Linjärisering av Bradford Protein-analys

Summary

Noggrannheten och känslighet av protein bestämning genom den snabba och bekväma Bradford analys äventyras av inneboende olinjäritet. Vi visar en enkel linjärisering förfarande som kraftigt ökar noggrannheten, förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, och minskar störningar av rengöringsmedel.

Abstract

Fastställande av mikrogram mängder protein i Bradford Coomassie lysande blå analys sker genom mätning av absorbansen vid 590 nm. Det vanligaste analys möjliggör snabb och enkel protein kvantifiering i cell lysates, cellfraktioner, eller rekombinant prover protein, i syfte att normalisering av biokemiska mätningar. Men kompromisser en inneboende olinjäritet känslighet och precision med denna metod. Det är visat att under vanliga analys villkor, är förhållandet mellan absorbansen mätningar vid 590 nm och 450 nm strikt linjär med protein koncentration. Detta enkla förfarande ökar noggrannheten och förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, tillåter kvantifiering ner till 50 ng bovint serumalbumin. Dessutom är störningen vanligtvis införts genom rengöringsmedel som används för att skapa cellen lysates kraftigt minskas med det nya protokollet. En linjär ekvation utvecklades på grundval av massaktioner och öl lag passar perfekt i experimentella data.

Protocol

Linjärisering av Bradford Protein kalibreringskurvan:

Den Coomassie lysande blå protein analys, känd som Bradford analys ^1, används ofta på grund av dess snabba och bekväma protokoll samt dess relativa känslighet. Tyvärr finns det ett stort mått av krökning över ett brett spektrum av protein koncentrationer (Fig. 1). Därför är endast en liten del av relativt hög proteinhalt koncentrationer, 2-10 mg / ml BSA, som används för kalibreringskurvan, som då bättre passar linjär regression (Figur 1, grön). Kräver dock olinjäritet protein koncentrationen av okända prover falla inom det begränsade utbudet av kalibreringskurvan för att undvika ett stort fel, och det minskar också riktigheten i begränsad räckvidd. Den olinjäritet utgör ett allvarligt problem i synnerhet när mikrogram mängder protein inte är tillgängliga, och det kräver ofta flera spädningar av okända prover.

Som nämnts i den ursprungliga Bradford papper, "källan för olinjäritet i reagenset sig eftersom det finns en överlappning i det spektrum av de två olika färger former av färgen." ^1. Faktum är att tre former av Coomassie lysande blå färg är syra-bas jämvikt vid den vanliga sura pH-analysen ^2. Den röda, blå och gröna former har absorbans maxima vid 470, 590 och 650 nm, respektive (Fig. 2). Den blå är den form som binder protein, som bildar ett komplex som intensivt absorberar ljus vid 594 nm ^{3, 4} (Fig. 2). Bradford noterade också att "bakgrunden värdet för reagens ständigt minskar som mer färgämne är bundet till protein" ¹ (Fig. 3). Därför försökte vi att beräkna minskningen av 590 nm bakgrunden som ökar protein mängd tillsätts, genom att mäta förändringen i absorbans vid 450 nm, där protein-dye komplex inte absorbera. Vi fann att den minskande bakgrunden delvis, men inte fullt ut, står för den olinjäritet (bild 4).

Vi sedan hypotes att minskning i färg koncentration ger en annan förvrängning av linjär respons, för som protein-dye bindningen är i jämvikt ^5, beror komplexbildning inte bara på koncentrationen av de fria protein, men också på att den fria färgämnet (bild 5). Med hänsyn till både frågor som rör den rörliga koncentrationen av den fria färg, vi utvecklat en matematisk ekvation som beskriver ett linjärt samband mellan protein koncentration och förhållandet absorbansmätningar, 590 nm över 450 nm (bild 6). En detaljerad beskrivning av den teoretiska och experimentella studier finns i vår 1996 offentliggörs i Analytical Biochemistry ^6. Den matematiska ekvation experimentellt testats och befunnits ge en linjär kalibreringskurva över hela proteinet koncentrationer sortiment (bild 7). Dessutom var den ekvationen valideras också av en oberoende bestämning av rätt pH-beroende värden på Y-axeln skärningspunkt ^6.

Detaljerade protokoll för förbättrad Bradford Protein-analys, med hjälp av en Reader mikroplattor Absorbans:

1. Förbered en 0,1 mg / ml stamlösning av standarden, bovint serumalbumin. Någon annan standard kan väljas, men observera att samma standard ska användas i alla experiment.
2. Späd okända prov i avjoniserat vatten. Sikta på att 5-50 mikrog / ml. Men högre eller lägre protein koncentrationer är acceptabla, eftersom det inte finns någon uppenbar gräns för den linjära skalan för analysen. Dock måste mätningen vara inom det linjära intervallet för absorbansen läsaren.
3. Späd Bradford reagens (Bio-Rad) 2,5 gånger i avjoniserat vatten.
4. Lägg till 0 och 10-50 ìl av BSA stamlösning till tre exemplar brunnar (skapa en 0-5 mikrogram BSA kalibreringskurva). Komplettera med avjoniserat vatten till 100 l / brunn.
5. I olika brunnar, tillsätt 100 l av okänt prov i tre exemplar. Flera koncentrationer av det okända provet kan användas för att öka noggrannheten.
6. Tillsätt 100 l av den utspädda Bradford reagens i alla brunnar. Total volym är 200 l / brunn.
7. Vänta minst 5 min, men inte mer än 60 min för färg utveckling.
8. Den tomma måste vara 200 l avjoniserat vatten (och inte noll proteinet färg också).
9. Mäta absorbansen vid 590 nm och vid 450 nm.
10. Förbered en kalibreringskurva genom att dividera absorbansvärden vid 590 nm och vid 450 nm. Observera att nollan protein (färgämnet endast) Värdet bör ingå som en datapunkt (bild 8).
11. Beräkna koncentrationen av det okända provet bygger på den linjära ekvationen för kalibreringskurvan (Fig. 9).

Representativa resultat:

Till skillnad från absorbansen vid en enda våglängd på 590 nm, förhållandet absorbansvärden, 590 nm över 450 nm, är linjär wed proteinkoncentration (Fig. 10).

Proteinhalten i det okända provet kan helt enkelt beräknas enligt den linjära ekvationen för kalibreringskurvan (Fig. 10, en ekvation).

Dock är ökad noggrannhet erhålls genom att mäta flera okända provspädningar. För detta ändamål förbereda två grafer. Den första är en kalibreringskurva för standard med mikrogram protein på X-axeln (bild 11 till höger). Det andra diagrammet är för det okända provet med ìl av det ursprungliga outspätt prov på X-axeln (Fig. 11, vänster). Färgen enda värde bör ingå i båda graferna (Fig. 11). Proteinhalten i det okända provet erhålls genom att dividera sluttningarna av det okända provet och standardavvikelsen (Fig. 11, en ekvation).

Figur 1. Konventionell Bradford kalibreringskurva. Den linjära intervallet representeras av gröna symboler.

Figur 2. Spectra av proteinet-dye komplex och färgen ensam.

Figur 3. Protein-dye jämvikt.

Figur 4. Minskning av den beräknade korrekta bakgrunden minskar delvis olinjäritet.

Figur 5. Protein-dye jämvikt.

Figur 6. Matematisk grund för linjärisering av Bradford proteinet analysen.

Figur 7. Linjärisering av Bradford kalibreringskurvan.

Figur 8. Beräkning av värden Absorbansförhållande.

Figur 9. En linjär Bradford kalibreringskurva.

Figur 10. Linjärisering av Bradford kalibreringskurvan.

Figur 11. Okänt prov-koncentration beräkning.

Discussion

The Bradford protein-analysen är populär tack vare sin lätthet av prestanda och relativ känslighet. Den linjärisering över hela proteinet koncentrationer intervall som protokollet presenteras här ytterligare förenklar analysen, eftersom okända prover behöver inte faller inom intervallet för kalibreringskurvan.

Viktigt ger förbättrade protokollet vidare följande fördelar jämfört med den ursprungliga Bradford protokoll:

1. Ökad noggrannhet.
2. Känsligheten ökar med ungefär en storleksordning, vilket gör det möjligt att bestämma så lite som 50 ng BSA i mikroplattan analysen ^6.
3. Den förbättrade känslighet gör att protein kvantifiering i närvaro av tvättmedel. Med den ursprungliga Bradford protokollet skulle inblandning av rengöringsmedel används vanligtvis för cellslys resulterar ofta i ett minskat svar på protein. En förbättring av känsligheten i en storleksordning möjliggör utspädning av proverna upp till en punkt där inblandning av rengöringsmedel elimineras. Observera att standarden proven bör innehålla samma tvättmedel sammansättning och koncentration som i de utspädda okända prover.

Absorbansen toppar protein-dye komplex och fri röd färg formen är på 594 och 470 nm, respektive. Det rekommenderas att mäta absorbansen vid 590-600 nm, för att uppnå maximal känslighet för proteinkoncentrationen förändring, och vid 450-485 nm, för att säkerställa linjärisering.

Tack vare den optiska väglängden övervägande, kan högre noggrannhet uppnås i en 1 ml-analysen där kuvetter placeras i en vanlig spektrofotometer, snarare än en mikroplattor läsare. I så fall skala upp volymerna 5-faldigt.

Det är absolut obligatoriskt att avjoniserat vatten kommer att användas som tomt. En linjär kalibreringskurva kan inte erhållas om noll proteinet standard färg som innehåller prov används som tomt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford reagent	Bio-Rad	500-0006
Bovine Serum Albumin	Amersco	0332
Multiplate absorbance reader	BioTek	Synergy2