Denna procedur beskriver ett snabbt och enkelt arbetsflöde för att införa siRNA in svårt att transfektera cellinjer och följa genuttrycket realtids-PCR. Användning av en automatiserad celltalsräknare, med flera bra elektroporation platta och automatiserad elektrofores stationen ger snabba och tillförlitliga resultat utan behov av dyra robotiserade hantering.
Användningen av siRNA medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE fortsätter att vara ett viktigt verktyg i studier av genuttryck. siRNA studier bedrivs inte bara för att studera effekterna av downregulating enstaka gener, men också för att förhöra signalvägar och andra komplexa nätverk interaktion. Dessa väg analyser kräver både användningen av relevanta cellulära modeller och metoder som orsakar mindre störningsräkning till cellulär fysiologi. Elektroporation används allt oftare som ett effektivt sätt att introducera siRNA och andra nukleinsyror i svåra att transfektera cellinjer och primära celler utan att ändra signalväg under utredning. Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik siRNA experiment, och det finns sätt att förenkla arbetet och samtidigt förbättra kvaliteten på uppgifterna i flera experimentella stadier. För att hjälpa dig komma igång med din siRNA medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE projektet kommer vi att visa hur du utför en väg studie komplett från att samla in och räkna cellerna innan elektroporation via post transfektion realtids-PCR genuttryck analys. Följande studie undersöker den roll som transkriptionell aktivator STAT6 i IL-4 beroende av genuttryck av CCL17 i en Burkitt lymfom cellinje (Namalwa). Det visade tekniker är användbara för ett brett spektrum av siRNA-baserade experiment på både anhängare och celler fjädring. Vi kommer också att visa hur man effektivisera cell räknar med TC10 automatiserade celltalsräknare, hur man electroporate flera prover samtidigt med MXcell elektroporation systemet, och hur man samtidigt bedöma RNA kvalitet och kvantitet med Experion automatiserade elektrofores system.
Den här artikeln har visat hur man electroporate siRNA in i ett svårt att transfektera linje fjädring cellen och hur man följa genuttryck i dessa celler. När du gör detta förfarande det är viktigt att komma ihåg att hålla saker så konsekvent som möjligt i alla prover.
The authors have nothing to disclose.