Summary
هذا الفيديو يوضح إعداد طبقة مصفوفة / الحليلة رقيقة جدا لتحليل الببتيدات والبروتينات التي كتبها ماتريكس بمساعدة الليزر المج التأين طيف الكتلة (MS - MALDI).
Abstract
هذا الفيديو يوضح إعداد طبقة مصفوفة / الحليلة رقيقة جدا لتحليل الببتيدات والبروتينات التي كتبها ماتريكس بمساعدة الليزر المج التأين مطياف الكتلة (MS - MALDI) 1 ، 2. الأسلوب طبقة رقيقة جدا ينطوي على إنتاج طبقة من البلورات الركيزة المصفوفة (ألفا cyano - 4 - hydroxycinnamic حامض) على لوحة عينة ، التي هي بمثابة بذر الأرض لبلورة اللاحقة من خليط المصفوفة / الحليلة. مزايا الأسلوب طبقة رقيقة جدا اكثر من غيرها من الأساليب ترسيب العينة (الحبرية المجففة مثلا) هو أنه يقدم (ط) لمزيد من التسامح الشوائب مثل الأملاح والمنظفات ، (ب) تحسين القرار ، و (ج) التوحيد أعلى المكاني. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتحديد كتلة دقيقة من البروتينات. وقد وضعت في البداية البروتوكول والأمثل لتحليل البروتينات والأغشية المستخدمة لتحليل بنجاح القنوات الأيونية والناقلين المستقلب ، والمستقبلات ، التي تتضمن بين المجالات عبر الغشاء 2 و 12 2. منذ نشر الأصلي ، وقد أظهرت أيضا أن يكون مفيدا أيضا لتحليل البروتينات القابلة للذوبان. في الواقع ، لقد اعتدنا عليه لعدد كبير من البروتينات وجود مجموعة واسعة من الخصائص ، بما فيها تلك الجماهير الجزيئية تصل إلى 380 كيلو دالتون 3. وهو حاليا لدينا وسيلة لاختيار لتحليل الكتلة الجزيئية لجميع البروتينات. ووصف الإجراء ينتج باستمرار الأطياف عالية الجودة ، وأنها حساسة وقوية ، وسهلة التنفيذ.
Protocol
من المهم جدا ارتداء قفازات مسحوق خالية أثناء إعداد طبقة رقيقة.
تنظيف لوحة عينة
- استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ أو الذهب لوحة عينة MALDI.
- يغسل مع MeOH ويمسح برفق مع Kimwipe. لا تفرك أو فرك السطح مع Kimwipe ، لمنع خدش السطح.
- يغسل مع H 2 O ويمسح برفق مع Kimwipe.
- يغسل مع MeOH ويمسح برفق مع Kimwipe.
- إذا لزم الأمر ، كرر MeOH / H 2 دورة تنظيف O / MeOH ، تنتهي دائما مع MeOH.
- تأكد من عدم وجود بقع الأشباح أو رواسب المتبقية على طبق من ذهب. إذا كان هناك بقع أشباح ، شطف مع الماء منزوع الأيونات وحة بينما فرك السطح مع يدك القفاز (لا تفرك مع Kimwipes). كرر MeOH / H 2 دورة تنظيف O / MeOH.
- استخدام لوحة فورا بعد الغسيل.
إعداد الحل طبقة رقيقة الركيزة
- 1 جزء من مزيج المشبعة HCCA - 4 (2 ACN أجزاء ، الجزء 1 المياه ، و 0.1 ٪ TFA النهائي) و 3 اجزاء الأيزوبروبانول.
ملاحظة : الركيزة طبقة رقيقة حل مستقر للغاية ، ويمكن الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة عام. ويمكن أيضا أن تكون مخزنة في 4 درجات مئوية.
الركيزة صنع طبقة رقيقة
- تطبيق 20 50μL من الحل طبقة رقيقة على الركيزة وسط اليسار من لوحة ، وانتشرت مع الجانب من طرف ماصة. اكتساح في اتجاه واحد.
- كما أن يجف الحل ، يتبخر المذيب العضوي بشكل سريع جدا ، تاركة وراءها قطرات دقيقة من الماء على سطح اللوحة. عند هذه النقطة ، والتفاف السبابة مع رقائق من Kimwipe برفق في البداية وصمة عار على سطح اللوحة معها.
- عندما يتم الافراج عن سطح الأرض من قطرات الماء ، مسح كامل مع لوحة أحادي الاتجاه الاقتراحات التي تجتاح باستخدام Kimwipe.
ملاحظة : إذا لم يتم نشر ما يكفي من حل جميع أنحاء سطح اللوحة ، وزيادة تكوين وإعادة ACN طبقة رقيقة. بعض المعلمات التي قد تؤثر على انتشار يتضمن الحل الرطوبة ودرجة الحرارة المحيطة.
ملاحظة : مع لوحات الذهب ، وطبقة يظهر عادة كانعكاس مصفر ، اعتمادا على عرض وزوايا الضوء. مع ألواح الصلب ، فقط على حافة طبقة مرئيا عادة. - تنظيف حواف الصفيحة مع Kimwipe الطازجة قبل وضعه في حامل لوحة لمنع تلويث مصفوفة من الصك.
إعداد مصفوفة الحل
- 4 - HCCA المشبعة في FWI (3 أجزاء حمض الفورميك ، 1 المياه جزئيا ، 2 أجزاء الأيزوبروبانول) هو الموصى بها لتحليل كل من البروتينات والأغشية القابلة للذوبان. فإنه قد يمكن استخدامها أيضا في حالات خاصة لتحليل الببتيد كبيرة جدا مسعور (M> 4000 ش). تأكد من أن الحل مصفوفة المستخدمة لاكتشاف البروتينات لا يتجاوز المحتوى العضوي ~ 50 ٪ ، لأنها سوف تذوب تماما الركيزة طبقة رقيقة ، بفوزه على مزايا الأسلوب.
اختبار الركيزة طبقة رقيقة
- 0.5μL بقعة من الحل مصفوفة على طبق من ذهب. وسوف يعجل مبيضة تظهر في واجهة بين طبقة رقيقة والحبرية و. عند هذه الطبقة ويغطي الجزء السفلي من قطرة تماما ، وعادة في غضون 10-15 ثانية ، نضح السائل الزائد مع خط فراغ. إذا كان يستغرق وقتا أطول من 30 ثانية ليعجل إلى النموذج ، هو مؤشر على أنه قد يكون هناك مشكلة مع الركيزة طبقة رقيقة و / أو حل المصفوفة.
تطبيق نموذج
- وينبغي تركيز الحليلة في الحلول بدءا يكون ضمن 10 و 1000μM.
- تمييع الحل الحليلة في حل مصفوفة لتركيز الحليلة النهائي بين 0.2 و 2μM. على سبيل المثال ، مع بدء 1μl العينة و9μl حل المصفوفة.
ملاحظة : تأكد من أن المصفوفة على مقربة من كونها مشبعة في الحل النهائي ، وإلا سوف redissolve الركيزة طبقة رقيقة.
ملاحظة : الحليلة التركيزات المطلوبة للحصول على إشارات لائق تعتمد اعتمادا كبيرا على تعقيد الحل والتكوين (على سبيل المثال ، والملوثات) وionizability الحليلة.
ملاحظة : إذا كان تخفيف خطوة واحدة لا تسفر عن نتائج جيدة ، يجب أن تحاول تخفيف خطوة أخرى. على الرغم من بديهية وحلول الحليلة مركزة للغاية نادرا ما تسفر أطياف جيدة.
ملاحظة : البروتينات الغشائية وعادة ما يتطلب أكبر التخفيفات. - 0.5μl بقعة من العينة / مصفوفة الخليط على طبق من ذهب. وسوف يعجل شكل بيضاء في واجهة بين طبقة رقيقة والحبرية و. هذا هو cocrystallization يعجل من المصفوفة وتحليلها. عند هذه الطبقة ويغطي الجزء السفلي من قطرة تماما ، أوسوالحليف خلال 10-15 ثانية ، ونضح السائل الزائد مع خط فراغ. إذا كان يستغرق وقتا أطول من 30 ثانية ليعجل في تكوين ، فإنه قد يكون مؤشرا لحاضر الملوثات ، مما يحول دون تبلور ، أو يتركز جدا تحليلها الخاص.
Calibrant التطبيق
- تحضير الخليط calibrant / مصفوفة بطريقة مماثلة مع التركيز إلى calibrant النهائي بين 0.5μM - 0.1.
- بقعة 0.5μl calibrant / مصفوفة الخليط على لوحة على مقربة من البقع العينة. ويستخدم هذا القرب المادي في إجراء المعايرة الزائفة الداخلية التي انتقلت لوحة من ركلة عينة من البقعة calibrant خلال اقتناء العينة ، إضافة إلى لقطات ليزر قليلة من calibrants لطيف. هذا النهج يضمن دقة أعلى من كتلة المعايرة المعايرة الخارجي فقط.
خطوة الغسيل
- يغسل كل بقعة تقريبا مع 2μL من الجليد الباردة 0.1 ٪ TFA حل مائي. نضح السوائل الزائدة مع خط فراغ.
اقتناء أطياف الشامل
- أنت الآن على استعداد للحصول على الأطياف الشامل. إذا كنت تستخدم مصفوفة FWI الحل ، يجب عليك الحصول على أطياف الخاص في أقرب وقت ممكن لمنع تعديل لا رجعة فيها لتحليلها مثل formylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
