Biology

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

Published: April 14, 2010 doi: 10.3791/1904

Adam M. McCoy¹, Claudia Litterst¹, Michelle L. Collins¹, Luis A. Ugozzoli¹

¹Gene Expression Division, Bio-Rad Laboratories

Summary

يصف هذا الإجراء سير عمل سريعة وسهلة لإدخال سيرنا إلى الصعب transfect خطوط الخلايا والجينات التي تتبع في الوقت الحقيقي PCR. استخدام عداد الخلية الآلي ، وكذلك لوحة متعددة electroporation ، ومؤتمتة محطة الكهربائي تقديم نتائج سريعة وموثوق بها من دون الحاجة للتعامل مع آلية مكلفة.

Abstract

استخدام بوساطة سيرنا ضربة قاضية الجين هو استمرار لتكون أداة مهمة في دراسة التعبير الجيني. وتجري دراسات سيرنا ليس فقط لدراسة آثار downregulating الجينات واحد ، ولكن أيضا لاستجواب مسارات الإشارات وغيرها من شبكات التفاعل المعقد. هذه التحليلات المسار يتطلب كلا من استخدام نماذج ذات الصلة الخلوية والأساليب التي تسبب أقل اضطراب في الفيزيولوجيا الخلوية. ويتزايد Electroporation تستخدم وسيلة فعالة لإدخال سيرنا والأحماض النووية الأخرى إلى الصعب transfect خطوط الخلايا والخلايا الأولية دون تغيير مسار الإشارات قيد التحقيق. هناك عدة خطوات حاسمة لتجربة ناجحة سيرنا ، وهناك طرق لتبسيط العمل وتحسين نوعية البيانات في مراحل تجريبية عدة. لمساعدتك على البدء مع المشروع الخاص بوساطة سيرنا ضربة قاضية الجينات ، وسوف نقوم شرح كيفية إجراء دراسة كاملة عن طريق جمع وفرز الخلايا قبل electroporation من خلال تحليل آخر ترنسفكأيشن PCR الوقت الحقيقي التعبير الجيني. الدراسة التالية تحقق في دور المنشط في الترانسكربتي STAT6 IL - 4 التعبير الجيني تعتمد على CCL17 في خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت خط (Namalwa). أثبتت تقنيات مفيدة لطائفة واسعة من سيرنا على أساس التجارب على كل من الخلايا الملتصقة والتعليق. وسوف نعرض أيضا كيفية تبسيط خلية العد مع العداد الآلي TC10 الخلية ، وكيفية electroporate عينات متعددة في وقت واحد باستخدام نظام electroporation MXcell ، وكيفية تقييم واحد RNA نوعية وكمية مع الكهربائي Experion النظام الآلي.

Protocol

1. إعداد وفرز الخلايا Namalwa

إزالة الخلايا من قارورة الثقافة والطرد المركزي الخلايا لبيليه. إزالة الخلايا وطاف resuspend في حجم معروف من برنامج تلفزيوني. الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول هي خلايا التعليق. إذا كنت تستخدم الخلايا الملتصقة ستحتاج إلى جمع يعرض للتريبسين قبل.
لتحديد عدد الخلايا الحية ، وصمة عار an قسامة لتعليق الخلية التي خلطها 01:01 بمحلول 0.4 ٪ أزرق التريبان والماصة 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة العد ، ومن ثم إدراج شريحة في الخلية TC10 الآلي العداد (بيو راد مختبرات ، وشركة).
سوف العداد الخلية TC10 أوتوفوكس أن أؤكد العد الأكثر دقة ، ومن ثم المضي قدما في فرز الأصوات. فإنه يحدد تلقائيا من كثافة الخلايا الحية وخلايا الكلية في العينة.
حدد طريقة عرض الصورة لعرض الخلايا على viewscreen. ثم حدد الحاسبة لتخفيف العداد الخلية TC10 تلقائيا بحساب كمية خليط الخلية التي ستكون هناك حاجة.
هذه التجربة هو استخدام ما مجموعه ثلاثة siRNAs : واحد واثنين سيرنا السيطرة siRNAs مختلفة تستهدف الجين STAT6 ، بالإضافة إلى الضوابط untransfected. وهذا يتطلب 3.6 مل في تركيز النهائي من 5 X 10 في الخلايا ⁶ مل.
أدخل التركيز المطلوب وقيم الحجم النهائي في تخفيف حاسبة ، ويحسب حجم التعليق الخلية المطلوبة استنادا إلى عدد الخلايا الحية لتلك العينة. بدلا من ذلك ، إجراء العملية الحسابية يدويا. ثم نقل حجم المطلوب من خليط الخلية لهذه التجارب في أنبوب جديد.
تدور مخاليط الخلية إلى خلايا بيليه وإزالة كل برنامج تلفزيوني. Resuspend في 3.6 مل من الجينات العازلة electroporation بولسير (بيو راد مختبرات). نقل 800 aliquots ميكرولتر في أنابيب تحتوي على مزيج siRNAs المناسبة وبلطف. الخلايا هي الآن جاهزة للelectroporation.

2. Electroporating الخلايا في 96 - جيدا لوحات

لوحة electroporation 96 - جيدا يسمح لجميع العلاجات يعيد أربعة إلى أن electroporated معا.
نقل 150 ميكرولتر من تعليق خلية في الآبار الملائمة لوحة electroporation 96 - جيدا.
إدراج لوحة في لوحة MXcell غرفة electroporation وإغلاق الغطاء.
Electroporate باستخدام إعدادات الأمثل للخط الخليوي والعازلة المستخدمة. وباستخدام هذه الخلايا electroporated موجة الانحلال الأسي مع ضبط أداة من 250 V ، μF 350 ، و 1000 Ω المقاومة.
electroporation بعد اكتمال ماصة بلطف صعودا وهبوطا في كل بئر إلى المزيج ثم نقل الخلايا إلى الأنسجة التي تحتوي على لوحة ثقافة ما قبل تحسنت وسائل الإعلام. وتزرع في خلايا Namalwa RPMI (الحياة تكنولوجيز) تستكمل مع FCS 7.5 ٪ و 1 ٪ البيروفات.
وتؤخذ عينات من الرقابة التي لم electroporated من الخلية تعليق المتبقية وإضافتها إلى الأطباق ثقافة مستنبت قبل تحسنت بشكل مطابق للخلايا electroporated.
الخلايا احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO _2.
بعد 24 ساعة ، وكان بفعل مجموعة واحدة من الخلايا التي تحتوي على تركيز نهائي 10 نانوغرام / مل IL - 4 المؤتلف (R & D أنظمة). المجموعة الثانية من الخلايا السيطرة لا يحصلون إلا على وسائل الاعلام إضافية. وحضنت كل الخلايا إضافية على مدار 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.

3. استخراج والتحقق من الحمض النووي الريبي

بعد ما مجموعه 48 ساعة من النمو ، وعدد الخلايا في كل بئر ، ونقل أحد قسامة من كل بئر إلى أنبوب microfuge لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتجميد قسامة الثاني لتحليل البروتين النشاف الغربية أو غيرها.
الطرد المركزي عينات لخلايا بيليه ، ثم إزالة ورفض كل من طاف الأنبوب.
المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي. نحن عادة استخدام الحمض النووي الريبي مجموع أوروم مجموعة (بيو راد) وفقا لبروتوكول المدرجة.
عند رصد الجين بوساطة سيرنا ضربة قاضية من المهم بصفة خاصة للتحقق من الحمض النووي الريبي RNA الجودة لان المتدهورة سوف تعطي نتائج مضللة. نسبة 260/280 لا يشير سلامة الحمض النووي الريبي لذلك فمن المهم لتشغيل العينات في مادة هلامية أو جهاز ميكروفلويديك لتأكيد الحمض النووي الريبي ليست متدهورة.
لتقييم كل من كمية ونوعية في خطوة واحدة ، سيتم تحليل هذه العينات باستخدام نظام Experion الكهربائي الآلي (بيو راد).
أولا ، وعينات الحرارة. بعد ذلك ، رئيس الوزراء ، وتحميل ، ودوامة رقاقة الحمض النووي الريبي Experion. إدراج شريحة في محطة الكهربائي وبدء تشغيل Experion.
بعد اكتمال تشغيل ، يقوم البرنامج تلقائيا Experion عرض النتائج على شكل جدول مخطط رحلاني النتائج ، (الذي يعرض تركيز الحمض النووي الريبي ، ونسبة الريباسي ، ومؤشر جودة عدد RNA) ، وهلام الظاهرية (التي تبدو مماثلة لRNA التقليدية هلام). والجودة الشاملة عينات الحمض النووي الريبي عالية وعادة ما RQI من 8-10.
4. في الوقت الحقيقي PCR
1. بعد التحقق من نوعية الحمض النووي الريبي ، والمضي قدما مع ردود الفعل [كدنا]. تستخدم هذه التجربة خطوة واحدة iScript RT - PCR مزيج (بيو راد) من الجمع بين والتوليف [كدنا] PCR في الوقت الحقيقي في واحد رد الفعل.
2. جعل مزيج الرئيسي يحتوي على جميع المكونات الأخرى من رد فعل القوالب RNA التمهيدي لكل مجموعة ، وتوزيع تلك في لوحة PCR.
3. بعد إضعاف الحمض النووي الريبي لتركيز موحدة ، إضافة إلى عينات الحمض النووي الريبي الآبار المناسبة. تم تعيين كل رد فعل حتى في ثلاث نسخ.
4. ختم لوحة ، ووضعه في النظام CFX384 PCR الوقت الحقيقي (بيو راد). حدد البروتوكول المناسب والبدء في تشغيله.
5. بمجرد اكتمال تشغيل ، يتم تحديد الجينات بمقارنة التعبير الجيني للجينات لمصلحة تطبيع الجين في الخلايا المرجعية electroporated مع سيرنا التجريبية لتطبيع نفس الخلايا electroporated مع عنصر تحكم سيرنا.
5. تحليل ضربة قاضية سيرنا
1. تم رصد التعبير عن CCL17 باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي للتحقيق في دور المنشط في الترانسكربتي STAT6 IL - 4 تحريض تعتمد على CCL17. عن هذه التجربة ، كما تم استخدام GAPDH الجين المرجعية. ويمكن استخدام جينات مرجعية بديلة أو جينات متعددة في إشارة بنفس الطريقة.
2. برنامج إدارة CFX تطبيع تلقائيا CCL17 التعبير ويتم التعبير عن الجينات مرجع من نفس العينة ومقارنة القيم الناتجة تلقائيا تطبيع للسيطرة على العلاجات ببساطة عن طريق اختيار GAPDH ك "مرجع" ومعاملة السيطرة (السيطرة دون سيرنا IL - 4 الاستقراء) كما "السيطرة" في التجربة نافذة إعدادات البرنامج مدير CFX.
3. IL - 4 من دون ظل تحريض ، نسخ من CCL17 على المستويات المنخفضة التأسيسية مماثلة لمعاملة السيطرة.
4. وأظهرت الخلايا المستحثة مع IL - 4 ، والإبقاء على المسار الطبيعي STAT6 (أي سيطرة أو علاجات سيرنا السيطرة untransfected) 80-10 تحريض حظيرة CCL17 التعبير.
5. وأظهرت الخلايا المستحثة مع IL - 4 ولكن مع التعبير STAT6 تثبطها إدخال إما سيرنا STAT6 سوى حوالي 2 أضعاف التعبير CCL17 من الخلايا uninduced تأكيد دور STAT6 في التعبير IL - 4 الناجم عن CCL17.
6. ممثل النتائج

الشكل 1. نظرة عامة على المسار IL - 4 الإشارة.
ملزم) من IL - 4 إلى مستقبله يؤدي إلى dimerization وتفعيل STAT6. تنشيط STAT6 translocates إلى النواة وينشط النسخ من الجينات المستهدفة ، مثل CC17.
ب) دون IL - 4 التعريفي ، ونسخ من CCL17 تظل عند مستويات منخفضة التأسيسية.
C) بعد سيرنا بوساطة إسكات الجين STAT6 ، ينبغي أن المعاملة مع IL4 يؤدي إلى زيادة قليلة أو معدومة في CCL17 التعبير.

الشكل 2. تحريض CCL17 بواسطة IL4 تقاس ظروف مختلفة الكمية PCR الوقت الحقيقي.
أ) قد نمت دون عينات IL - 4 على مستوى منخفض التأسيسية التعبير بغض النظر عن التعبير الجيني.
ب) وردت عينات التحكم كما هو مبين باللون الأخضر والأزرق ، وعادة للعلاج مع IL - 4 ، مع الحث 8-10 حظيرة CCL17. ولكن ، مع خلايا transfected siRNAs استهداف STAT6 ، كما هو موضح باللون الأحمر والوردي ، وتقلص CCL17 التعبير ردا على IL - 4 ، ودعم الفكرة القائلة بأن STAT6 يلعب دورا في التعبير IL - 4 الناجم عن CCL17.

Discussion

وقد أثبتت هذه المقالة كيفية electroporate siRNAs إلى الصعب transfect خط التعليق الخلية وكيفية متابعة التعبير الجيني في هذه الخلايا. عندما تفعل هذا الإجراء فإنه من المهم أن نتذكر أن تبقي الأمور كما يتفق ممكن عبر جميع العينات.