Summary
Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.
Abstract
살아있는 생물의 목표 화합물의 Photoactivation는 배아 개발, 세포 신호 성인 생리학 등 다양한 생물 학적 프로세스를 연구하는 귀중한 접근을 입증했다. 이러한 측면에서, 다중 광자 현미경의 사용은 하나의 세포 해상도 깊은 조직에서 주어진 빛의 반응 요원의 양적 photoactivation 수 있습니다. zebrafish 배아는 광학 투명으로, 그들의 발전은 생체내에서 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특성은 zebrafish 집중 조명하여 화학 약품과 단백질의 다양한 활동을 제어하기위한 완벽한 모델 생물합니다. 여기 차례로 우리가 살고 zebrafish의 배아에서 세포의 운명을 따를 수 있습니다 화학적 갇힌 플루오레신의 활성화를 유도하는 두 광자 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 관심의 세포를 찾아 정확하게 대상으로 라이브 유전자 랜드마크 (GFP)을 표현 배아를 사용합니다. 이 절차는 마찬가지로 단백질, 호르몬, 작은 분자 및 기타 갇힌 화합물의 정확한 빛의 유도 활성을 위해 사용될 수 있습니다.
Protocol
우리는 갇힌 플루오레신를 사용하여 셀 라벨링의 프로토콜을 설명하지만, 다른 사진 activatable 염료와 단백질은 비슷하게 사용할 수 있습니다.
1. 갇힌 플루오레신의 분사
- Dextran - 복합 4,5 - dimethoxy - 2 - nitrobenzyl (DMNB) 플루오레신를 (10,000 MW dextran, 음이온, Invitrogen, 분자 프로브, 칼스 배드, CA 갇힌의 5 % 주식 솔루션 (5mg 갇힌 - 플루오레신 / 100 μL 0.2M KCl) 준비 , 고양이. 아니. D - 3310). -20 ° C로 나누어지는 및 저장 DMNB - 갇힌 플루오레신은 빛에 민감하고 어둠에 보관해야합니다.
- 로 "zebrafish 도서"1에서 설명한 1% 아가로 오스 (시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. A9539)로 만든 주사 트러프를 준비합니다.
- 100 X E3 재고 솔루션을 diluting하여 E3 중간 2 리터를 준비합니다.
- 주입 전에 저녁에 photoactivation의 대상 세포를 집중하는 데 사용하는 가시 형광 랜드마크를 (GFP, RFP 등) 표현 원하는 유전자 변형 라인의 여성 (S)에서 남성 (들)을 분리 교배 새장을 준비합니다.
- micropipette 풀러를 (서터 악기, 노바토, CA, P - 97)를 사용 모세관 주입 바늘을 (필라멘트와 얇은 벽 유리 모세 혈관, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 고양이. 아니. TW100F - 6) 준비.
- 얼음에 갇힌 플루오레신을 5 % 나누어지는를 녹여.
- 1 % 최종 농도 0.2M KCl에 5% 갇힌 플루오레신 재고 솔루션을 희석하고, 얼음 계속. 빛의 노출을 피하십시오.
- 설치 짝짓기는 4 단계에서 준비 십자가.
- 즉시 그들이 낳은 그대로 수정된 달걀을 수집합니다. 아가로 오스의 사출 성형에 동양 한 세포 단계의 배아는 E3 1 입혔다.
- microloader 팁 (Eppendorf, 함부르크, 독일, 고양이. 아니. 5242 956.003) backfill 1% 갇힌 플루오레신 솔루션 ~ 1 μL와 주사 바늘을 사용합니다.
- 장소에 가스 공급 microinjector (공압 picopump, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, PV820). 부착된 micromanipulator에 바늘로드
- 2 3nl로 사출 볼륨을 조절하고 세포의 세포질에 직접 갇힌 - 플루오레신을 주입. 실험 50 배아 최소 주사.
- 28.5에서 어둠 속에 배아를 품어 ° 원하는 발달 단계에 E3에서 C. 24 시간 게시물 수정보다 오래된 배아를 분석하는 경우, 착색을 억제하는 (PTU, 시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. 22290-9) 0.1 % phenylthiourea를 추가합니다.
2. 배아가 장착
- (; 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다 솔루션 부분을 참조) 신선한 E2 솔루션을 준비합니다.
- E2 매체에 녹아있는 1퍼센트 아가로 오스의 얇은 레이어 코팅 60mm 페트리 요리.
- 2퍼센트 낮은 융점 아가로 오스 (.. 울트라 퓨어 LMP 아가로 오스, Invitrogen, 칼스 배드, CA, 고양이도없는 16,520,100)의 삽입을 준비 : 끓는까지 마이크 로파 가열에 의해 살균 이중 증류수의 아가로 오스를 해산. 가열하는 동안 튜브의 뚜껑을 열어 두세요. 나누어지는 1 microcentrifuge 튜브에 ML 72에서 가열 블록의 유지 ° C.
- 부드럽게 날카로운 집게 (제 5)와 간격 chorion를 당기는하여 태아의 chorions를 제거합니다. (단계 2 참조) 한천 - 코팅 접시에 E2 솔루션 배아 보관하십시오. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 Dechorionated 배아는 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 취급해야합니다. 이 배아는 액체 표면 장력에 의해 손상될 수 있습니다로 공기에 dechorionized 배아를 노출하지 마십시오.
- E2의 작은 볼륨이 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택된 배아를 수집하고, 60mm 페트리 접시에 배아를 놓으십시오. 배아 옆에 2퍼센트 아가로 오스의 드롭 (~ 150 μL) (3 단계)을 탑재합니다. 신속하게 동질적인 최종 ~ 1 % 아가로 오스의 혼합물을 얻기 위해 두 방울을 섞어 배아는 객관적 렌즈를 직면하고 자사의 지느러미 측면과 해부 현미경의 방향을 사용합니다.
- 아가로 오스가 확정 때까지 기다렸다가 포함된 배아가 액체에 빠져들 때까지 E2 매체를 추가합니다. 이것은 그것이 photoactivation 과정 후 아가로 오스의 공개 수 있으므로 요리마다 하나의 배아를 얻는 것이 좋습니다.
3. Photoactivation
- 우리는 자이스 혈구 LSM 510 NLO META 두 광자 조정할 수있는 광대역 (700 - 1020nm) Spectraphysics에서 마이 타이 - HP - femtosecond 레이저가 장착된 현미경을 사용합니다.
- 현미경 접시 홀더에 장착 배아를 놓습니다. 배아의 형광 획기은 40x/0.8W Achroplan 물을 사용하면 목표를 포장되어 시각이다. 우리가 500 550nm의 대역 통과 필터 (BP)과 비 descanned 감지기 (NDD)를 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.
- photoactivation 과정에 대한 전제 조건으로 860nm의 2 광자 레이저 파장 (GFP 감지)와 함께 발견 형광 신호의 지느러미 부분에 가장 복부의 이미지 시리즈를 인수함으로써 관심 영역의 공간적 형광 정보를 얻습니다. 이를 위해 충분한 해상도는 각 인수 초점 평면 사이 6μm의 기간을 사용하여 얻을 수있다.
- 대상을 선택photoactivation에 대한 Z - 비행기와 초점에이 지역을 가지고. 실험의 목적에 따라 관심의 지역 내에서 또는 GFP 볼 수 밖에 랜드마크 중 하나가 될 수 있습니다. 이 Z - 평면에서 하나의 이미지를 가져가라. 이미지를 저장하고 별도의 창에서 열어 유지.
- 720nm로 두 광자 레이저 파장을 설정하고 레이저는 '수정 표백제'메뉴를 열고 잠금 모드에있을 때. '정의 지역'메뉴를 사용하여 860nm (4 단계)에서 촬영한 이미지에 따라 photoactivation에 대한 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 그것은 후자 작업은 X, 관찰 필드의 Y 위치를 변화 720nm에 레이저 파장을 이동 후이 이미지에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택하는 데있어 매우 중요합니다.
- (9 단계 참조) '편집 표백제'메뉴에서 photoactivation에 대해 다음 매개 변수를 조정 :) 상대 레이저의 파워, 반복 B) 번호, C) 스캔 속도.
- 눌러 '수정 표백제'창에 '블리치'및 레이저 멈출 때까지 기다립니다.
- 860nm로 다시 전환, 결과 photoactivated 재료와 활성화된 도메인의 Z - 폭 (두께) 평가하기 위해 이미지 수집의 두 번째 시리즈의 강도를 평가하는 하나의 평면 이미지를 획득.
- photoactivation에 대해 다음 매개 변수를 고려 :
- 레이저 강도와 photoactivation 기간 : 하나는 경험적으로 두 개의 매개 변수를 변화하여 photoactivation을위한 최적의 조건을 결정한다. 상대 레이저의 파워는 음향 광학 변조기 (AOM) 전송에 의해 제어할 수 있습니다. photoactivation의 기간은 반복 및 스캔 속도의 수를 기능입니다.
- uncaged 형광의 포화를 피하기 위해 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다.
- uncaged 분자의 형광 강도를 획득하고 photoactivated 복제 2 Z - 축 스팬 사이에 선형 상관 관계가있다.
4. Uncaged 플루오레신의 감지
- photoactivation 후 28.5에서 어둠 속에서 배아를 인상 ° E2 매체에서 C는 피부 착색의 모양을 방지하기 위해 PTU 0.1 %를 포함.
- 원하는 발달 단계에서, 해부 현미경 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 지적 메스를 사용하여 "V"는 배아의 머리쪽으로 향하고있다 있도록 배아 근처 아가로 오스에 "V"모양의 절개를 만듭니다. 배아의 머리 근처에있는 "V"의 시점에서 닫힌 집게를 놓고 부드럽게 배아의 길이를 따라 아가로 오스를 분리하고 중간에 배아를 발표 포셉을 열고 밀고.
- 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 배아를 수집하고 paraformaldehyde (PFA, 1 X PBS, PH 7.2의 4 %)로 수정 4 3 상온에서 시간 또는 하루 중 대한 ° C.
- 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 적어도 5 분 PBST에 2-3 번 씻어.
- 적어도 2 시간을 위해 -20 ° C에서 신선한 메탄올과 부화로 보충, 10 분 100 % 메탄올로 배아를 씻으십시오.
- 80%, 60 %, 40 % 및 20 % PBSTr에 희석 메탄올의 일련의 연속 incubations (5 분 각각)에 의해 배아를 Rehydrate. PBSTr 2 X 10 분 씻으십시오.
- 차단 솔루션을 500 μL에 실온에서 30 분 알을 품다.
- 솔루션을 차단으로 1:500 희석 방지 플루오레신 - 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP = 연합 뉴스) 팹의 조각을 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 안돼. 11,426,338,910) 추가 4 밤새 품어 ° C (그들 면이 장소 microcentrifuge 튜브) .
- PBST 5 X 15 분 씻으십시오.
- TNT에서 0.2M NaCl 5 분 씻으십시오.
- TNT에서 0.4M NaCl 5 분 씻으십시오.
- 신선한 Prestain 솔루션 3 X 5 분 평형.
- 2 ML Prestain 솔루션에서 한 빠른 레드 타블렛 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 아니. 11,496,549,001) 디졸브. 그것은 유엔 - 해산 입자를 생략 왓먼 제 2 종이를 사용하여 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 또는 솔루션을 스핀 다운하고 맑은 뜨는 액체를 사용합니다.
- 500 μL 패스트 레드 상온에서 어둠 속에 품어 각 튜브에 솔루션, 그리고 모니터 색상 개발 원하는 신호 대 배경 비율이 (몇 시간 20 분)에 도달할 때까지 추가합니다. 배경이 개발하는 경우, 4로 전송 ° C. 부화 한 시간 후에, 새로운 패스트 레드 얼룩 솔루션을 보충.
- 3 X 5 분 얼룩 반응을 중지 PBST로 씻는다.
- 상온에서 4퍼센트 PFA에 20 분 수정.
- PBST 2 X 5 분 씻으십시오.
- 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 글리세롤을 통해 지우기 배아가 배아 때까지 튜브의 아래쪽에 정착하고 있습니다. 배아는 몇 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
5. Uncaged 지역의 형광 시각화
- 장착을위한 현미경의 슬라이드를 준비 : 1 ML의 주사기가 서로 ~ 15mm의 거리에서 배치 슬라이드 맑은 실리콘 그리스 네 가지 명소를 적용 사용합니다. cente에서 배아 마운트R의 75 % 글리세롤 장소 coverslip (제 0; 18x18mm)의 ~ 200 μL에서 상단과 글리세롤 솔루션 슬라이드 사이의 표면을 점유 때까지 부드럽게 실리콘에 대해 그것을 밀어.
- 무대에 탑재된 배아를 놓고 40x 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. 488nm 아르곤과 여기 소스로 543nm HeNe 레이저를 사용하여 이미지의 공촛점 Z - 시리즈를 취득.
- photoactivatated 도메인의 Z 축 범위는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 uncaged 배아의 3D 재구성을 사용하여 분석하실 수 있습니다.
6. 솔루션
| 100 X E3 | 174mM NaCl, 21mM KCl, 장총 MgSO 4, 18mM 칼슘 (NO3), 15mM HEPES, pH를 = 7.4. 4 여과하고 저장하여 소독 ° C |
| 20 X E2 | 0.3M NaCl, 10mM KCl, 실온에서 20mM CaCl 2 * 2HOH, 20mM MgSO 4 * 7HOH, 3mM KH 2 PO 4, 0.8mM 나 2 HPO 4 * 2HOH, 여과물 및 저장 |
| 1 X E2 | 이중 증류수 20 X E2를 희석하고 신선한 NaHCO 3 (0.7mM의 최종 농도), 페니실린과 스트렙토 마이신 (페니실린 및 ML 당 100mg 스트렙토 마이신 (Invitrogen의 100U를 포함 한 X의 최종 농도로 희석 펜 strep 솔루션을 만들어 추가 , 칼스 배드, CA, 고양이. 아니. 15140-122)) |
| PBST | 0.1 % PBS에서 트윈 - 20 |
| PBSTr | PBS에 0.3 % 트리톤 |
| 차단 솔루션 | 10% BSA, 0.3 % 트리톤, PBS에 1퍼센트 DMSO |
| TNT | 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 7.5, 150mM NaCl, 0.5 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 |
| Prestain 솔루션 | 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 8.2, 0.4M NaCl, 0.1 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 |
7. 대표 결과
생활 zebrafish 배아에서 요원을 photoactivate하는 두 광자 현미경의 사용 예제는 제공됩니다. 비슷한 접근법을 사용 우리는 이전에 zebrafish의 두뇌 2,3에 photoactivated 레이블 신경 progenitors의 혈통을 추적. : 살아있는 본질적인 랜드마크 역할을 GFP transgene 기자, : 그림 1은 neurog1를 들고 zebrafish 배아의 앞쪽에 신경 접시에 갇힌 플루오레신 복합 추적 염료의 photoactivation을 보여줍니다.
배아는 세포 하나의 단계에서 갇힌 플루오레신 주사와 버드 단계에서 아가로 오스에 포함되었습니다. 3 - 5 - 체절 단계 공간 좌표 neurog1로 측정되었습니다 : GFP 형질 전환 배아는 (그림 1A, A ') uncaging에 대한 관심의 영역 (ROI)을 확인합니다. 우리는 신경 플레이트 (그림 1B, B ')의 특정 도메인에서 플루오레신 혈통의 추적기 uncaged. 그 후,이 주어진 표시 신경 전구 하위 도메인의 운명은 uncaged 플루오레신 (그림 1C, C ')의 immunostaining으로 prim5 (24 시간 게시물 수정) 단계에서 결정되었다.
두 광자 레이저 uncaging의 범위는, uncaged 형광과 photoactivated 도메인 (Z - 스팬)의 두께의 강도 즉, 두 개의 매개 변수를 조정하여 제어할 수 : 레이저 강도와 기간. 후자는 (; 러섹 - 블럼 2009 년 제 3 단계 9 참조) 반복 번호와 스캔 속도의 조절에 의해 제어할 수 있습니다. 그림 1에 표시된 예제에서, 우리는 25.6 μsec / 픽셀의 상대적인 레이저 12 % AOM 전송 전력, 20 반복과 속도를 검사를 사용합니다. 이러한 설정을 사용하여 우리는 9-10 세포와 30μm의 photoactivated Z - 스팬 (~ 1-2 셀 행)이있는 투자 수익 (ROI)을 표시.
그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 라이브 zebrafish 배아에 갇힌 플루오레신의 photoactivation의 대표 결과.
도식 일러스트 (AC)과 photoactivation 프로세스의 대표 이미지 (A' - C '). 한 세포 단계에서 갇힌 플루오레신 추적 염료를 주사 맞은 (GFP : neurog1) zebrafish 배아를 (A, A ') neurogenin - 1 프로 모터의 제어하에 표현 GFP 살고 있습니다. 3-5에서 - 체절 단계, forebrain primordium (diencephalon)의 이산 지역은 photoactivated되었으며 uncaged 플루오레신 추적 염료 (B, B ') 감지 수 있습니다. photoactivation 절차 이후에, 배아는 ° C와 uncaged 플루오레신을 포함한 뇌 세포가 24 시간 게시물 수정 (; C, C 'HPF)에서 안티 플루오레신 immunostaining에 의해 추적되었다 28.5에 incubated했다. 디엔, Diencephalon;. 전화, Telencephalon..
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Discussion
사진 activatable 화합물은 누구 함수들은 생물 학적 또는 화학적으로 활성화된 상태로 분자를 변환하는 광화학 반응을 유도하는 특정 파장 (보통 UV)와 조명까지 가면됩니다 분자 수 있습니다. 정품 인증이 정확하게 빛을 자신의 노출을 제한함으로써 temporally하고 공간 제어 수 있으므로 이러한 프로브는 세포 생물학 연구에 매우 강력한 도구를 제공합니다.
다중 광자 현미경의 큰 장점은 상대적으로 깊은 광학 침투 및 감소 특이 현상이 phototoxicity입니다. 활성화 프로세스, 낮은 에너지의 두 광자가 동시에 사진 activatable 복합에 의해 흡수해야합니다. 이러한 이벤트의 확률이 광자 밀도에 따라 달라집니다로서, 정품 인증 초점 비행기로 제한 남아 있습니다. 활성화 지역은 따라서 선택적으로 조직 내에서 정의된 볼륨에서 조작할 수 있습니다.
우리는 살아 zebrafish의 배아에서 두 광자 현미경을 사용하여 갇힌 플루오레신의 photoactivation을위한 프로토콜을 제시한다. 특정 예제에서 우리는 초기 배아 단계에서 세포를 표시하고 이후 개발 zebrafish의 두뇌에있는 레이블 세포의 혈통을 추적하기 위해 갇힌 - 플루오레신 광분해을 유발하는 두 광자 현미경을 사용하여 여기에 표시됩니다. 두 광자 기반 photoactivation Z 축 4,5의 세포와 해상도 부족의 몇 수만에 추적기 색소의 활성화 결과 레이저와 플래시 램프에 의해 photoactivation 비교의 공간적 해상도를 도달할 수 proximally 1-2 셀 행 2,3의 축 해상도를 얻기 몇 micrometers.
절차는 여기에 살아있는 견본의 단일 셀 해상도 화합물의 다양한 활성화를 위해 활용할 수 보도했다. 예를 들어, 가에데 단백질은 마찬가지로 녹색에서 빨간색 fluorescenct 단백질 6,7하기 위해 photoconversion 다음 레이블 전지하는 데 사용할 수 있습니다. 적용할 수있는 다른 가벼운 활성 단백질의 연결 활동 8과 같은 빛을 조사 구에 따라 세포 죽음을 유도 KillerRed로 photosensitizers 보죠 수있는 가벼운 게이 티드 이온 채널, Channelrhodopsin를 포함합니다.
갇힌 분자의 다양한 세포와 세포 내 화합물 10의 조작에 의해 생리적 프로세스의 변조를있게보고되었습니다. 이들은 적극적인 신경 전달 물질 (예 : 글루 탐 산염 11,12)와 두 번째 사자 (예 : 칼슘 13)과 스테로이드 호르몬 (예 : retinoic 산성 14) 등이 있습니다. 마지막으로, zebrafish의 유전자 활성화와 입을의 사진 중재 컨트롤이 도입되었습니다. 갇힌 안티 센스 oligonucleotides (morpholinos)와 RNAS의 2 광자 기반 photoactivation는 라이브 zebrafish 배아 15,16의 제한된 세포 인구의 유전자 최저 및 이득의 기능을 사용할 수 있습니다.
요컨대, 라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자 기반의 사진 인증은 : 1) X, Y, Z의 도끼 두명 셀 행을 정확 - 하나. 2) 정량 - photoactivation의 정도는 제어할 수 있습니다. 3) 다목적 월 사진 컨버터블 단백질의 다양한 적용됩니다.
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Acknowledgments
친절 neurogenin1 기자 라인을 제공 UWE Strahle하고, Vyacheslav Kalchenko, 더글러스 루츠, 그리고 두 광자 uncaging와 함께 기술적 조언 및 지원 레오 Roitman,, Maayan Tahor 및 기술 지원 Suliman Elsadin 감사 그림 그래픽 Genia 브로드 스키에 의한 아르 이 원고에 대한 의견을 아모스 Gutnick. 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 928/08)와 해리엇 & 마르셀 데커 재단, Levkowitz 실험실의 연구는 독일 - 이스라엘 재단 (부여 번호 2,007분의 183)에 의해 지원됩니다. GL은 바이오 메디컬 연구에 타우 경력 개발 위원장의 재직입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments, Inc. | PV820 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | 22290-9 | |
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | |
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche Group | 11426338910 | |
| Fast Red | Roche Group | 11496549001 |
References
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