Summary
نحن تقرير وضع نظام للتصوير الآلي وتحليل الأجنة وراثيا في لوحات multiwell الزرد. هذا يدل على القدرة على قياس آثار الجرعة تعتمد على جزيء صغير ، BCI ، على التعبير عامل نمو الخلايا الليفية الجين مراسل وتوفير التكنولوجيا لإنشاء عالية الإنتاجية شاشات الكيميائية الزرد.
Abstract
علينا أن نظهر صورة لتطبيق يستند إلى منهجية عالية المحتوى (HCS) فحص لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تعدل مسار جمعية جيل المستقبل / RAS / MAPK في الأجنة الزرد. الجنين الزرد هو نظام مثالي للشاشات الكيميائية في الجسم الحي عالية المحتوى. الجنين 1 ايام العمر حوالي 1MM في القطر ، ويمكن بسهولة المحتشدة في لوحات 96 - جيدا ، وشكل موحد للفحص إنتاجية عالية. خلال اليوم الأول للتنمية ، والأجنة وشفافة مع معظم الأجهزة الرئيسية الحالية ، وبالتالي تمكين التصور من خلال تشكيل النسيج الجنيني. أتمتة كاملة من شاشات الزرد الكيميائية لا تزال تمثل تحديا ، ولكن ، لا سيما في مجال تطوير آلية الحصول على الصور وتحليلها. نحن ولدت من قبل خط مراسل المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة نشاط جمعية جيل المستقبل وأثبتت جدواها في شاشات الكيميائية
Protocol
1) إعداد التزاوج الزرد والعلاج BCI.
- قبل يومين من العلاج ، وتحديد تيراغرام الذكور متماثلة اللواقح (dusp6 : d2eGFP) pt6 الزرد ومكان على حدة في خزانات التزاوج 1. إضافة فاصل ونوع الأسماك البرية AB * الإناث ، وترك في أقفاص التزاوج بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي إزالة فاصل ، وجمع الأجنة بعد 1 ساعة. نقل الأجنة لأطباق 100mm مع E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي بوكل ، 0.33 ملي CaCl2 ، 0.33 ملي MgSO4) ، واحتضان الحل عند 28 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. إزالة أجنة ميتة وغير مخصبة ، إضافة الطازجة حل E3 ، واحتضان بين عشية وضحاها.
- فرز الأجنة وراثيا للمرحلة مماثلة (24hpf) وموحدة التعبير GFP. أجنة مجموعة على حدة في كل بئر من لوحة 96 - جيدا.
- إزالة الزائدة حل E3 مع micropipette. إضافة 200μl حل E3 مع pipettor متعدد القنوات في كل بئر.
- إضافة مركبات التالية المدرجة على النحو التالي :
تركيزات النهائية 1μM ، 5μM ، 10μM ، 20μM ، BCI 25μM DMSO في 1 ٪. لوحة الغلاف في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 6 ساعات حتى 28 درجة مئوية.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOB 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOC 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOD 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOE 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOF 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSOG 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5MM)2μl
DMSOH 2μl
DMSO2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
BCL
(0.1mM)2μl
BCL
(0.5mM)2μl
BCL
(1MM)2μl
BCL
(2mm و)2μl
BCL
(2.5mM)2μl
DMSO
2) التصوير الآلي من 96 لوحات جيدة والتحليل.
- إضافة 10μl من tricaine (0.61mM) إلى كل بئر إلى تخدير 30hpf الأجنة.
- تحميل لوحة الجزيئية في الترا Imagexpress الأجهزة.
- فتح Metaxpress البرمجيات. اختيار التكوين مع هدف 4x وأقصى قطر الثقب ، تكوين ليزر للكشف عن ضبط تلقائي للصورة أسفل لوحة ، وتحديد الأمثل Z - الطائرة للكشف عن مناطق الاهتمام. الحصول على الصور في الإثارة / انبعاث موجات من 488 / 525 نانومتر (GFP). مجموعة مسح المنطقة في موقع واحد من 2000x2000 بكسل (4 × 4 ملم) مع عدم وجود binning. تكوين قوة الليزر واكتساب مثل هذه المناطق في صور ألمع مراقبة إيجابية لا تشبع. تأكيد الحصول على الصور المناسبة في العديد من آبار المراقبة الإيجابية والسلبية.
- بدء مسح لوحة. وسوف يكتسب الصك الصور تلقائيا من جميع الآبار وأرشفتها في قاعدة بيانات خادم SQL.
- تحميل الصور إلى المطور Definiens باستخدام وحدة التطبيق Cellenger وتصفية الاستيراد التي تعترف شكل صورة وبنية الملف التي تم إنشاؤها بواسطة منصة الأجهزة الجزيئية الترا Imagexpress.
- صور العملية مع خوارزمية مخصصة الإدراك تصميم شبكة تكنولوجيا (تسمى أيضا مجموعة الأوامر). تم تصميم الخوارزمية ، والتي قمنا بتطويرها على أساس العرف مجموعة الأوامر التي نشرت مؤخرا 2 ، لتحديد الجنين تلقائيا ، صفار البيض ، والرأس ، وإلى قياس السطوع ومنطقة GFP - معربا عن هياكل الرأس. تستثنى الآبار التي لم يتم الكشف عن الجنين أو التي لا يمكن أن تسند الرأس بشكل لا لبس فيه (على سبيل المثال ، مع سمية عالية أو مجمع من الصور التركيز) من التحليل. تكوين الخوارزمية باستخدام عدة لوحات تحكم السلبية (سيارة المعالجة) والصور السيطرة الايجابية (BCI المعالجة) بحيث يتم التعرف بشكل صحيح في الرأس وصفار البيض على حد سواء. تعيين "رئيس هياكل" عتبة الكشف عن المضاعفات وشدة صفار يعني حتى الكشف عن هياكل رأس مشرق مباريات الملاحظة البصرية. تعريف المعلمات للتصدير. في هذا المثال ، كانت المعلمة أكبر قدر من المعلومات سطوع مجموعه متكاملة من GFP إيجابية المناطق داخل الرأس ، ويطلق عليه فيما بعد "مجموع سطوع هياكل الرأس" (الشكل 1).
الشكل 1
الرسم البياني depicitng آثار الجرعة التي تعتمد على حرية التعبير من BCI GFP في الأجنة وراثيا. - تشغيل الخوارزمية على كل الصور باستخدام لوحة متكاملة وجدولة العمل. البرنامج يستخدم Definiens الحوسبة الموزعة على معالجات متعددة ("المحركات") ، مما يتيح التحليل المتزامن لصور متعددة. الخوارزمية بحساب تدابير العددية القائمة على النتائج من تحليل الصور ، والتي يتم حفظها في قاعدة البيانات مع نسخة من الصورة معالجتها ، مع تحليل التطبيقية.
ممثل النتائج :
بعد تحليل جميع الصور والبيانات يمكن أن يكون ضمن تصور Cellenger أو تصديرها إلى برمجيات طرف ثالث (إكسل ، GraphPad بريزم) لمزيد من التحليل وتمثيل رسومي. ويبين الشكل 2 المؤرشفة مسح الصور من سيارة ويعامل معاملة حسنة ، BCI ، مع وبدون تحليل المركز الوطني للاستشعار التطبيقية. الشكل 1 وثائق تأثير الجرعة التي تعتمد على BCI مراسل GFP على التعبير الجيني في تيراغرام (dusp6 : d2EGFP) pt6 الأجنة. كان التركيز المطلوب للحصول على رد half القصوى (EC50) حوالي 12 ميكرومتر. 
الشكل 2
الآلي التقاط الصور وتحليل الأجنة الزرد المعدلة وراثيا. (أ) مركبة DMSO تعامل تيراغرام (dusp6 : d2eGFP) pt6 الجنين في 30hpf. (ب) الأجنة وراثيا تعامل مع BCI 20μM تظهر زيادات في التعبير GFP. (C) صورة الجنين من (A) بعد تشغيل Definiens مجموعة الأوامر للعثور على التعبير GFP في الرأس. بقع برتقالية تدل على البرنامج حيث كثافة التدابير GFP. (D) صورة الجنين من (B) بعد تشغيل Definiens مجموعة الأوامر للعثور على التعبير GFP في الرأس. بقع برتقالية تدل على البرنامج حيث كثافة التدابير GFP. علما بأن مجموعة الأوامر تمكنت من العثور على توسيع مساحة التعبير GFP في الجنين المعالجة.
Discussion
ومن العوامل الرئيسية التي تحد من الإنتاجية من شاشات الكيميائية الزرد هو عدم وجود منهجية لعملية منهجية 96 - جيدا لوحات التصوير والتحليل. لأن الصور من الكائنات المتعددة الخلايا معقدة ، وعلى النقيض منخفضة ، وغير متجانسة في طبيعتها ، الموجودة خوارزميات تحليل الصور تفشل لكشف وتحديد هياكل محددة داخل الكائن الحي. نشرت معظم الزرد الكيميائية تنطوي على الشاشات المرئية لذلك فحص الآبار الفردية عن طريق العاملين المخلصين في جميع أنحاء الداخلي. هذا يمنع عادة توليد قراءات رقمية كاملة وحفظها في ملفات صور الشاشة والبيانات. وعلاوة على ذلك ، وتقييم دليل يلغي العديد من المزايا الرئيسية الصورة القائمة على الفرز ، أي القدرة على إجراء تحليلات بأثر رجعي لأداء الشاشة ، لدراسة التغيرات المظهرية التي لم يتم التركيز الأساسي للحملة الفحص (على سبيل المثال ، سمية أو عيوب التنموية) والعبور إلى المرجع فحص البيانات مع الشاشات الماضي أو في المستقبل باستخدام مكتبة المجمع نفسه.
في هذا التقرير نسلط الضوء على منهجية التصوير الآلي وتحليل الأجنة الزرد في لوحات multiwell دون تدخل المستخدم. نحن التقاط الصور آليا على الليزر الترا ImageXpress المسح مبائر القارئ (الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل كاليفورنيا) لتيراغرام صورة (dusp6 : d2EGFP) pt6 الأجنة في 96 لوحات جيدة وضعت خوارزمية تحليل الصور استنادا Definiens 'الإدراك تكنولوجيا الشبكة التي GFP كميا التعبير في رؤوس الأجنة وراثيا. طريقة تسليم الردود متدرج وكميا في نشاط الجسم الحي من جزيء صغير منشط للإشارة جمعية جيل المستقبل. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع الثاني ArrayScan epifluorescence المستندة (Cellomics شركة ، بيتسبرغ السلطة الفلسطينية) الذي يوثق أنه من الممكن لتنفيذ آلية التقاط الصور من الأجنة الزرد على مجموعة متنوعة من القراء لوحة المتاحة تجاريا 2. القضاء على وضع منهجية لتحليل الصور تلقائيا الكائنات متعددة الخلايا على الحاجة لتسجيل مرئي من قبل المراقب الإنسان وتمكين الجيل وحفظ البيانات والصور الرقمية لتحليل بأثر رجعي ومقارنات مع شاشات المستقبل.
Acknowledgments
ويتم تمويل هذا العمل من قبل معاهد الصحة القومية / المعاهد الوطنية للصحة (1R01HD053287) لHukriede ، NCI / المعاهد الوطنية للصحة (P01 CA78039) لفوغت ، وNHLBI / المعاهد الوطنية للصحة (1R01HL088016) لتسانغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (MS222) | Sigma-Aldrich | Cat.# A-5040 |
References
- Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).
