angle de la lame à 45 ° environ. Essuyez la zone de scène en face de la lame avec le xylène, aussi, parce que la pureté de cette région est essentielle à la qualité des tranches sectionné.
Couper le côté du tube et le zeste de l'extrémité hors aide d'un couteau en carton.
Réglez le spécimen dans le porte-mandrin du microtome.
Joindre un "press-to-joint" isolant de silicium sur une lame de verre pour faire une chambre de montage pour les tranches de section. Pressez fermement l'isolant à la diapositive sur paillasse propre et regarder de l'autre côté pour s'assurer que l'isolant est totalement attachée sans bulles d'air. Verser propre et chaleureux dH ₂ O (~ 40 ° C) à la piscine sur la diapositive à l'aide d'une pipette Pasteur, jusqu'au niveau où il peut être vu que la surface de l'eau devient plat, et non pas concave ou convexe en forme.
Commencez à faire des tranches article. Pour les études d'immunofluorescence, je fais 5 tranches mm de section. Pour des échantillons de l'hybridation in situ, l'épaisseur des tranches peut être ajusté dans la gamme de ~ 3 - 8 mm, selon le but et les intensités des signaux.
Effectuer les tranches de section de la scène en face de la lame à la chambre de montage avec de l'eau, en utilisant un petit pinceau. Tenir le pinceau avec une tranche sur le dessus de la piscine d'eau et déposez les tranches vers l'eau en le frappant avec une aiguille à pointe ternes dissection. La tranche se lancera dans une forme circulaire dès qu'il frappe la surface de l'eau.
Quand la plupart de la surface de l'eau de la chambre de montage est rempli avec des tranches de section, sucer presque la moitié de l'eau à l'aide d'une pipette Pasteur. Incuber la lame sur une nuit chaude diapositive à rendre l'échantillon complètement sec.
Contre-tache avec 1ml de DAPI (0.1mg/ml dans TE) pour cinq minutes. Aspirer DAPI et sec de l'échantillon.
Retirez l'isolation en caoutchouc de silicone de la diapositive. Maintenant les photos peuvent être prises de l'échantillon. Conserver l'échantillon à 4 ° C, protégé de la lumière.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.