Summary
多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。
Abstract
生体内のターゲット化合物の光活性化は、胚発生、細胞内シグナル伝達と成人の生理学など様々な生物学的プロセスを調査するために貴重なアプローチを証明しています。この点では、多光子顕微鏡の使用は、単一のセルの解像度で深部組織に与えられた光反応剤の定量的な光活性化が可能になります。ゼブラフィッシュの胚は、光学的に透明であるため、その開発は、 生体内で監視することができます。これらの特性は、ゼブラフィッシュ集束光による化学物質やタンパク質の様々な活動を制御するための完璧なモデル生物にします。ここでは、順番に私たちが生きてゼブラフィッシュの胚では細胞の運命に従うことができるように化学的にケージフルオレセイン、の活性化を誘導するために二光子顕微鏡の使用を説明します。我々は、関心の任意のセルを検索し、正確にターゲットとするライブ遺伝的ランドマーク（GFP）を発現する胚を使用してください。この手順は、同様にタンパク質、ホルモン、低分子化合物と他のケージド化合物の正確な光誘導活性化のために使用することができます。
Protocol
我々は、ケージドフルオレセインを用いた細胞標識のプロトコルを記述する、しかし、他の写真-活性化可能な染料とタンパク質が同様に使用することができる。
1。リテーナフルオレセインの注入
- フルオレセイン（10,000 MWデキストラン、アニオン、インビトロジェン、分子プローブ、カールスバッド、カリフォルニア州のケージデキストラン-共役4,5 - ジメトキシ-2 - ニトロベンジル（DMNB）の5％ストック溶液（/ 100μL0.2MのKCl -フルオレセインをケージ5mgを）準備する、カタログ番号D - 3310）。 -20℃で分注し店DMNB -ケージフルオレセインが光に敏感であり、暗所に保管する必要があることに注意してください。
- として"ゼブラフィッシュの本"1で説明した1％アガロース（シグマ、セントルイス、MO、カタログ番号A9539）製の注射の谷を準備します。
- 100 × E3ストック溶液を希釈することにより、E3培地の2リットルを準備する。
- 注射の前の夜に、光活性化のために標的細胞をローカライズするために使用される可視蛍光目印を（GFP、RFPなど）を発現する目的のトランスジェニックラインの女性から男性（S）（S）を分離交尾ケージを用意する。
- マイクロピペットプラー（サッターインストゥルメント、ノヴァト、CA、P - 97）を用いてキャピラリー注射針（細いフィラメントと壁ガラス管、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州、猫。無し。TW100F - 6）を準備する。
- 氷の上の5％ケージフルオレセインのアリコートを解凍。
- 1％の最終濃度になるように0.2MのKClの5％ケージフルオレセインのストック溶液を希釈し、氷上に置きます。光暴露を避ける。
- セットアップの交配は、ステップ4で作成した交差させる。
- とすぐにそれらが配置されるように受精卵を収集する。 E3 1で重ねアガロースの射出成形金型におけるオリエント1細胞期の胚。
- microloaderチップ（エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ、カタログ番号5242 956.003）埋め戻し1パーセントケージフルオレセイン溶液の約1μLと注射針を使用。
- 場所は、ガソリンインジェクター（空気picopump、世界精密機器、サラソタ、フロリダ州、PV820）に接続されたマイクロマニピュレータに針をロードされます。
- 2 - 3nlに注入量を調整し、細胞の細胞質に直接ケージ-フルオレセインを注入する。実験50胚の最小値を注入する。
- 28.5で暗闇の中で胚をインキュベートします希望の発達段階にE3のC。 24時間後に受精よりも古い胚を分析している場合は、色素沈着を抑制する（PTU、シグマ、セントルイス、MO、カタログ番号22290〜9）0.1％フェニルチオ尿素を追加。
2。取付胚
- （;週間は4℃で保存することができるソリューションの一部を参照）新鮮なE2溶液を調製。
- E2の培地に溶解した1％アガロースの薄い層でコーティング60ミリメートルのペトリ皿。
- 2％低融点アガロース（。。ウルトラピュアLMPアガロース、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ番号16520100）のための埋め込みを準備します。沸騰するまで、マイクロ波加熱によって滅菌再蒸留水でアガロースを溶解する。加熱時にチューブのキャップが開いたままにしておきます。一定分量1マイクロ遠心チューブに添加し、72℃の加熱ブロックを保つ℃の
- 優しく鋭いピンセット（5番）と離れて絨毛膜を引いて、胚のchorionsを削除します。寒天でコーティングされたディッシュ上E2溶液中で胚を維持する（ステップ2を参照）。彼らはポリプロピレンのピペットに付着可能性があるのでDechorionated胚は、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて処理する必要があります。これらの胚は液体の表面張力によって損傷する可能性があるので、空気にdechorionized胚を放置しないでください。
- ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いてE2の小さな容積で選択した胚を収集し、と60mmペトリ皿に胚を置く。胚横2％アガロースの低下（〜150μL）（ステップ3）をマウントします。素早く均一な最後の〜1％アガロースの混合物と胚は、対物レンズが直面して、その背側を解剖顕微鏡の向きを使用してを得るために2滴を混ぜる。
- アガロースが固化するまで待機し、埋め込まれた胚を液体に浸漬されるまで、E2の培地を加える。それは、それが光活性化処理後にアガロースから解放されている場合を皿ごとに単一胚を得ることが好ましい。
3。光活性化
- 我々はツァイスLSM 510 META NLO二光子調整可能なブロードバンド（700 - 1020nm）Spectraphysicsからマイタイ- HP -フェムト秒レーザーを装備した顕微鏡を使用してください。
- 顕微鏡下のプレートホルダーに取り付けられた胚を置きます。胚の蛍光ランドマークは、可視化を使用して40x/0.8W Achroplanの水が客観的に浸漬される。次の手順のために我々は500 - 550nmの帯域通過フィルタ（BP）と非デスキャン検出器（NDD）を使用します。
- 光活性化のプロセスの前提条件として、860nmの二光子レーザー波長（GFPの検出用）で検出された蛍光シグナルの背の部分に最も腹側からのイメージのシリーズを取得することによって関心領域の空間的な蛍光情報を取得する。この目的のために、十分な分解能は、それぞれ取得した焦点面との間の量6μmのスパンを使用して取得することができます。
- ターゲットを選択します。光活性化のためのz平面と焦点にこの領域をもたらす。実験の目的に応じて、関心領域は、GFP可視ランドマークの内部または外部のいずれかです。このz -平面内の単一のイメージを取る。画像を保存し、それが別のウィンドウで開いておきます。
- 720nmに2つの光子レーザーの波長を設定し、レーザーが"編集漂白剤"メニューを開き、モードロックのとき。 "定義した領域"メニューを使用して860nm（ステップ4）で撮影した画像によると光活性化のために関心領域（ROI）を定義します。それは、観測されたフィールドのx、yの位置後者の行動の変化として720nmにレーザーの波長をシフトした後、この画像上にROIを選択することが重要です。
- （手順9を参照）"編集漂白剤'メニューで光活性化のための次のパラメータを調整します。）相対的なレーザーパワー、反復のb）の数と、c）のスキャンスピード。
- プレス"編集漂白剤"ウィンドウで"ブリーチ"とは、レーザーが停止するまで待ちます。
- 860nmに切り替えて、結果として光活性物質および活性化ドメインのZ -スパン（厚さ）を評価するための画像取得の第二シリーズの強度を評価するために、単一の平面画像を取得する。
- 光活性化のための以下のパラメータを考慮してください。
- レーザー強度と光活性化の持続期間：一つは、経験的に二つのパラメータを変化させることにより光活性化のための最適条件を決定する必要があります。相対的なレーザパワーは、音響光学変調器（AOM）送信で制御することができます。光活性化の持続期間は、反復と走査速度の数の関数です。
- uncaged蛍光の飽和を避けるために、蛍光強度の直線性の範囲を決定します。
- uncaged分子と光活性化クローン2のz軸スパンの得られる蛍光強度の間に線形相関がある。
4。 Uncagedフルオレセインの検出
- 光活性化した後、28.5、暗所での胚を上げる° E2の培地のCは、皮膚の色素沈着の出現を防ぐためにPTUを0.1％含む。
- 目的の発達段階では、解剖顕微鏡下でアガロースから胚を削除します。先のとがったメスを使用して、"V"は胚の頭部方向を向いているように胚の近くにアガロースの"V"字型切開を作成します。胚の頭部の近くに"V"の時点で閉鎖鉗子を置き、静かに鉗子胚の長さに沿ってアガロースを分離し、培地に胚を放出を押し開ける。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットで胚を収集し、パラホルムアルデヒド（PFA; 1 × PBS、pH7.2中4％）で固定して4℃で3室温で数時間または一晩のどちら° Cの
- 固定液を取り出して、室温で少なくとも5分間PBSTで2〜3回すすいでください。
- 少なくとも2時間、-20℃で新鮮なメタノールとインキュベートして補充する、10分間、100％メタノールで胚を洗浄してください。
- 80％、60％、40％、20％：PBSTrで希釈メタノールの一連の連続するインキュベーション（5分ごと）で胚を再水和。 PBSTrで2 × 10分間洗浄します。
- ブロッキング溶液500μLで、室温で30分間インキュベートする。
- ブロッキング溶液で1:500に希釈した抗フルオレセイン-アルカリホスファターゼ（AP）Fabフラグメント（Roche社、パロアルト、カリフォルニア州、カタログ番号11426338910）を、追加し、4℃で（彼らの両側に位置マイクロ遠心チューブを）一晩インキュベートする。
- PBSTで5 × 15分間洗浄します。
- TNTの0.2M NaCl中で5分間洗浄する。
- TNTの0.4M NaCl中で5分間洗浄する。
- 新しく調製したPrestain溶液中で3 × 5分間平衡化させます。
- 2mLのPrestainのソリューションで1つのファストレッド錠を（ロシュ、パロアルト、カリフォルニア州、カタログ番号11496549001）に溶かす。それは非溶解粒子を省略することがワットマン2号紙を使用してソリューションをフィルタリングすることをお勧めします。また、スピンダウンして溶液を収集し、上澄み液を使用してください。
- 希望信号対バックグラウンド比が（数時間〜20分）に達するまで各室温で暗所でインキュベートチューブ、、とモニターの色の開発に500μLのファストレッド溶液を加える。背景が発症した場合、4℃に移すインキュベーションの1時間後、新しいファストレッド染色液で補充する。
- 3 × 5分で染色反応を停止するには、PBSTで洗浄する。
- 室温で4％PFAで20分間固定する。
- PBSTで2 × 5分間洗浄します。
- 25％、50％とPBSの75％グリセロール、一連の明確な胚の胚がチューブの底に落ち着くまで。胚は数日のために4℃で保存することができる。
5。 Uncagedエリアの蛍光可視化
- 取付け用顕微鏡のスライドを準備：1 mLシリンジが互いに〜15mmの距離に置かれたスライド上に透明なシリコーングリースの4つのスポットを、Applyを使用した。 centeで胚をマウントします。R 75％グリセロールと場所カバースリップ（第0; 18x18mm）の〜200μLの上でトップとグリセリン溶液は、スライド間の表面を占めるまでゆっくりシリコンに対してそれを押す。
- ステージ上にマウントされている胚を置き、40倍対物レンズを用いて焦点にそれをもたらす。 488nmのアルゴンと励起光源として543nmのHeNeレーザーを使用して画像の焦点Z -シリーズを取得する。
- photoactivatatedドメインのz軸のスパンは、画像解析ソフトを使用してuncaged胚の3D再構成を用いて分析することができます。
6。ソリューション
| 100 × E3 | 174mMのNaCl、21mmのKClを、12mmのMgSO 4を用い 、18mmのカルシウム（NO3）、15mmのHEPES、pH値= 7.4。 4でろ過し、店舗で滅菌° C |
| 20 × E2 | 0.3MのNaCl、10mMのKClを、20mMのCaCl 2の * 2HOH、20mMのMgSO 4を * 7HOH、3mmのKH 2 PO 4、0.8のNa 2 HPO 4 * 2HOH、ろ液と室温で保管 |
| 1 × E2 | 再蒸留水で20 × E2を希釈し、新鮮なのNaHCO 3（0.7mmの最終濃度）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ペニシリンとmL当たり100mgのストレプトマイシン（Invitrogen社の100Uを含む1 ×の最終濃度に希釈ペンの連鎖球菌のソリューションを作ったして追加、カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ番号15140-122）） |
| PBST | 0.1％Tween - 20をPBSで |
| PBSTr | PBSで0.3％のトリトン |
| ブロッキング溶液 | PBS中10％BSA、0.3％トリトン、1％DMSO |
| TNT | 100mMのトリス- HClのpH - 7.5、150mmの塩化ナトリウム、0.5％蒸留水のTween - 20 |
| Prestainソリューション | 100mMのトリス- HClのpH - 8.2、0.4M塩化ナトリウム、0.1％蒸留水のTween - 20 |
7。代表的な結果
生きているゼブラフィッシュの胚でエージェントを光活性化するために二光子顕微鏡の使用の例が提示される。同様のアプローチを用いて、我々は、以前にゼブラフィッシュの脳の2,3の光活性化標識された神経前駆細胞の系譜を追跡した。 ：ライブ本質的なランドマークとして役立ったGFPレポーター遺伝子、 図 1にneurog1を運ぶゼブラフィッシュ胚の前方神経板でケージフルオレセインコンジュゲートトレーサーの染料の光活性化を示しています。
胚は、1つの細胞の段階でケージフルオレセインを注射し、芽の段階でアガロースに包埋した。 3時- 5体節期の空間座標はneurog1で測定した：：GFPトランスジェニック胚では（図1A、'）アンケージングのために関心領域（ROI）を決定する。我々は、神経板（図1B、B'）の特定のドメイン内のフルオレセインの系統のトレーサーをuncaged。その後、この特定のラベルが付いた神経前駆サブドメインの運命はuncagedフルオレセイン（図1C、C'）の免疫染色によってprim5（24時間後に受精）の段階で決定した。
二光子レーザーアンケージングの程度は、二つのパラメータを調整することによって制御することができる、uncaged蛍光と光活性化ドメインの厚さ（Z -スパン）の強度、すなわち：レーザー強度と持続時間を。後者は繰り返しの数と走査速度の調整（; Russek -ブラム、2009パート3、手順9を参照）によって制御することができます。図1に示す例では、我々は25.6マイクロ秒/ピクセルの相対的なレーザーの12％AOMの送信の電力、20回の繰り返しと速度をスキャンを使用。これらの設定を使用して、我々は9〜10細胞と30μmのの光活性化のz -スパン（1〜2セルの行）を含むROIのラベルが付いた。
図1二光子顕微鏡を使用して、ライブゼブラフィッシュ胚におけるケージフルオレセインの光活性化の代表的結果。
模式図（AC）と光活性化のプロセスの代表的な画像（A' - C'）。 1細胞の段階でケージフルオレセイントレーサー色素を注入した。neurogenin - 1プロモーター（GFP：neurog1）の制御下にGFPを発現している（、'）ゼブラフィッシュの胚を生きる。 3月5日で - 体節期、前脳原基（間脳）の離散的な領域は、光活性化したとuncagedフルオレセイントレーサー染料は（B、B'）を検出することができた。光活性化の手順に続いて、胚が28.5℃でインキュベートしたuncagedフルオレセインを含むCと脳細胞が（; C、C'HPF）受精後24時間目に抗フルオレセイン免疫染色によって追跡した。ディーン、間脳、。電話番号、終脳。。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
写真-活性化可能化合物は、その機能は、それらが特定の波長（通常UV）を照射されるまで、生物学的または化学的に活性な状態に分子を変換する光化学反応を誘起する、マスクされている分子である。アクティベーションが正確に光への露出を制限することにより、時間的空間的に制御できるので、これらのプローブは、細胞生物学の研究で非常に強力なツールを提供しています。
多光子顕微鏡の大きな利点は、比較的深く、光浸透と低非特異的光毒性です。アクティベーションプロセスのために、低エネルギーの2つの光子が同時に光活性化可能化合物によって吸収されている必要があります。そのような事象の確率は光子密度に依存するように、活性化が焦点面に限定されたまま。活性化領域は、したがって、選択的に組織内で定義されたボリュームで操作することができます。
我々は生きてゼブラフィッシュの胚における二光子顕微鏡を用いてケージフルオレセインの光活性化のためのプロトコルを提示する。特定の例では、初期胚の段階で細胞をマーキングし、その後の開発ゼブラフィッシュの脳における標識細胞の系統を追跡するためにケージ-フルオレセインの光分解を誘導するために二光子顕微鏡を使用するここに示す。二光子ベースの光活性化のz軸4,5の細胞と解像度の不足数十、にトレーサー色素の活性化をもたらすレーザーとフラッシュランプによる光活性化と比較しての空間分解能に到達することができます数マイクロメートルの近位に一から二セルの行2,3の軸方向の分解能を得ることができる。
ここに報告された手順は、生きたままの標本内の単一セルの解像度で種々の化合物の活性化に利用することができます。例えば、カエデ蛋白質も同様に緑から赤fluorescenctタンパク質6,7への光変換は、次のラベルの細胞に使用することができます。適用可能な他の光活性化タンパク質は、神経活動8と、光照射9時の細胞死を誘導するようなKillerRedなどの感光を、調節することができる光依存性イオンチャネル、Channelrhodopsinを、含まれています。
ケージ様々な分子は細胞外と細胞内の化合物10の操作により、生理学的過程の調節を可能にする、報告されている。これらは、アクティブな神経伝達物質（例えばグルタミン酸11,12）とセカンドメッセンジャー（カルシウム13）とステロイドホルモン（例えば、レチノイン酸14）などがあります。最後に、ゼブラフィッシュの遺伝子の活性化及びサイレンシングの写真を介した制御が導入されました。ケージアンチセンスオリゴヌクレオチド（モルフォ）とRNAの二光子ベースの光活性化は、ライブゼブラフィッシュの胚15,16の制限された細胞集団における遺伝子のノックダウンと機能獲得のために使用することができます。
合計では、ライブのゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの写真 - アクティベーションがある：1）のx、y、z軸に沿って2つのセルの行への正確な一。 2）定量 - 光活性化の程度を制御することができます。 3）汎用性 - 可能性の光転換様々なタンパク質に適用される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
親切にneurogenin1レポーターのラインを提供するためのウーヴェStrahleと、ヴャチェスラフKalchenko、ダグラスルッツ、そして二光子アンケージングによる技術的な助言と支援のためのレオニードRoitman; Maayan Tahorと技術支援のためのSuliman Elsadinおかげで図グラフィックスのためのGENIAブロツキーによるものであるこの原稿でのコメントのアモスGutnick。イスラエル科学財団（助成番号928/08）とハリエット＆マルセルデッカー財団、Levkowitzラボでの研究は、ドイツとイスラエル財団（助成番号2007分の183）によってサポートされています。 GLは、生物医学研究におけるタウロのキャリア開発委員長の責務であると信ずる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments, Inc. | PV820 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | 22290-9 | |
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | |
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche Group | 11426338910 | |
| Fast Red | Roche Group | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J.
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
