大人のウサギの網膜の器官培養

Summary

この記事では、ウサギの網膜とGFPまたは網膜神経節細胞への細胞内マーカーの様々なコードするプラスミドの粒子による遺伝子導入の解剖とインキュベーションを示しています。

Abstract

機能的な神経組織の器官培養系は、神経生物学的研究において重要なツールです。理想的には、そのようなシステムは、イメージング技術、遺伝子操作、および電気生理学的記録と互換性があります。ここでは特殊な装置とほとんどメンテナンスを必要としない成人ウサギの網膜のためのシンプルな相間の組織培養系を提示する。我々は、ウサギの網膜とGFPまたは網膜神経節細胞への細胞内マーカーの様々なコードするプラスミドの粒子による遺伝子導入の解剖とインキュベーションを示す。ウサギの網膜は、この方法では、最大ほとんど全体的な解剖学的構造の変化や個々の形態、神経節およびアマクリン細胞で6日まで存続し続けることができる培養。

Protocol

作る遺伝子銃の弾丸（GOLD）

1. 100％EtOH中で100X PVP（0.5mg/ml）を作る。
2. BioRad社1.6ミクロンのマイクロキャリアの金の30mgのを秤量し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに入れてください。
3. 0.5から3μgのプラスミド/ mgの金の濃度を与えるために必要なプラスミドの量を計算し、金のマイクロキャリアとチューブにプラスミドを置きます。必要に応じていくつかのプラスミドを組み合わせる。
4. 蒸留水で100μlにプラスミドの量をもたらす。
5. 管に0.05Mスペルミジンの100μlを追加します。ボルテックスチューブ30秒。
6. ボルテックスフルスピードで1分。 3〜5分間超音波洗浄器にかけます..
7. 15分間バイオラッドPDS-1000/He装置におけるテフゼルチューブの適切な長さを乾燥させます。
8. フルスピードで1〜2分間超音波処理後、ボルテックス。ボルテックスしながらチューブを開くことができるように徐々に速度を減少させる。
9. ボルテックスしながら賢い管のドロップにゆっくりと1 M CaCl ₂を100μlのを追加。
10. 室温で10分間チューブを残す。
11. 5ミクロンのフィルタを行います。
    1. 針なしで2つ5ミリリットル注射器を取る。
    2. プランジ​​ャーを外し、黒いキャップを外してください。小さなはさみながら、リングを与えるために黒い帽子の一部を切断。ネットつのリングに他のプランジャーを繰り返します。
    3. サンドイッチ二つの環の間に5ミクロン（スモールパーツ社ナイロンフィルター、½インチ直径）フィルタ、およびシリンジの先端にサンドイッチを押してください。
    4. 50ミリリットル三角フラスコ上にシリンジをちらつかせる。
12. 10分後、ボルテックスで30秒間チューブ。
13. 30秒間チューブを遠心し、ペレットを保存する。
14. ペレットに100％エタノールを1ml追加。ペレット、およびボルテックス30秒を分割するためにピペットチップを使用してください。 30秒のスピンおよびEtOHを除去。さらに2回繰り返します。
15. （ヒントと別れる）ペレットに100％エタノールを1mlを追加。 5ミクロンフィルターにこれを置いてと50mlのコニカルチューブに重力によってを通して流れ、それをしましょう​​。チューブを洗浄またはフロースルーを助けるために、必要に応じてより多くのエタノールを使用してください。
16. 5〜10分間遠心分離機で2000rpmで50ミリリットルチューブを回転させる。上清を、保存ペレットを削除します。
17. 必要に応じてマイクロキャリアの所望の密度に応じて、800μl- 1.5ミリリットル、100％のエタノールと対応する8μL、15μlのPVP溶液を加える。
18. スワールとすぐにバイオラッドPDS-1000/He装置にアクセスしてください。
19. バイオラッドPDS-1000/He装置
    1. 乾燥管に窒素ガスのタンクを接続するチューブを外します
    2. マシンからテフゼルチューブを乾燥させてください
    3. 50ミリリットルコニカルチューブに一端を挿入し、チューブのもう一方の端にシリンジを取り付けます。チューブの真ん中に茶色のスラリーを吸う。
    4. バックマシンにチューブを挿入します。
    5. 4分間（回転なし）待つ
    6. 4分後、マイクロキャリアを妨害しないことを確認しながら、ゆっくりと慎重にEtOHを吸う。
    7. 1分間チューブを回転させる。
    8. 1分後、乾燥管にN ₂ガ ​​スのタンクを接続するチューブを接続し、15分間チューブを乾燥させて。
20. 15分後、exsiccatorで4℃で直ちに使用または保管される弾丸のサイズのチューブをカット。弾丸は、3ヶ月まで保存することができます。

遺伝子銃の準備

1. カートリッジに弾丸を置きます。網膜の各部分は1-3の弾丸で撮影することができます。
2. 遺伝子銃にカートリッジを挿入し、ヘリウム源に銃を添付。 110 psiまでの圧力設定を行ってください。

メディアの準備

1. 解剖媒体
   
   

   1瓶エイムズ溶液（Sigma社、8.8グラム）

   1.9 gmの重炭酸ナトリウム

   10ミリリットル、1％のペン/ストレプトマイシン/ L -グルタミン（1:100）（ギブコ/インビトロゲン）

   990ミリリットルの蒸留水1Lに

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   1リットル

   
   
   
2. 0.22μmのフィルターを使用して解剖の培地をフィルタ。
   
3. インキュベーション培地（500ミリリットル）
   
   

   フィルタリングされた解剖のメディアの485ミリリットル

   1％のN2サプリメント（GIBCO / Invitrogen）を5mlの

   10ミリリットル1パーセントウマ血清（シグマ）

   フェノールレッドの500μlの

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   0.5 L

   
   
   
4. 0.22μmのフィルターを使用して、インキュベーション培地をフィルタ。
5. 網膜の収穫のプロトコルを開始する前に、15分間解離媒体にバブルO _2。

網膜のためのインキュベーションチャンバーの準備

1. 水面下では、インキュベーション培地25mlでいくつかの60ミリメートルの深皿（インキュベーション室、Nunc社）を記入してください。料理の数は、RETの数に依存InAsは必要。
2. それぞれの深い皿にフィルタースタンドを置きます。スタンドのごく先端が水没してはいけません。
3. 網膜は、準備が整うまでインキュベーターにすべての深い皿を置きます。
4. two 100ミリメートルペトリ皿を記入し、解剖のベンチにもたらす。

ウサギの網膜の調製

1. 確立されたプロトコルに従ってウサギを生け贄に捧げる。以下は、フードの下で実行する必要はありません。
2. 角度のハサミで、目に接続されている膜と視神経を切断、ウサギの目のソケットに目の後ろに挿入します。
3. 静かに目を持ち上げ、酸素解離のメディアでそれを洗ってください。
4. 目のスライサーのウェルに目を（角膜が上向き）に置き、蓋を閉じます。
5. 蓋の下に水平に右のブレードを置きます。の滑らかな動きでは、アイカップを残して、角膜を切断するために目を介してブレードを描く。
6. 鉗子を使用して、よく目のスライサーから網膜を削除し、ろ紙の上に置きます。
7. 切断視神経に近いエリアをクランプし、ろ紙上に後方に引いて、硝子体とレンズを取り外します。ほとんどすべての硝子体が除去されるとアイカップが収縮さになるまで数回繰り返します。
8. 洗浄するために解剖のメディアを持つペトリ皿にアイカップを配置。
9. ピースの希望数（5個の最大値）にアイカップをカット。
10. アイカップの一枚を取り出し、顕微鏡下に置きます。
11. 鉗子を用いて網膜の端に軽く一緒に強膜と脈絡膜のクランプ。一方で、脈絡膜と網膜の間に権利を磨くために細かいブラシを使用してください。
12. それが切り離さになるまで短い、穏やかな動きを使用して、脈絡膜から網膜をいじめる。
13. 無菌トランスファーピペットオフ1インチを切る。洗うことをインキュベーション培地のシャーレに網膜と場所を吸うためにこれを使う。
14. 1インチで別の滅菌転送ピペットを使用すると、カットオフ、慎重に0.4μmのMillicellフィルター（ミリポア、カタログ番号：PICMORG50）に網膜を転送する。
15. 上を向いて神経節細胞の側に向きを網膜にブラシを使用してください。
16. 網膜の縁に軽くブラッシングによって網膜を平らにならす。極力ブラシで神経節細胞層に触れる最小限に抑える。
17. 転送ピペットでフィルターに余分な培地を削除します。
18. 鉗子を使用して、変更suctionerにフィルタを転送する。 suctionerにフィルタからすべてのインキュベーション培地を除去するために2〜3回を描画します。

遺伝子の吹き付けと網膜のインキュベーション

1. ボンネットの下、60ミリメートルの深皿（インキュベーション室）でフィルタのスタンドの上に網膜を含む - フィルタの各々を配置。
2. 培地は、フィルターの下面に接触して、媒体が網膜上にフィルタの両側からこぼれないしていないことであることを確認してください。フィルタは、網膜と媒体との間のインターフェイスとして行動しなければならない。
3. 2つの項目と網膜の各部分を撮影。直接組織上記の場所に遺伝子銃を、約3-4 cm離れた。
4. 37℃インキュベーター - 35のシェーカーにすべてのインキュベーションチャンバーを配置。
5. 毎日インキュベーション培地に交換してください。網膜は、6日間の最大インキュベートすることができます。

Discussion

1。私はこの方法で何ができる？

• 明らかに細胞形態を参照してください。
• そこから記録するためにラベルの細胞。
• PSD95のような過剰発現するタンパク質、、だけでなく、細胞の応答を調節する他のタンパク質、例えばイオンチャネル、受容体。
• 抑制性RNAを発現する。

2。どのくらい私は大人の網膜を保つことができますか？

• 4日間は大人のウサギも問題ありません。 6日後、細胞が"病気"に見える撤回、すなわち軸索には、樹状突起の腫脹および光反応の記録が不安定になった参照してください（細胞のみの約50％は、その時間の後に対光反応のであることがわかった。
• 我々は2日間、マウスの網膜を保った。網膜の血管が新生であり、ウサギの網膜よりも厚いので、マウスでは、より困難です。

3。どのように私はあなたの網膜は、この時間後に健全であることを確認しますか？

• 金本位制はそれらから録音している。神経節細胞は、まだ光に反応してください。あなたは、インキュベーションのための色素上皮から網膜を分析する必要があるため、光色素を漂白避けるために、インキュベーション中の光から組織を保護する必要があります。
• 我々は時折また私たちの網膜をテストするために微小電極アレイの録音を使用。

4。なぜあなたは一度に網膜にのみいくつかのセルを操作したいのですか？

• いくつかの質問は、そうでない場合は対処できません。神経節細胞にインスタンスGABA受容体のために考慮してください。あなたは、GABAブロッカーを使用することができますが、網膜内のすべてのGABA作動性伝達だけではなく、それは特に、そのセルへの影響を区別するのは難しいことがインチあなたが興味を持っているセルへの入力、および全体的な"ネットワーク効果を阻害する"全体の網膜上に。
• あなたがはっきりと形態を表示する場合は、すべてのセルにラベルを付けることができない、そうでなければ、単に混乱を得る。

5。この方法では、人口が染色として適していますか？

• いいえ遺伝子の仕切り屋は、ランダムな手順です。あなたは多くの神​​経節細胞、多くの避難アマクリン細胞、一部のミューラー細胞、および他のすべての細胞型のはるかに少ないが得られます。

6。私はそれを動作させるために知っている任意の"トリック"はありますか？

• そうでもない。しかし、比較的短時間で網膜の解剖を行うことが重要です、あなたが30分以内のフィルタに駒を持っているので。作品は約1平方センチメートルokです、小さすぎてはいけません。 1羽のウサギの眼3から4作品を期待しています。
• 厳密に離れて固定液などの過酷な化学薬品と接触するものから解剖のツールをしてください。
• 35℃ではなく37にしてインキュベーターを設定してみて、網膜が熱くなりすぎたことがないので。
• あなたは少なくとも私たちが日常的にそれをしない、BDNFのようなあなたの培地に成長因子を追加する必要はありませんが、N2サプリメント、1％ウマ血清、及び抗生物質を使用する必要があります。私たちはあなた＆'は、このドキュメントに補足ファイルとして必要があるでしょうすべてのもののリストを提供する。

7。あなたは、遺伝子銃、他のものではなく、プラスミドか？

• はい、我々は色素標識デキストランまたはDIIとDIOを使用しています。しかし、カルシウムインジケーターの染料を使用したり、金またはタングステンの箇条書きの上にコートできるほとんど何でも可能性があります。

8。制限事項は何ですか？

• まず第一に、時間。あなたは、神経節細胞は最終的に退化することを意味視神経を、カットする必要があります。これは最大6日間の問題ではありませんが、それの後に我々はそれ以上の網膜を信用しないだろう。今あなただけのGFPま​​たはいくつかの他の細胞充填マーカーを表現しようとする場合、、2〜3日のインキュベーションで十分ですが、いくつかのケースでは、あなたが阻害RNAを表現したいときなど、効果は、4日以上かかることがありますショー。ここでは、心にタイムラインを維持する必要があります。

9。他にどのような研究者の仕事は、1つは認識しておく必要があります？

• 確かに網膜のフィールド、ワシントン大学のレイチェルウォンの研究室で。作業の多くの人々は、海馬のスライス標本のように、他のシステムで行っていることもあります。我々は、文献の完全な調査を与えることができるふりをするが、参照リストの論文をチェックアウトしないでください。