Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

Summary

Vi rapporterar utvecklingen av ett system för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk transgena embryon i multispot plattor. Detta visar på möjligheten att mäta dosberoende effekter av en liten molekyl, BCI, på Fibroblast Growth Factor reporter genuttryck och erbjuda teknik för att fastställa hög genomströmning skärmar zebrafisk kemikalie.

Abstract

Vi visar tillämpningen av bildbaserade hög halt screening (HCS) metod för att identifiera små molekyler som kan modulera FGF / RAS / MAPK väg i zebrafisk embryon. Den zebrafisk embryot är ett idealiskt system för in vivo hög halt kemiska skärmar. Den 1-dags gammal embryot är ca 1 mm i diameter och kan enkelt klädd i 96-hålsplattor, ett standardformat för hög throughput screening. Under den första dagen av utveckling, embryon är transparenta med de flesta av de stora organen närvarande, vilket möjliggör visualisering av vävnad bildas under fosterutvecklingen. Den kompletta automatisering av zebrafisk kemiska skärmar är fortfarande en utmaning, men framför allt i utvecklingen av automatiserade bild insamling och analys. Vi genererade tidigare en transgen reporter linje som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av FGF aktivitet och visat sin nytta i kemiska skärmar

Protocol

1) Ställ in zebrafisk parningar och BCI behandling.

1. Två dagar före behandlingen, identifiera homozygot manliga Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 zebrafisk och placera sig i parning tankar ^1. Lägg till separatorn och en vild typ AB * honor och lämna i parning burar över natten.
2. Nästa morgon tar bort separatorn, och samla in embryon efter 1 timme. Överför embryon till 100mm rätter med E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), lösning och inkubera vid 28 ° C i 6 timmar. Ta bort döda och obefruktade embryon, tillsätt färska E3-lösning, och inkubera över natten.
3. Sortera transgena embryon för ett liknande (24hpf) och enhetlig GFP uttryck. Array embryon individuellt i varje brunn på en 96-brunnar.
4. Ta bort överflödig E3-lösning med en mikropipett. Tillsätt 200μl av E3-lösning med en flerkanals pipett i varje brunn.
5. Lägg till följande föreningar som anges:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   En

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0,5 mm)

   2μl BCL (1 mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mm)

   2μl DMSO

   Slutlig koncentrationer 1μM, 5μM, 10μM, 20 mikroM, 25μM BCI i 1% DMSO. Täckplåt i aluminiumfolie och inkubera i 6 timmar vid 28 ° C.

2) Automatisk avbildning av plattor med 96 brunnar och analys.

1. Tillsätt 10μl av tricaine (0.61mM) i varje brunn att söva 30hpf embryon.
2. Lastskylt in Molecular Devices Imagexpress Ultra.
3. Öppna Metaxpress programvara. Välj en konfiguration med en 4x objektiv och största hål diameter, konfigurera laser autofokus för att upptäcka platta botten, och bestämma optimala Z-plan för att upptäcka områden av intresse. Hämta bilder på excitation / emission våglängder av 488/525 nm (GFP). Ställ skanningsområde som en enda plats 2000x2000 pixlar (4 x 4 mm) utan binning. Konfigurera laser makt och vinna så att ljusaste regioner i positiv kontroll bilderna inte mättad. Bekräfta korrekt bild förvärv i flera positiva och negativa kontrollbrunnarna.
4. Starta tallrik skanna. Instrumentet kommer automatiskt att få bilder från alla brunnar och arkivera dem i en SQL Server-databas.
5. Ladda upp bilder till Definiens Developer använder Cellenger ansökan modulen och en import filter som känner igen bildformatet och filstrukturen skapas av Molecular Devices Imagexpress Ultra plattform.
6. Bearbeta bilder med en färdig konstruerad Cognition Network Technology algoritm (även kallad en regeluppsättning). Algoritmen, som vi anpassade utvecklats utifrån en nyligen publicerad regeluppsättning ^2, är utformad för att automatiskt identifiera embryo, äggula och huvud, och att kvantifiera ljusstyrka och området GFP-uttryckande huvudet strukturer. Brunnar där ingen embryot upptäcks eller när huvudet inte entydigt kan tilldelas (till exempel med hög förening toxicitet eller oskarpa bilder) ingår inte i analysen. Konfigurera den algoritm som med hjälp av flera negativ kontroll bilder (fordon som behandlas) och positiva bilder kontroll (BCI behandlade) så att huvudet och äggula korrekt identifiering i båda. Ställ in ett "huvud strukturer" detektionsgränsen som multipler av menar äggula intensitet tills detektering av ljusa huvud strukturer matcher visuell observation. Definiera parametrar för att exportera. I detta exempel var den mest informativa parametern hela den integrerade ljusstyrka GFP-positiva regioner i huvudet, nedan kallad "total huvudet strukturer ljusstyrka" (figur 1).
   
   
   Figur 1
   Diagram depicitng den dosberoende effekter BCI på GFP uttryck i transgena embryon.
7. Kör algoritmen på alla platta bilder med den inbyggda jobbet schemaläggaren. Den Definiens Programvaran använder distribuerad databehandling på flera processorer ("motorer"), vilket möjliggör samtidig analys av flera bilder. Algoritmen beräknar numeriska åtgärder baserade på resultaten från de bildanalys, som sparas i databasen tillsammans med en kopia av den bearbetade bilden, tillämpas med analys.

Representativa resultat:

Efter alla bilder analyseras, kan data visualiseras i Cellenger eller exporteras till tredje parts programvara (Excel, GraphPad Prism) för vidare analys och grafisk presentation. Figur 2 visar arkiverade skanna bilder från ett behandlat fordon och en BCI-behandlas väl, med och utan CNT analys tillämpats. Figur 1 dokument en dosberoende effekt av BCI på GFP reporter genuttryck i Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embryon. Den koncentration som krävs för att framkalla en halv maximal respons (EC50) var cirka 12 mikroM.


Figur 2
Automatiserad Bildinsamling och analys av transgena zebrafisk embryon. (A) DMSO fordon behandlas Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 embryo 30hpf. (B) Transgena embryon som behandlats med 20 mikroM BCI visar ökningar av GFP uttryck. (C) Bild av embryon från (A) efter att ha kört Definiens regeluppsättning för att hitta GFP uttryck i huvudet. Orange fläckar beteckna där programvaran åtgärder GFP intensitet. (D) Bild av embryon från (B) efter att ha kört Definiens regeluppsättning för att hitta GFP uttryck i huvudet. Orange fläckar beteckna där programvaran åtgärder GFP intensitet. Observera att regeluppsättning kunde hitta ett utökat område av GFP uttryck i det behandlade embryot.

Discussion

En viktig faktor som begränsar genomströmningen av zebrafisk kemiska skärmar är bristen på metoder för att systematiskt bearbeta 96-brunnar för avbildning och analys. Eftersom bilder av flercelliga organismer är komplexa, låg kontrast och heterogena i naturen, befintliga bildanalys algoritmer misslyckas med att upptäcka och kvantifiera specifika strukturer inom organismen. De flesta publicerade zebrafisk kemiska skärmar innebär därför visuell undersökning av enskilda brunnar av hängivna personal under hela förfarandet. Detta förhindrar vanligtvis generationen av numeriska avläsning och en komplett arkivering av skärmbilder och data. Dessutom eliminerar manuell utvärdering flera viktiga fördelar av bild-screening, det vill säga förmågan att leda retrospektiva analyser av skärmens prestanda, för att undersöka fenotypiska förändringar som inte var det primära målet för screening kampanjen (t.ex. toxicitet eller utveckling fel) och att korsa referens screening data med tidigare eller framtida skärmar med samma förening bibliotek.

I denna rapport lyfter vi fram metodik för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk embryon multispot plattor utan att användaren behöver. Vi automatiserade Bildinsamling på en ImageXpress Ultra laserskanning konfokala läsare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) för att bilden Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embryon i 96 brunnar och utvecklat en algoritm bild analys baserad på Definiens "Cognition nätverksteknik som kvantifieras GFP uttryck i huvudet av transgena embryon. Metoden levereras graderade svar och kvantifieras in vivo aktivitet hos en liten molekyl aktivator av FGF signalering. Liknande resultat erhölls med epifluorescence-baserade ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) dokumentera att det är möjligt att genomföra automatiserade ta bilder zebrafisk embryon på olika kommersiellt tillgängliga plattan läsare ^2. Utvecklingen av metoder för att automatiskt analysera flercellig organism bilder eliminerat behovet av visuella poängsättning av den mänskliga observatören och gjorde det möjligt för generering och arkivering av numeriska data och bilder för retrospektiv analys och jämförelser med framtida skärmar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040