Summary
Multiphoton mikroskopi tillåter kontroll av låg energi fotoner med djup optisk penetration och minskad fototoxicitet. Vi beskriver användningen av denna teknik för levande cell märkning i zebrafisk embryon. Detta protokoll kan lätt anpassas för foto-induktion av olika ljus-känslig molekyler.
Abstract
Fotoaktivering av mål föreningar i en levande organism har visat sig vara en värdefull metod för att undersöka olika biologiska processer som embryonal utveckling, cellulär signalering och vuxna fysiologi. I detta avseende möjliggör användning av multi-foton mikroskopi kvantitativa fotoaktivering av ett visst ljus lyhörd agent i djupa vävnader i en enda cell upplösning. Som zebrafisk embryon är optiskt transparenta, kan deras utveckling följas in vivo. Dessa egenskaper gör zebrafisk en perfekt modell organism för att kontrollera aktiviteten hos en mängd olika kemiska ämnen och proteiner med fokuserat ljus. Här beskriver vi användandet av två-photon mikroskopi för att framkalla en aktivering av kemiskt bur fluorescein, vilket i sin tur ger oss möjlighet att följa cellens öde i levande zebrafisk embryon. Vi använder embryon som uttrycker en levande genetisk landmärke (GFP) för att lokalisera och exakt rikta alla celler av intresse. Detta förfarande kan vara lika användas för exakta ljus inducerad aktivering av proteiner, hormoner, små molekyler och andra bur föreningar.
Protocol
Vi beskriver ett protokoll för cell-märkning med bur fluorescein kan dock andra foto-aktiveras genom färgämnen och proteiner på liknande sätt användas.
1. Injektion av Caged Fluorescein
- Bered 5% stamlösning (5 mg bur-fluorescein / 100 mikroliter 0,2 KCl) av dextran-konjugerad 4,5-dimetoxi-2-Nitrobenzyl (DMNB) bur fluorescein (10.000 MW dextran, anjoniska, Invitrogen, molekylära sonder, Karlsbad, Kalifornien , kat. nej. D-3310). Fördela och förvara i -20 ° C. Observera att DMNB-bur fluorescein är känslig för ljus och bör förvaras i mörker.
- Förbered en injektion tråg tillverkade av 1% agaros (Sigma, St Louis, MO, kat. Nr. A9539) som beskrivs i "The zebrafisk bok" 1.
- Förbered 2 liter E3 mediet genom att späda en 100 x E3 stamlösning.
- På kvällen före injektionen, förbereda parning burar separera män (s) från den kvinnliga (er) av önskad transgena linje uttrycker en synlig fluorescerande landmärke (GFP, RFP etc.) som används för att lokalisera målceller för fotoaktivering.
- Förbered kapillär injektionsnålar (Thin Wall Glas kapillärer med glödtråd, World precisionsinstrument, Sarasota, FL, katt. Nej. TW100F-6) med hjälp av en mikropipett avdragare (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).
- Tina en delmängd av 5% bur fluorescein på is.
- Späd 5% bur fluorescein stamlösning i 0,2 KCl till en slutlig koncentration av 1%, och hålla på is. Undvik ljusexponering.
- Setup parning kors som bereddes i steg 4.
- Samla befruktade ägg så snart de läggs. Orient en-cells stadiet embryon i agarosen injektion mögel överdrog med E3 1.
- Med hjälp av en microloader spets (Eppendorf, Hamburg, Tyskland, kat. Nr. 5242 956,003) återfyllning en injektionsnålen med ~ 1 mikroliter av 1% bur fluorescein lösning.
- Placera laddade nål i ett mikromanipulator ansluten till en gasdriven microinjector (pneumatisk picopump, World precisionsinstrument, Sarasota, FL, PV820).
- Justera injektionsvolymen till 2-3nl och injicera bur-fluorescein direkt i cellens cytoplasma. Injicera minst 50 embryon per försök.
- Inkubera embryon i mörker vid 28,5 ° C i E3 till önskad utvecklingsstadiet. Om embryon äldre än 24 timmar efter befruktningen analyseras, tillsätt 0,1% phenylthiourea (PTU, Sigma, St Louis, MO, katt. Nej. 22.290-9) för att hämma pigmentering.
2. Embryo Montering
- Bered en färsk E2 lösning (se lösningar del, kan lagras vid 4 ° C i en vecka).
- Coat 60 mm petriskålar med ett tunt lager på 1% agaros löst i E2 medium.
- Förbered 2% låg smältpunkt Agar (ultrarent LMP agaros, Invitrogen, Carlsbad, CA, katt nr 16.520.100..) För inbäddning: Lös upp agaros i sterilt dubbla destillerat vatten mikrovågsvärmning till kokning. Håll rörets lock öppet under uppvärmning. Fördela 1 mL i mikrocentrifugrör och hålla i ett värmeblock vid 72 ° C.
- Ta bort chorions av embryon genom att försiktigt dra den chorion isär med vassa pincett (nr 5). Håll embryon i E2-lösning på en agar-belagd skålen (se steg 2). Dechorionated embryon skall hanteras med brand-polerat glas pasteurpipett eftersom de kan hålla sig till polypropylen pipetter. Undvik att utsätta dechorionized embryot till luft eftersom dessa embryon kan skadas av vätskan ytspänning.
- Samla vald embryo i en liten volym E2 med en brand-polerat glas pasteurpipett och placera embryot på 60 mm petriskål. Montera en droppe (~ 150 mikroliter) med 2% agaros (steg 3) bredvid embryot. Snabbt blanda två droppar för att få en homogen sista ~ 1% agaros blandningen och med hjälp av en dissekera mikroskop orientera embryot med ryggen vänd mot målet linsen.
- Vänta tills agarosen stelnat och lägga E2 medelstora tills inbäddade embryot är nedsänkt i vätska. Det är att föredra för att få ett enda embryo per maträtt som det kan frigöras ur agarosen efter fotoaktivering processen.
3. Fotoaktivering
- Vi använder en Zeiss LSM 510 META NLO två-photon mikroskop utrustat med ett bredband avstämbar (700-1020nm) Mai Tai-HP-femtosecond laser från Spectraphysics.
- Placera den monterade embryot på en hållare under mikroskop. Den fluorescerande landmärke i embryot visualiseras med 40x/0.8W Achroplan vatten nedsänkt mål. För följande steg som vi använder icke-descanned detektor (NDD) med bandpassfilter (BP) på 500-550nm.
- Som en förutsättning för fotoaktivering processen, få rumslig fluorescerande information om regionen av intresse genom att förvärva bildserie från de mest ventrala att ryggdelen av de upptäckta fluorescerande signal med två-photon laser våglängd av 860nm (för GFP detektion). För detta ändamål kan tillräcklig upplösning fås med en spännvidd på 6μm mellan varje förvärvad fokalplan.
- Välj måletz-planet för fotoaktivering och föra denna region i fokus. Beroende på syftet med försöket kan regionen av intresse antingen inom eller utanför GFP synligt landmärke. Ta en enda bild i denna z-planet. Spara bilden och hålla den öppen i ett separat fönster.
- Ställ in två-photon laser våglängden 720nm och när lasern är i modlåsta öppna "Redigera blekmedel" menyn. Definiera regionen av intresse (ROI) för fotoaktivering enligt bilden tas vid 860nm (Steg 4) att använda "Definiera regionen" menyn. Det är viktigt att välja ROI på denna bild efter att flytta laser våglängden 720nm som de senare ändrar de x, y positionerna av de observerade fältet.
- Ställ följande parametrar för fotoaktivering i "Redigera blekmedel"-menyn (se steg 9): a) relativa lasereffekt, b) antalet iterationer, c) skanning hastighet.
- Tryck på "Bleach" i "Redigera blekmedel" fönster och vänta tills lasern stannar.
- Växla tillbaka till 860nm, skaffa en enda plan bilden för att utvärdera intensiteten i det resulterande photoactivated material och en andra serie av bilden förvärvet att utvärdera Z-span (tjocklek) av aktiverade domänen.
- Tänk på följande parametrar för fotoaktivering:
- Man bör empiriskt fastställa den optimala förutsättningar för fotoaktivering genom att variera två parametrar: laser intensitet och varaktighet fotoaktivering. Den relativa lasereffekt kan kontrolleras av Akusto-optisk modulator (AOM) överföring. Varaktigheten av fotoaktivering är en funktion av antalet iterationer och skanna hastighet.
- Bestäm den linjära skalan för fluorescensintensiteten för att undvika mättnad av uncaged fluorescens.
- Det finns ett linjärt samband mellan de erhållna fluorescensintensiteten av uncaged molekyler och z-axeln spännvidd photoactivated klon 2.
4. Upptäckt av Uncaged Fluorescein
- Efter fotoaktivering, höja embryon i mörker vid 28,5 ° C i E2 medium som innehåller 0,1% PTU för att förhindra uppkomsten av hudens pigmentering.
- Vid önskad utvecklingsstadiet, ta bort embryot från agarosen under ett dissekera mikroskop. Med ett spetsigt skalpell, skapa ett "V" formade snitt i agarosen nära embryot så att "V" pekar mot embryot huvud. Placera en sluten pincett vid den punkt i "V" nära chefen för embryot och tryck försiktigt öppna pincetten separera agarosen längs embryot och släppa embryot till mediet.
- Samla embryon med en brand-polerad pasteurpipett och fixa med paraformaldehyd (PFA, 4% i 1 x PBS, pH 7,2) för antingen 3 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Ta bort fixativ lösningen och skölj 2-3 gånger i PBST i minst 5 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta embryon med 100% metanol i 10 min, fylla på med färska metanol och inkubera vid -20 ° C under minst 2 tim.
- Rehydrera embryon genom successiva inkubationer (5 min vardera) i en serie av utspädd metanol i PBSTr: 80%, 60%, 40% respektive 20%. Tvätta 2 x 10 minuter i PBSTr.
- Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur i 500 mikroliter av blockerande lösningen.
- Lägg till ett anti-Fluorescein-alkaliska fosfataser (AP) Fab-fragment (Roche, Palo Alto, CA, kat. Nr. 11426338910), utspädd 1:500 i blockerande lösningen och inkubera över natten vid 4 ° C (placera mikrocentrifugrör på deras sidor) .
- Tvätta 5 x 15 minuter i PBST.
- Tvätta i 5 minuter i 0,2 NaCl i TNT.
- Tvätta i 5 minuter i 0,4 NaCl i TNT.
- Jämvikta 3 x 5 minuter i nyberedd Prestain lösning.
- Lös upp en Fast Red tablett (Roche, Palo Alto, CA, kat. Nr. 11496549001) i 2 ml Prestain lösning. Det rekommenderas att filtrera lösningen med Whatman nr 2 papper att utelämna un-upplösta partiklar. Alternativt, spinn ner lösningen och använda en klar supernatant vätska.
- Tillsätt 500 mikroliter Fast Red-lösning till varje rör, inkubera i mörker vid rumstemperatur och övervaka färgutveckling tills önskad signal-bakgrund förhållande nås (20 minuter till flera timmar). Om bakgrunden utvecklar, överföring till 4 ° C. Efter en timmes inkubation, fylla på med en ny Fast Red färglösningen.
- Stoppa färgningsreaktionen med 3 x 5 minuter tvättar i PBST.
- Fix för 20 minuter i 4% PFA vid rumstemperatur.
- Tvätta 2 x 5 minuter i PBST.
- Klart embryon genom en serie av 25%, 50% och 75% glycerol i PBS tills embryona avvecklas i botten av röret. Embryon kan lagras vid 4 ° C under några dagar.
5. Fluorescerande Visualisering av Uncaged område
- Förbered ett objektglas för montering: med hjälp av en 1 ml spruta gälla fyra platser av tydlig silikonfett på bilden, placerad på ett avstånd av ~ 15mm från varandra. Montera embryo i CenteR ~ 200 mikroliter av 75% glycerol och lägg på ett täckglas (nr 0, 18x18mm) på ovansidan och tryck försiktigt mot silikon tills glycerol lösningen upptar ytan mellan bilderna.
- Placera den monterade embryot på scenen och få det att fokusera med hjälp av en 40x mål. Skaffa en konfokala Z-serie av bilder med hjälp 488nm Argon och 543nm HeNe lasrar som exciteringskälla.
- Z-axeln spännvidd photoactivatated domänen kan analyseras med hjälp av 3D-rekonstruktion av uncaged embryo med hjälp av en programvara bildanalys.
6. Lösningar
| 100 x E3 | 174mM NaCl, 21mm KCl, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 ° C |
| 20 x E2 | 0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20mm CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrat och förvara i rumstemperatur |
| 1 x E2 | Späd ut 20 x E2 i dubbel destillerat vatten och tillsätt nybakade NaHCO 3 (till slutlig koncentration av 0,7 mm), penicillin och streptomycin (späd penna Strep lösning till en slutlig koncentration av 1 x som innehåller 100U av penicillin och 100mg streptomycin per ml (Invitrogen , Karlsbad, Kalifornien, kat. nr. 15140-122)) |
| PBST | 0,1% Tween-20 i PBS |
| PBSTr | 0,3% Triton i PBS |
| Blockerande lösningen | 10% BSA, 0,3% Triton, 1% DMSO i PBS |
| TNT | 100mm Tris-HCl pH-7.5, 150mm NaCl, 0,5% Tween-20 i dubbeldestillerat vatten |
| Prestain lösning | 100mm Tris-HCl pH-8,2, 0,4 NaCl, 0,1% Tween-20 i dubbeldestillerat vatten |
7. Representativa resultat
Ett exempel på användning av två-photon mikroskopi för att photoactivate agenter i en levande zebrafisk embryo presenteras. Med hjälp av en liknande metod vi spåras tidigare linjen av de märkta photoactivated neurala stamceller i zebrafisk hjärnan 2,3. Figur 1 visar fotoaktivering en bur fluorescein konjugerat spårämne färg i främre neurala tallrik zebrafisk embryon som bär en neurog1:: GFP reporter transgenen, som tjänade som en levande inneboende landmärke.
Embryon injicerades med bur fluorescein i en cell scenen och inbäddade i agaros i knopp skede. Vid 3 - 5-somit skede rumsliga koordinater uppmättes i neurog1:: GFP transgena embryot att bestämma regionen av intresse (ROI) för uncaging (Figur 1A, A "). Vi uncaged fluoresceinisothiocyanat släktlinje spårämne i en specifik domän av neurala plattan (Figur 1B, B). Därefter var öde denna märkt ges neurala stamceller underdomän bestäms vid prim5 (24 timmar efter befruktning) steg genom immunfärgning av de uncaged fluorescein (Figur 1C, C ').
Omfattningen av två-photon laser uncaging, dvs intensitet uncaged fluorescens och tjocklek photoactivated domän (z-span), kan styras genom att justera två parametrar: laser intensitet och varaktighet. Det senare kan kontrolleras genom justering av iteration nummer och Skanningshastighet (se del 3, steg 9, Russek-Blum, 2009). I exemplet i figur 1, använde vi relativa lasereffekt på 12% AOM överföring, 20 iterationer och scanna hastighet av 25,6 μsec / pixel. Med dessa inställningar har vi märkt en avkastning som innehåller 9-10 celler och en photoactivated z-spännvidd på 30μm (~ 1-2 cell rader).
Figur 1. Ett representativt resultat av fotoaktivering av bur fluorescein i levande zebrafisk embryo med hjälp av två-photon mikroskopi.
Schematisk illustration (AC) och bilder representant (A'-C ") av fotoaktivering processen. Live sebrafisk embryo (A, A ') som uttrycker GFP under kontroll av neurogenin-1 promotor (neurog1:: GFP) som injicerades med bur fluorescein tracer färg på en cell skede. Vid 3-5 - somit skede var en diskret del av framhjärnan primordium (diencephalon) photoactivated och uncaged fluorescein spårämne färg kunde detekteras (B, B '). Efter fotoaktivering förfarandet, var embryot inkuberas vid 28,5 ° C och hjärnceller innehåller uncaged fluorescein spårades av anti-Fluorescein immunfärgning 24 timmar efter befruktning (HPF, C, C '). Dien, diencephalon, Tel., Telencephalon..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Foto-aktiveras genom föreningar är molekyler vars funktion är maskerad tills de belyses med en viss våglängd (oftast UV), förmå en fotokemisk reaktion som omvandlar molekyler i ett biologiskt eller kemiskt aktivt läge. Dessa sonder ger mycket kraftfulla verktyg i cellbiologi forskning, eftersom aktiveringen kan justeras tidsmässigt och rumsligt genom att begränsa sin exponering för ljus.
Den betydande fördel av multi-foton mikroskopi är dess relativt djup optiska inträngning och minskad ospecifik fototoxicitet. För aktiveringen måste två fotoner med låg energi absorberas av foto-aktiveras genom förening på samma gång. Eftersom sannolikheten för en sådan händelse är beroende av fotonen täthet förblir aktivering begränsad till fokalplanet. Aktiveringen regionen kan därför selektivt manipuleras i en definierad volym i vävnaden.
Vi presenterar ett protokoll för fotoaktivering av bur fluorescein med två-photon mikroskopi i levande zebrafisk embryon. I det specifika exemplet nedan använder vi två-photon mikroskopi för att förmå bur-fluorescein fotolys för att markera celler i tidiga embryonala stadier och därefter spåra linjen av den märkta celler i utvecklingsländerna zebrafisk hjärnan. I jämförelse med fotoaktivering med laser och blixt-lampa, vilket resulterar i aktivering av spårämne färg i ett tiotal celler och brist på upplösning i z-axeln 4,5, två-photon-baserade fotoaktivering kan nå en rumslig upplösning på några mikrometer få axiell lösning av ett proximalt 01:59 cell rader 2,3.
Förfarandet rapporterade häri kan användas för aktivering av en mängd olika föreningar på en enda cell upplösning i levande exemplar. Till exempel kan Kaede proteinet på liknande sätt används för att märka celler efter det photoconversion från grönt till rött fluorescenct protein 6,7. Andra ljusaktiverat proteiner som kan användas bland annat ljus-gated jonkanaler, Channelrhodopsin, som kan modulera nervaktivitet 8 och photosensitizers som KillerRed, som inducerar celldöd vid ljus bestrålning 9.
En mängd bur molekyler har rapporterats, vilket gör modulering av fysiologiska processer genom manipulation av extracellulära och intracellulära föreningar 10. Dessa inkluderar, aktiva signalsubstanser (t.ex. glutamat 11,12) och andra budbärare (t.ex. kalcium 13) och steroidhormoner (t.ex. retinoinsyra 14). Slutligen har foto-medierad kontroll av geners aktivering och tysta i zebrafisk införts. Två-foton-baserade fotoaktivering i bur antisense oligonukleotider (morpholinos) och RNA kan användas för gen ÖVERVÄLDIGANDE och få-av-funktion i begränsad cell population av en levande zebrafisk embryo 15,16.
Sammanfattningsvis är två-photon-baserade foto-aktivering i levande zebrafisk embryon: 1) Exakt, 01:59 cell rader längs x, y, z-axlarna. 2) Kvantitativa-burken omfattning fotoaktivering kontrolleras. 3) Mångsidig-kan användas för en mängd olika foto-konvertibla proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Tack till Genia Brodsky för figur grafik, Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz och Leonid Roitman för teknisk rådgivning och hjälp med de två-photon uncaging, Maayan Tahor och Suliman Elsadin för tekniskt stöd, Uwe Stråhle för vänligt ge neurogenin1 reportern linje och Amos Gutnick för kommentarer till detta manuskript. Forskningen inom Levkowitz labbet stöds av den tysk-israeliska Foundation (licensnummer 183/2007), Israel Science Foundation (licensnummer 928/08) och Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL är en sittande i Tauro Career Development professur i biomedicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments, Inc. | PV820 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | 22290-9 | |
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | |
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche Group | 11426338910 | |
| Fast Red | Roche Group | 11496549001 |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
