Summary
이 문서는 토끼 망막과 망막 신경절 GFP 또는 세포에 subcellular 마커의 다양한 인코딩 plasmids의 입자 - 중재 유전자 전송의 해부와 인큐베이션을 보여줍니다.
Abstract
기능 신경 조직의 Organotypic 문화 시스템은 신경 생물학 연구에 중요한 도구입니다. 이상적으로, 이러한 시스템은 이미징 기술, 유전자 조작, 그리고 electrophysiological 녹화와 호환되어야합니다. 여기는 전문 장비와 거의 유지 보수가 필요없는 성인 토끼 망막에 대한 간단한 계면 조직 문화 시스템을 제시한다. 우리는 토끼 망막과 망막 신경절 GFP 또는 세포에 subcellular 마커의 다양한 인코딩 plasmids의 입자 - 중재 유전자 전송의 해부와 부화를 보여줍니다. 토끼 망막이 방법은 최대 거의 전체 해부 구조의 변경이나 개별의 형태와 신경절 및 amacrine 세포, 6 일 동안 살아 있어야만 수 있습니다 교양.
Protocol
만들기 유전자 총 총알 (골드)
- 100 % EtOH에서 100X PVP (0.5mg/ml)를 확인합니다.
- BioRad 1.6 마이크론 microcarrier 골드의 30mg을 무게와 1.5 ML eppendorf 튜브에 넣습니다.
- 0.5-3 μg 플라스미드 / MG 황금의 농도를 제공하는 데 필요한 플라스미드의 양을 계산하고, 황금 microcarriers와 튜브에 플라스미드를 놓습니다. 필요한 경우 여러 plasmids을 결합합니다.
- 증류수 100 μl에 플라스미드의 볼륨을 가져와.
- 튜브에 0.05M spermidine 100 μl를 추가합니다. 소용돌이 관 30 초전.
- 와동 전속력으로 일분. 3~5분에 대한 Sonicate ..
- 15 분 동안 Biorad의 PDS-1000/He 장치에 Tefzel 튜브의 적절한 길이를 건조시킵니다.
- 전속력으로 1~2분에 대한 sonication 후, 소용돌이. vortexing하면서 튜브를 열 수 있도록 천천히 속도를 줄입니다.
- vortexing하면서 현명한 튜브 드롭 1 M CaCl 천천히이 100 μl를 추가합니다.
- 10 분 실온에서 튜브를 남겨주세요.
- 5 미크론 필터를 확인하십시오.
- 바늘없이 2 5ml 주사기를 가져가라.
- 플런저를 제거하고, 검은 모자를 분리합니다. 작은 가위 복용, 반지를 줄 수있는 블랙 캡의 일부를 잘라. NET이 고리에 다른 플런저를 반복합니다.
- 샌드위치 5 마이크론 (소형 부품 (주) 나일론 필터, ½ 인치 직경) 두 고리 사이의 필터와 주사기의 끝부분에 샌드위치를 누르십시오.
- 50ml 원뿔 플라스크 위에 매달려 주사기.
- 십분 후, 와동 30 초 튜브.
- 30 초 동안 튜브를 원심하여 펠렛을 저장합니다.
- 펠렛에 100 % EtOH의 1ml을 추가합니다. 펠렛, 그리고 소용돌이 30 초 헤어지고 피펫 팁을 사용합니다. 30 초 돌려서 EtOH를 제거합니다. 두 번 더 반복합니다.
- (끝 헤어) 펠렛에 100 % EtOH의 1ml을 추가합니다. 5 마이크론 필터로 이것을 놓고 50ml 원뿔 튜브로 중력에 의해 흐름을 통해 그것을하자. 튜브를 세척하거나 통해 흐름에 도움이 필요한 경우 더 많은 EtOH를 사용합니다.
- 50~10분 위해 원심 분리기에서 2000rpm에서 50ml 튜브를 스핀. 뜨는 저장, 펠렛을 제거합니다.
- 800μl - 1.5ml 백퍼센트 EtOH 및 해당 8 μl - 15 μl PVP 솔루션을 추가 필요 microcarriers의 원하는 밀도에 따라 다릅니다.
- 소용돌이 즉시 Biorad의 PDS-1000/He 장치로 이동합니다.
- Biorad PDS-1000/He 장치
- 건조 튜브에 N2 가스 탱크를 연결하는 튜브를 분리
- 컴퓨터에서 Tefzel 튜빙을 건조 꺼내서
- 50ml 원뿔 관에 한쪽 끝을 삽입하고 튜브의 다른 끝에 주사기를 연결합니다. 튜브의 중간에 갈색 슬러리를 빨아.
- 기계로 튜브를 다시 삽입합니다.
- 4 분간 (회전없이) 잠깐 만요
- 사분 후 microcarriers 방해하지 않도록하고, 천천히 그리고 신중하게 EtOH를 빨아.
- 1 분 튜빙을 회전합니다.
- 일분 후, 건조 튜브에 N 2 가스 탱크를 연결하는 튜브를 연결하고 15 분 동안 튜브가 건조하게.
- 십오분 후, exsiccator 4 ° C 즉시 사용되거나 저장될 총알 크기에 튜브를 잘라. 총알 3 개월까지 저장할 수 있습니다.
유전자 군의 준비
- 카트리지에 플레이스 총알. 망막의 각 조각은 1-3 총알을 맞았 수 있습니다.
- 유전자 군에 카트리지를 삽입하고 헬륨 소스에 총을 부착합니다. 압력 110 PSI 회원으로 설정합니다.
미디어 준비
- 해부 매체
1 병 에임스 솔루션 (시그마, 8.8g) 1.9 GM의 중탄산 10 ML 1 % 펜 / strep / L - 글루타민 (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ML 증류수 1L에 ------------------------------- 1 리터 - 0.22 μm의 필터를 사용하여 절개 매체를 필터링합니다.
- 배양 매질 (500ml)
필터링 해부 미디어의 485 ML 1 % N2의 보충 5 ML (Gibco / Invitrogen) 10ml 1퍼센트 말 혈청 (시그마) 페놀 레드 500 μl -------------------------------------------------- - 0.5 L - 0.22 μm의 필터를 사용하여 배양 매체를 필터링합니다.
- 망막의 수확 절차를 시작하기 전에 15 분 해부 매체에 거품 O 2.
망막에 대한 배양 챔버의 준비
- 후드에서 배양 매질의 25 ML 여러 60mm 깊이 요리 (인큐베이션 회의소, Nunc)를 입력합니다. 요리의 수는 RET의 숫자에 따라 달라집니다inas이 필요 해요.
- 각 깊은 그릇에 필터 스탠드를 놓습니다. 스탠드만이 매우 팁이 침수되지 않습니다.
- 망막 준비가 될 때까지 인큐베이터에 모두 깊은 요리를 놓습니다.
- 이 100mm 배양 접시를 기입하고 해부 벤치에 가져와.
토끼 망막의 준비
- 설립 프로토콜에 따라 토끼를 희생. 다음은 후드 아래에 수행할 수 필요가 없습니다.
- 직각 가위로 눈을에 연결된 안정 및 광학 신경을 절단, 토끼의 눈 소켓에 눈 뒤에 그것을 넣습니다.
- 부드럽게 눈을 밖으로 리프트 및 산소 해부 매체로 씻으십시오.
- 눈 슬라이의 우물에 눈을 (각막가 직면한) 장소와 뚜껑을 닫습니다.
- 수평으로 바로 뚜껑 아래에있는 블레이드를 놓습니다. 단칼에에서 눈을 컵을 떠나, 각막을 차단하기 위해 눈을 통해 칼날을 그립니다.
- 포셉를 사용하여, 잘 눈 슬라이에서 망막을 제거하고 필터 종이에 그것을 놓으십시오.
- 절단 시신경 근처 지역을 클램핑하고 필터 종이에 뒤로 당겨 유리와 렌즈를 제거합니다. 거의 모든 유리가 제거되고 아이 컵이 deflated 보이는 때까지 여러 번 반복합니다.
- 씻어 해부 미디어와 페트리 접시에 눈 컵 플레이스.
- 조각의 원하는 번호 (5 개 최대)로 눈을 컵 컷.
- 아이 컵 한 조각을 가지고 현미경으로 그것을 놓으십시오.
- 포셉를 사용하여 망막의 가장자리에 가볍게 함께 공막엔 및 맥락막 고정. 다른 한편으로 바로 맥락막과 망막 사이에 브러시에 좋은 브러시를 사용합니다.
- 그것이 분리되는 때까지 짧은 부드러운 동작 사용하여 맥락막에서 망막을 괴롭혀.
- 멸균 피펫 전송에서 1 인치 컷. 씻어 배양 매체의 페트리 접시에 망막과 장소를 빨아 이것을 사용하십시오.
- 1 인치 다른 살균 전송 피펫을 사용하면 0.4 μm의 Millicell 필터 (PICMORG50 Millipore, 고양이도없는)에 망막을 전송 주의깊게, 잘라.
- 위쪽을 향하고 신경절 세포 면을 방향 망막에 브러시를 사용합니다.
- 망막의 가장자리에 가볍게 빗질하여 망막을 평평하게. 최대한 브러시와 신경절 세포 레이어를 감동 최소화합니다.
- 이전 피펫과 필터 초과 매체를 제거합니다.
- 포셉 사용하여 수정된 suctioner에 필터를 전송합니다. suctioner에있는 필터의 모든 배양 매질을 제거하려면 2-3 시간을 그립니다.
유전자 거닝와 망막의 인큐베이션
- 후드 아래, 60mm 깊이 요리 (배양 챔버)에 필터에 서 망막 함유 - 필터의 각 장소.
- 매체는 필터의 아래쪽에 접촉하고 매체가 망막에 필터의 측면을 통해 유출하지 않는 것을 확인하십시오. 필터는 망막과 매체 사이의 인터페이스 역할을한다.
- 총알이 두 발과 망막의 각 조각을 쏴. 바로 조직 위에 플레이스 유전자 총을에 대한 3~4센티미터 거리.
- 37 ° C 배양기 - 35 흔드는에 모든 배양 챔버를 놓습니다.
- 배양 매질 매일 교체하십시오. 망막은 6 일 최대 incubated 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. 이 방법으로 어떤 작업을 할 수 있습니까?
- 명확하게 세포 형태를 참조하십시오.
- 그들의 기록 라벨 세포.
- Overexpress의 PSD95 같은 단백질,뿐만 아니라 세포의 반응을 조절 다른 단백질, 예를 들어 이온 채널, 수용체.
- 억제 RNAS을 표현한다.
2. 얼마나 오래 성인 망막을 보호할 수 있습니까?
- 사일는 성인 토끼에 대한 문제가 없습니다. 육일 후 세포가 "아픈"봐, 즉 axons은 접어야합니다, 당신이 신뢰할된다 dendrites과 빛의 반응의 기록의 붓기 참조 (단 ~ 세포의 50 %가 그 시간 이후에 가벼운 반응을 발견했다.
- 우리는 이일에 대해 마우스 망막 보관. 망막도 토끼 망막보다 두꺼운 vascularized 있으며, 때문에 마우스는 더 어렵습니다.
3. 어떻게 당신의 망막이 시간 이후 건강 있는지 확인합니까?
- 금 본위 제도는 그들의 기록이다. 신경절 세포는 여전히 빛이 반응한다. 당신은 부화를위한 안료 상피에서 망막을 해부하다하기 때문에 당신은 photopigment을 표백 피하기 위해 부화하는 동안 빛을에서 조직을 보호해야합니다.
- 우리는 때때로 또한 망막을 테스트하는 microelectrode 배열 녹화를 사용했습니다.
4. 왜 한 번에 망막에 단지 몇 세포를 조작 할까?
- 몇 가지 질문이 별도로 다루어 수 없습니다. 신경절 세포에서 GABA 수용체에 대한 예를 고려하십시오. 당신은 GABA 차단기를 사용할 수 있지만 그것은 아주 특별한에서 세포에 영향을 구별하기 어려운, 그리고 전반적인 "네트워크 효과를 수 인치 당신은 당신이 관심있는 셀에 바로 입력, 망막의 모든 GABAergic 전송하지 억제 것입니다 "전체 망막에.
- 당신이 명확하게 형태를보고 싶으면, 당신이 모든 세포에 레이블을 수 없다, 그렇지 않으면 그냥 난장판을.
5. 이 방법은 인구가 얼룩으로 합당한가요?
- 번호 유전자 거닝는 임의의 절차입니다. 당신은 많은 신경절 세포, 많은 있질 amacrine 세포, 일부 뮬러 세포와 모든 다른 세포 유형의 훨씬 적은거야.
6. 거기에 내가 일을하기 위해 알고 있어야하는 '마술'입니까?
- 아니요. 그러나 당신이 비교적 신속하게 망막의 해부를하는 것이 중요합니다, 그래서 당신은 30 분 이내에 필터에 조각되어 있습니다. 조각 1cm2 괜찮다는 약 너무 작은해서는 안됩니다. 한 토끼 눈 3-4 조각을 기대합니다.
- 엄격하게 떨어져 fixatives 및 다른 가혹한 화학 물질과 접촉에 와서 아무것도에서 해부 도구를 보관.
- 오히려 37 35 C에 배양기를 설정하려고하면 망막이 너무 후끈 달아 올랐어요 않았지.
- 당신은 적어도 우리가 정기적으로 그것을하지 마, BDNF처럼 중간에 성장 요소를 추가할 필요가 없지만, 당신은 N2의 보충, 1 %의 말 혈청과 항생제를 사용해야합니다. 우리는 당신 & '이 문서에 대한 보충 파일로 싶소 모든 일들의 목록을 제공합니다.
7. 당신은 유전자 군 다른 것들보다는 plasmids 수 있을까요?
- 예, 우리는 염료 복합 dextrans 또는 DiI 및 DIO를 사용했습니다. 그러나 당신은 칼슘 지표 염료를 사용하여, 또는 금 또는 텅스텐 총탄에 외투 수있는 거의 아무것 수 있습니다.
8. 제한은 무엇입니까?
- 우선, 시간. 당신은 신경절 세포가 결국 타락한 것을 의미합니다 시신경을 절단해야합니다. 이것은 최대 6 일 동안 문제가 아니지만 그 후 우리는 더 이상 망막을 신뢰하지 것이다. 당신은 이제 GFP이나 표현을 원한다면 다른 셀 충전 마커를, 2-3 일 배양은 충분하지만, 일부 경우에, 당신이 억제 RNAS을 표현하려고 할 때 같은 효과는 4 일 이상 소요될 수 있습니다 표시됩니다. 여기, 당신은 마음에 타임 라인을 유지합니다.
9. 어떤 다른 연구자의 작업하는 것은 하나는 알고 있어야?
- 망막 분야에 확실히 워싱턴 대학에서 레이첼 왕의 실험실. 사람들이 해마 슬라이스 준비 같은 다른 시스템에서 짓을 한 많은 작업도 있습니다. 우리는 문학의 전체 설문 조사를 줄 수있을 척하지만, 참고 문헌 목록에있는 서류를 확인하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
