Summary
Este artigo demonstra a dissecção e incubação de retina de coelho e de partículas mediado por transferência de genes de codificação de plasmídeos GFP ou uma variedade de marcadores subcelular em células ganglionares da retina.
Abstract
Sistemas de cultura organotípicas de tecidos neurais funcionais são ferramentas importantes na investigação neurobiológica. Idealmente, tal sistema deve ser compatível com técnicas de imagem, manipulação genética, e registro eletrofisiológico. Aqui apresentamos um simples interfase do sistema de cultura de tecidos para a retina de coelhos adultos que não requer equipamento especializado e pouca manutenção. Demonstramos a dissecção e incubação de retina de coelho e de partículas mediado transferência de genes de codificação de plasmídeos GFP ou uma variedade de marcadores subcelular em células ganglionares da retina. Retinas de coelhos cultivadas desta forma podem ser mantidos vivos por até seis dias com muito poucas mudanças da estrutura anatômica geral ou a morfologia do indivíduo ganglionares e células amácrinas.
Protocol
Balas fazendo gene gun (GOLD)
- Faça 100X PVP (0,5 mg) em EtOH 100%.
- Pesar 30 mg de 1,6 BioRad ouro microcarregador Micron e colocá-lo em um tubo eppendorf 1,5 ml.
- Calcular a quantidade de plasmídeo necessários para obter uma concentração de 0,5-3 mg de ouro plasmídeo / mg, e coloque o plasmídeo dentro do tubo com o microcarregadores ouro. Combine vários plasmídeos, se necessário.
- Trazer volume de plasmídeo para 100 l com água destilada.
- Adicionar 100 ul de espermidina 0,05 M para dentro do tubo. Vortex tubo de 30 segundos.
- Vortex 1 minuto em velocidade máxima. Sonicate por 3-5 minutos ..
- Seco um comprimento adequado da tubulação Tefzel em um aparelho PDS-1000/He Biorad por 15 minutos.
- Após sonicação vortex, por 1-2 minutos em velocidade máxima. Reduzir a velocidade lentamente para permitir que o tubo para ser aberto enquanto vórtex.
- Adicionar 100 ul de 1 M CaCl 2 lentamente para a queda do tubo sábios quando vórtex.
- Deixe tubo à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Faça 5 filtro Micron.
- Tome duas seringas de 5 ml sem agulhas.
- Retire o êmbolo e retire as tampas em preto. Tomando uma tesoura pequena, corte uma parte da capa preta para dar um anel. Repita o êmbolo outros líquidos dois anéis.
- Sanduíche de um filtro de 5 Micron (Small Parts, Inc. nylon filtro, ½ polegada de diâmetro) entre os dois anéis, e empurre o sanduíche na ponta da seringa.
- Seringa balançar mais de um frasco de 50ml cônico.
- Após 10 minutos vortex, o tubo por 30 segundos.
- Centrifugar o tubo por 30 segundos e salvar o sedimento.
- Adicionar 1 ml de EtOH 100% para pelotas. Use a ponta da pipeta para quebrar o pellet, e vortex de 30 segundos. Rotação de 30 segundos e remover EtOH. Repita mais 2 vezes.
- Adicionar 1 ml de etanol 100% para a pelota (romper com ponta). Coloque isso no 5 Micron filtro e deixá-lo fluir através de gravidade para dentro do tubo cônico de 50ml. Use mais EtOH conforme necessário para lavar tubo ou ajudar com a fluir.
- Girar o tubo de 50ml a 2000 rpm em centrífuga por 5-10 minutos. Remover o sobrenadante, salve pellet.
- Dependendo da densidade desejada de microcarregadores necessário, adicione 800μl-1,5 ml EtOH 100% e 8 mL correspondente a 15 mL de solução PVP.
- Redemoinho e ir imediatamente para o aparelho PDS-1000/He Biorad.
- Biorad aparelho PDS-1000/He
- Desconectar o tubo que liga o tanque de gás N2 ao tubo de secagem
- Retire secagem Tefzel tubulação da máquina
- Insira uma das extremidades do tubo cônico de 50ml, e anexar uma seringa para a outra extremidade do tubo. Sugar lama marrom no meio do tubo.
- Inserir volta tubulação em máquina.
- Wait (sem rotação) por 4 minutos
- Após 4 minutos, suck off EtOH lenta e cuidadosamente, certificando-se para não perturbar microcarregadores.
- Gire o tubo por 1 minuto.
- Após 1 minuto, ligar o tubo que liga o tanque de gás N 2 para o tubo de secagem e deixe secar por tubos de 15 minutos.
- Após 15 minutos, corte o tubo com o tamanho de bala para ser utilizado imediatamente ou armazenado a 4 ° C em um exsiccator. Balas podem ser armazenados até 3 meses.
Preparação de gene-gun
- Balas lugar em um cartucho. Cada pedaço de retina pode ser um tiro com balas de 1-3.
- Insira o cartucho no gene-gun e anexar a arma a uma fonte de hélio. Ajuste a pressão a 110 Psi.
Preparação dos meios de comunicação
- Médio dissecção
1 frasco de solução Ames (Sigma, 8.8g) Bicarbonato de sódio 1,9 gm 10 ml caneta 1% / strep / L-Glutamine (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml de água destilada para 1L ------------------------------- 1 Litro - Filtro de meio de dissecção utilizando um filtro de 0,22 mM.
- Meio de incubação (500ml)
485 ml de mídia dissecção filtrada 5 ml de suplemento N2 1% (Gibco / Invitrogen) 10ml 1% soro de cavalo (Sigma) 500 mL de vermelho de fenol -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filtrar o meio de incubação utilizando um filtro de 0,22 mM.
- Bolha de O 2 no meio de dissecção por 15 minutos antes do início do protocolo de colheita de retina.
Preparação de câmaras de incubação da retina
- Sob um capuz, preencher vários pratos 60 milímetros de profundidade (câmaras de incubação, Nunc) com 25 ml de meio de incubação. O número de pratos depende do número de retINAS necessário.
- Coloque um pé em cada filtro prato fundo. Apenas as pontas muito do suporte não devem ser submersas.
- Coloque todos os pratos profundamente na incubadora até que a retina está pronto.
- Encher dois milímetros de 100 pratos de Petri e trazer para o banco de dissecação.
Preparação de retina de coelho
- Sacrifício de um coelho de acordo com protocolos estabelecidos. O seguinte não tem de ser realizada sob um capuz.
- Com uma tesoura em ângulo, insira-o por trás do olho para a cavidade ocular do coelho, o corte das membranas e do nervo óptico que estão ligados aos olhos.
- Levantar delicadamente os olhos e lavá-lo com a mídia dissecção oxigenado.
- Lugar do olho (córnea para cima) no poço de um fatiador de olho e feche a tampa.
- Coloque a lâmina na horizontal logo abaixo da tampa. Em um movimento suave, faça a lâmina através do olho para cortar a córnea, deixando um copo de olho.
- Usando pinça, retire a retina do olho slicer bem e colocá-lo em um papel de filtro.
- Remover o vítreo e da lente de fixação uma área perto do nervo óptico cortada e puxando para trás em um papel de filtro. Repita várias vezes até quase todas as vítreo é removido eo cálice olho olha deflacionados.
- Coloque em um copo de olho placa de Petri com meios de dissecção de lavar.
- Corte o copo olho para o número desejado de peças (máximo 5 peças).
- Pegue um pedaço de xícara de olho e colocá-la sob o microscópio.
- Grampo da esclera e coróide levemente juntos na orla da retina usando uma pinça. Com a outra mão, use um pincel fino para escovar certo entre a coróide ea retina.
- Usando short, movimentos suaves, arreliar a retina fora da coróide, até que se desprenda.
- Corte de 1 polegada fora de uma pipeta de transferência estéril. Use isso para sugar até a retina e coloque em uma placa de Petri de meio de incubação para se lavar.
- Usando outra pipeta de transferência estéril com 1 polegada cortado, transferir cuidadosamente a retina em um 0,4 mM Millicell filtro (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Use uma escova para orientar a retina com o lado de células ganglionares para cima.
- Achatar a retina, escovando levemente as bordas da retina. Minimizar tocar a camada de células ganglionares com o pincel, tanto quanto possível.
- Remova o meio de excesso de filtro com uma pipeta.
- Utilizando uma pinça, transferir o filtro em um suctioner modificado. Desenhar na suctioner 2-3 vezes para remover todos os suportes a incubação do filtro.
Projeção de genes e de incubação de retina
- Sob um capuz, coloque cada um dos retina contendo filtros para as arquibancadas do filtro na 60 milímetros pratos profundo (câmaras de incubação).
- Garantir que o meio está em contato com a parte inferior do filtro e que o meio não derramar sobre os lados do filtro sobre a retina. O filtro deve funcionar como um interface entre a retina e médias empresas.
- Fotografar cada pedaço de retina com duas balas. Lugar arma gene diretamente acima do tecido, cerca de 3-4 cm de distância.
- Coloque todas as câmaras de incubação em um shaker no 35-37 ° C incubadora.
- Substituir por meio de incubação a cada dia. A retina pode ser incubados por um período máximo de 6 dias.
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Discussion
1. O que posso fazer com este método?
- Ver claramente a morfologia das células.
- Células rótulo para gravar com eles.
- Superexpressam proteínas, como PSD95, mas também outras proteínas que modulam a resposta da célula, por exemplo, canais iônicos, receptores.
- Expressar RNAs inibitória.
2. Quanto tempo eu posso manter retina adulta?
- 4 dias não é problema para o coelho adulto. Seis dias depois, as células olhar "doente", ou seja, os axônios retrair, você vê inchaço dos dendritos ea gravação de respostas luz torna-se pouco confiável (apenas ~ 50% das células foram encontrados para ser luz de resposta após esse período.
- Mantivemos rato retinas por 2 dias. Os ratos são mais difíceis, porque as retinas são vascularizados, e também mais grosso do que retina de coelhos.
3. Como posso ter certeza de sua retina é saudável após este tempo?
- O padrão ouro é a gravação a partir deles. Células ganglionares deve ainda reagem à luz. Você deve proteger o seu tecido de luz durante a incubação para evitar o branqueamento os fotopigmentos, porque você tem que dissecar a retina fora do epitélio pigmentar de incubação.
- Ocasionalmente também usado gravação conjunto de microeletrodos para testar nossas retinas.
4. Por que você quer manipular apenas algumas células da retina de cada vez?
- Algumas perguntas não podem ser resolvidos de outra forma. Considere, por exemplo, receptores GABA em um gânglio. Você pode usar bloqueadores GABA, mas inibiria toda a transmissão GABAérgica na retina, não basta introduzir a para a célula você está interessado polegadas Pode ser muito difícil distinguir entre um efeito sobre a célula em particular, e em geral os efeitos "da rede "em toda a retina.
- Se você quiser ver a morfologia claramente, você não pode rotular todas as células, caso contrário, você fica uma bagunça.
5. Este método é apropriado como uma população mancha?
- Não. projeção Gene é um procedimento aleatório. Você vai ter células ganglionares muitas, muitas células amácrinas deslocadas, algumas células Muller, e muito menos de todos os outros tipos celulares.
6. Há algum "truques" Eu tenho que saber fazê-la funcionar?
- Não realmente. Mas é importante que você faça a dissecção da retina de forma relativamente rápida, assim que você tem suas peças no filtro em menos de 30 minutos. As peças não deve ser muito pequeno, cerca de um centímetro quadrado é ok. Espere 3-4 pedaços de um olho de coelho.
- Mantenha as ferramentas de sua dissecção estritamente longe de qualquer coisa que entra em contato com fixadores e outros produtos químicos.
- Tente definir sua incubadora a 35 ° C em vez de 37, então a retina nunca fica muito quente.
- Você não precisa adicionar fatores de crescimento como BDNF para o seu meio, pelo menos não fazemos isso rotineiramente, mas você deve usar suplemento N2, soro de cavalo 1%, e antibióticos. Nós fornecemos uma lista de todas as coisas que você e vai precisar de um arquivo complementar a esta documentação.
7. Você poderia gene-gun outras coisas, ao invés de plasmídeos?
- Sim, temos utilizado corante conjugada dextranos ou DII e Dio. Mas você poderia usar o cálcio indicador de corantes, ou praticamente qualquer coisa que você pode casaco para balas de ouro ou tungstênio.
8. Quais são as limitações?
- Primeiro de tudo, tempo. Você tem que cortar o nervo óptico, o que significa que as células ganglionares acabará por degenerar. Este não é um problema por até seis dias, mas depois que nós não confiaria as retinas mais. Agora, se você quiser apenas para expressar GFP ou algum outro celular de enchimento marcador, uma incubação de 2-3 dias é suficiente, mas em alguns casos, como quando você quer expressar RNAs inibitório, o efeito pode demorar 4 ou mais dias para show. Aqui, você tem que manter o cronograma em mente.
9. Que o trabalho do outro pesquisador deve estar ciente de uma?
- No campo retina, certamente laboratório Rachel Wong da Universidade de Washington. Há também um monte de trabalho as pessoas têm feito em outros sistemas, como preparação fatia hipocampo. Nós não pretendemos ser capazes de dar um levantamento completo da literatura, mas verifique os papéis na lista de referências.
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