תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Summary

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

Abstract

מערכות תרבות Organotypic של רקמות עצביות תפקודית הם כלי חשוב במחקר הנוירוביולוגי. באופן אידיאלי, מערכת כזו צריכה להיות תואמת שיטות הדמיה, מניפולציה גנטית, הקלטה אלקטרו. כאן אנו מציגים שלבי הביניים פשוט רקמת תרבות מערכת רשתית ארנב מבוגר שאינו דורש ציוד מיוחד ותחזוקה מעט מאוד. אנו מדגימים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית. הרשתיות הארנב תרבותי בדרך זו ניתן לשמור אותן בחיים עד 6 ימים עם מעט מאוד שינויים של המבנה האנטומי הכוללת או את המורפולוגיה של הפרט גנגליון, תאים amacrine.

Protocol

הכנת כדורי אקדח גנים (GOLD)

1. בצע 100x PVP (0.5mg/ml) ב EtOH 100%.
2. לשקול את 30mg זהב BioRad 1.6 מיקרון microcarrier ומקום אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
3. לחשב את כמות פלסמיד צריך לתת ריכוז של 0.5-3 מיקרוגרם זהב פלסמיד / מ"ג, והמקום הפלסמיד לתוך הצינור עם microcarriers זהב. שלב פלסמידים מספר במידת הצורך.
4. תביאו נפח פלסמיד ל μl 100 עם מים מזוקקים.
5. הוסף 100 μl של spermidine 0.05M לתוך הצינור. וורטקס צינור 30 שניות.
6. וורטקס 1 דקה במלוא המהירות. Sonicate במשך 3-5 דקות ..
7. יבש אורך מתאים של צינורות Tefzel במנגנון PDS-1000/He Biorad במשך 15 דקות.
8. לאחר sonication, מערבולת של 1-2 דקות במהירות מלאה. הפחת את מהירות לאט, כדי לאפשר את הצינור להיפתח בעוד vortexing.
9. הוסף 100 μl של 1 M CaCl ₂ לאט להפיל את צינור חכם בעוד vortexing.
10. השאר צינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
11. בצע 5 מיקרון המסנן.
    1. קח שני מזרקים 5 מ"ל ללא מחטים.
    2. הסר את הבוכנה, ולנתק את כומתות שחורות. לוקח מספריים קטנים, מנותקים חלק הכובע השחור לתת טבעת. חזור על הבוכנה השני שתי טבעות נטו.
    3. כריך 5 מיקרון (חלקים קטנים, Inc ניילון לסנן, בקוטר ½ אינץ') מסנן בין שתי טבעות, ולדחוף את הכריך לתוך קצה המזרק.
    4. להשתלשל מזרק על בקבוק 50 מ"ל קונית.
12. לאחר 10 דקות, מערבולת הצינור למשך 30 שניות.
13. צנטריפוגה הצינור למשך 30 שניות ולשמור את גלולה.
14. הוסף 1ml של EtOH 100% גלולה. השתמש קצה פיפטה כדי לשבור את גלולה, והמערבולת 30 שניות. ספין 30 שניות ולהסיר EtOH. חזור על 2 יותר פעמים.
15. הוסף 1ml של EtOH 100% על גלולה (להיפרד קצה). המקום הזה בתוך 5 מיקרון מסנן ולתת לו לזרום דרך על ידי כוח המשיכה לתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי. השתמש EtOH נוספים במידת הצורך לשטוף את הצינורית או לעזור עם לזרום.
16. ספין שפופרת 50 מ"ל ב 2000rpm בצנטריפוגה למשך 5-10 דקות. הסר supernatant, לשמור גלולה.
17. בהתאם לצפיפות הרצויה של microcarriers הצורך, להוסיף 800μl-1.5ml EtOH 100% המקביל 8 μl-15 μl פתרון PVP.
18. מערבולת ומיד ללכת למנגנון PDS-1000/He Biorad.
19. Biorad מנגנון PDS-1000/He
    1. נתק את הצינור המחבר בין מיכל הדלק לצינור N2 הייבוש
    2. קח את ייבוש צינורות Tefzel ממכונה
    3. הכנס קצה אחד לתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי, ולצרף מזרק לקצה השני של הצינור. תמצצי slurry חום לאמצע הצינור.
    4. הכנס בחזרה צינורות לתוך המכונה.
    5. חכו (ללא סיבוב) עבור 4 דקות
    6. לאחר 4 דקות, למצוץ את EtOH לאט ובזהירות, כדי לוודא שלא להפריע microcarriers.
    7. סובב את צינורות דקה 1.
    8. אחרי דקה 1, לחבר את הצינור המחבר את מיכל הגז N ₂ הצינור ייבוש ולתת צינורות יבש במשך 15 דקות.
20. לאחר 15 דקות, לחתוך את צינורות בגודל כדור לשמש מיד או מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס exsiccator. תבליטים ניתן לאחסן עד 3 חודשים.

הכנת נשק גן

1. המקום כדורים במחסנית. כל תכשיט של הרשתית ניתן נורה בכדורים 1-3.
2. הכנס את המחסנית לתוך הנשק הגן ולצרף את האקדח למקור הליום. הגדר את הלחץ 110 psi.

הכנה של התקשורת

1. Dissection בינוני
   
   

   1 בקבוק איימס פתרון (Sigma, 8.8g)

   1.9 גרם סודיום ביקרבונט

   עט 10 מ"ל 1% / סטרפטוקוקוס / L-גלוטמין (1:100) (Gibco / Invitrogen)

   990 מ"ל מים מזוקקים עד 1 ליטר

   -------------------------------

   1 ליטר

   
   
   
2. סינון בינוני לנתיחה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   
3. בינוני דגירה (500ml)
   
   

   485 מ"ל של התקשורת לנתיחה מסוננים

   5 מ"ל של תוספת 1% N2 (Gibco / Invitrogen)

   10 מ"ל סרום סוס 1% (Sigma)

   500 μl של פנול אדום

   -------------------------------------------------- -

   0.5 ליטר

   
   
   
4. סינון בינוני הדגירה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
5. הבועה ₂ O לתוך המדיום לנתיחה במשך 15 דקות לפני תחילת פרוטוקול קצירת הרשתית.

הכנת בתאי הדגירה של הרשתית

1. מתחת למכסה המנוע, למלא מספר 60 מנות עמוק מ"מ (בתאי הדגירה, Nunc) עם 25 מ"ל של מדיום הדגירה. מספר המנות תלוי במספר של retאינאס הצורך.
2. מניחים לעמוד לסנן לתוך כל מנה עמוק. רק עצות מאוד לעמוד לא צריך להיות שקוע.
3. שמים את כל הכלים עמוק לתוך החממה עד הרשתיות מוכנים.
4. למלא שני 100 מ"מ בצלחות פטרי ומביאים הספסל לנתיחה.

הכנה של הרשתית ארנב

1. הקורבן ארנב על פי פרוטוקולים הוקמה. להלן אינו חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע.
2. עם מספריים זוויתי, להכניס אותו מאחורי העין לתוך ארובת העין של הארנב, חיתוך ממברנות עצב אופטי המצורפים העין.
3. הרם בעדינות את העין לשטוף אותו עם התקשורת לנתיחה מחומצן.
4. מניחים את העין (קרנית כלפי מעלה) לתוך הבאר של מבצעה עין ולסגור את המכסה.
5. מניחים את להב אופקית ממש מתחת למכסה. בתנועה חלקה אחת, לצייר את הלהב על פני העין לחתוך את הקרנית, משאיר כוס העין.
6. בעזרת מלקחיים, להסיר את הרשתית של העין מבצעה היטב ומניחים אותו על נייר סינון.
7. הסר את הזגוגית ואת העדשה על ידי לחיצה על אזור ליד עצב הראייה הכרות ומושך אחורה על נייר הסינון. חזור מספר פעמים עד כמעט את כל הזגוגית היא להסיר את הגביע עין נראה מרוקן.
8. מקום עין כוס לתוך צלחת פטרי עם התקשורת לנתיחה כדי לשטוף.
9. חותכים את כוס עין אל המספר הרצוי של החלקים (5 חלקים לכל היותר).
10. קחו חתיכה אחת של כוס עין ולשים אותו מתחת למיקרוסקופ.
11. קלאמפ בלובן העין ו דמית העין קלות יחד על קצה של הרשתית באמצעות מלקחיים. עם זאת, להשתמש במברשת בסדר לצחצח נכון בין דמית העין לבין הרשתית.
12. שימוש בתנועות עדינות קצר, להקניט את הרשתית דמית העין עד שהוא הופך להיות מנותקת.
13. חותכים 1 ס"מ מעל פיפטה העברה סטרילית. השתמש למצוץ את הרשתית ואת המקום לתוך צלחת פטרי של המדיום הדגירה לשטוף.
14. בעזרת פיפטה אחרת להעביר סטרילי עם 1 אינץ לחתוך בזהירות להעביר את הרשתית על 0.4 מיקרומטר Millicell המסנן (Millipore, חתול לא: PICMORG50).
15. השתמשו במברשת כדי לכוון את הרשתית עם הצד הגנגליון התא כלפי מעלה.
16. שטחו את הרשתית על ידי הברשה קלה בשולי הרשתית. מזעור נגיעה תא גנגליון שכבה עם מברשת כמה שיותר.
17. הסר בינוני עודף על מסנן עם פיפטה העברה.
18. בעזרת מלקחיים, להעביר את המסנן על suctioner שונה. צייר על suctioner 2-3 פעמים כדי להסיר את כל מדיום הדגירה של המסנן.

ג'ין gunning ו הדגירה של הרשתית

1. מתחת למכסה המנוע, מקום אחד הרשתית המכילים מסנני-עומד על מסנן 60 מנות עמוק מ"מ (בתאי הדגירה).
2. ודא כי המדיום הוא במגע עם החלק התחתון של המסנן וכי בינוני לא לגלוש לצדדים של המסנן על הרשתית. המסנן לפעול כממשק בין הרשתית ובינוניים.
3. תירה כל פיסת הרשתית עם שני כדורים. מקום אקדח גן ישירות מעל רקמות, על 3-4 ס"מ ממנו.
4. שמים את כל חדרי הדגירה על שייקר של 35-37 מעלות צלזיוס חממה.
5. החלף בינוני הדגירה מדי יום. הרשתית ניתן מודגרות לתקופה מקסימלית של 6 ימים.

Discussion

1. מה אני יכול לעשות עם השיטה הזאת?

• ראה מורפולוגיה תא בבירור.
• לייבל תאים להקליט אותם.
• Overexpress חלבונים, כמו PSD95, אלא גם חלבונים אחרים כי לווסת את תגובת התא, תעלות יונים למשל, קולטנים.
• אקספרס RNAs מעכבות.

2. כמה זמן אני יכול לשמור על הרשתית מבוגר?

• 4 ימים שום בעיה עבור ארנב מבוגר. לאחר שישה ימים התאים נראים "חולה", כלומר האקסונים לסגת, אתה רואה נפיחות של דנדריטים ההקלטה התגובות אור הופך אמין (רק ~ 50% מהתאים נמצאו אור תגובה לאחר זמן.
• המשכנו עכבר הרשתיות עבור 2 ימים. עכברים קשה יותר, כי הרשתית הם vascularized, וגם עבה יותר הרשתית ארנב.

3. כיצד אני יכול לוודא הרשתית שלך הוא בריא אחרי כל הזמן הזה?

• תקן הזהב היא הקלטה מהם. לתאי הגנגליון עדיין צריך להגיב לאור. אתה צריך להגן על רקמת שלך מן האור במהלך הדגירה, כדי למנוע הלבנת photopigment, כי יש לך לנתח את הרשתית את אפיתל הפיגמנט עבור הדגירה.
• מדי פעם אנו משמשים גם מערך הקלטה microelectrode לבדוק הרשתית שלנו.

4. למה אתה רוצה לתפעל רק מספר תאים ברשתית בכל פעם?

• שאלות מסוימות לא ניתן לטפל בדרך אחרת. חישבו למשל על רצפטורים GABA על תא גנגליון. אתה יכול להשתמש חוסמי GABA, אבל היית לעכב כל שידור GABAergic ברשתית, לא רק קלט לתא אתה מתעניין זה יכול להיות קשה מאוד להבחין בין השפעה על התא בפרט, הכוללת "השפעות הרשת "על הרשתית כולה.
• אם אתה רוצה לראות את המורפולוגיה בבירור, אתה לא יכול תווית כל התאים, אחרת אתה פשוט בלגן.

5. האם שיטה זו מתאימה האוכלוסייה כתם?

• Gunning מספר גנים היא תהליך אקראי. תקבל לתאי הגנגליון רבים, רבים התאים amacrine העקורים, כמה תאים מולר, והרבה פחות של כל סוגי תאים אחרים.

6. האם יש "טריקים" אני צריך לדעת כדי לגרום לזה לעבוד?

• לא ממש. אבל חשוב לבצע את הנתיחה של הרשתית במהירות יחסית, כך שיש לך את הכלים שלך על המסנן בתוך פחות מ 30 דקות. החלקים לא צריך להיות קטן מדי, על סנטימטר מרובע אחד זה בסדר. צפו חתיכות 3-4 מעין אחת ארנבת.
• שמור כלים דיסקציה שלך בהחלט הרחק כל דבר בא במגע עם fixatives ו בכימיקלים אחרים.
• נסה להגדיר החממה שלך ל-C 35 ולא 37, כך הרשתית לא חם מדי.
• אתה לא צריך להוסיף גורמי גדילה כמו BDNF עד בינוני שלך, לפחות אנחנו לא עושים את זה באופן שגרתי, אבל אתה צריך להשתמש תוספת N2, סרום סוס 1%, ואנטיביוטיקה. אנו מספקים רשימה של כל הדברים שאתה & תצטרך כקובץ משלים בתיעוד זה.

7. אתה יכול גנים אקדח דברים אחרים, ולא פלסמידים?

• כן, השתמשנו צבען מצומדות dextrans או DiI ו Dio. אבל אתה יכול להשתמש בסידן אינדיקטור צבעים, או כמעט כל דבר שאתה יכול מעיל על כדורי זהב או טונגסטן.

8. מהן המגבלות?

• קודם כל הזמן. אתה צריך לחתוך את עצב הראייה, כלומר לתאי הגנגליון בסופו של דבר מנוון. זו אינה בעיה של עד 6 ימים, אבל אחרי זה לא היינו אמון הרשתיות יותר. עכשיו, אם אתה רק רוצה להביע את ה-GFP או אחרת התא מילוי סמן, דגירה של 2-3 ימים זה מספיק, אך במקרים מסוימים, כמו כאשר אתה רוצה להביע RNAs מעכבות, ההשפעה יכול לקחת 4 ימים או יותר כדי להראות. הנה, אתה צריך לשמור על ציר הזמן בראש.

9. מה עבודה של חוקר אחר צריך להיות מודע?

• בתחום הרשתית, בהחלט מעבדה רחל וונג באוניברסיטת וושינגטון. יש גם הרבה אנשים עשו את העבודה במערכות אחרות, כמו הכנה פרוסה בהיפוקמפוס. אנחנו לא מתיימר להיות מסוגל לתת סקירה מלאה של הספרות, אלא לבדוק את המסמכים ברשימת ההפניות.