Summary
यह वीडियो मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI एमएस) के द्वारा पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक अति पतली परत / analyte मैट्रिक्स की तैयारी को दर्शाता है.
Abstract
यह वीडियो मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI एमएस) 1, 2 द्वारा पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक अति पतली परत / analyte मैट्रिक्स की तैयारी को दर्शाता है. अति पतली परत पद्धति मैट्रिक्स क्रिस्टल की एक सब्सट्रेट परत का नमूना थाली है, जो एक मिश्रण / मैट्रिक्स analyte के बाद crystallization के लिए एक बोने की जमीन के रूप में कार्य करता है पर उत्पादन (अल्फा cyano-4-hydroxycinnamic एसिड) शामिल है. अन्य नमूना बयान दृष्टिकोण (जैसे सूखे छोटी बूंद) से अधिक अति पतली परत विधि के लाभ हैं कि यह (i) के अधिक से अधिक ऐसे लवण और डिटर्जेंट, (ii) बेहतर संकल्प, और (iii) उच्च स्थानिक एकरूपता के रूप में दोष सहिष्णुता प्रदान करता है. इस विधि प्रोटीन का सटीक मास निर्धारण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. प्रोटोकॉल शुरू और विकसित किया गया था झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण के लिए और अनुकूलित करने के लिए सफलतापूर्वक आयन चैनल, metabolite ट्रांसपोर्टरों, और रिसेप्टर्स का विश्लेषण किया, 2 और 12 transmembrane 2 डोमेन के बीच युक्त. मूल प्रकाशन के बाद से, यह भी घुलनशील प्रोटीन का विश्लेषण के लिए समान रूप से उपयोगी हो सकता है दिखाया गया है. दरअसल, हम यह आणविक 380 3 केडीए के रूप में उच्च के रूप में जनता के साथ उन सहित, गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला वाले प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के लिए इस्तेमाल किया है. यह वर्तमान में सभी प्रोटीन की आणविक जन विश्लेषण के लिए हमारी पसंद की विधि है. वर्णित प्रक्रिया लगातार उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा के उत्पादन, और यह संवेदनशील, मजबूत, और लागू करने के लिए आसान है.
Protocol
यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए पतली परत की तैयारी के दौरान पाउडर से मुक्त दस्ताने पहनना.
नमूना थाली की सफाई
- एक स्टेनलेस स्टील या सोने MALDI नमूना प्लेट का उपयोग करें.
- MeOH से धो और Kimwipe साथ धीरे पोंछ. रगड़ना या Kimwipe सतह के साथ साफ़, सतह scratching को रोकने के मत करो.
- एच 2 हे के साथ धो और Kimwipe साथ धीरे पोंछ .
- MeOH से धो और Kimwipe साथ धीरे पोंछ.
- यदि आवश्यक हो, MeOH / एच 2 / हे MeOH सफाई चक्र दोहराने के लिए, हमेशा MeOH के साथ समाप्त.
- यकीन है कि वहाँ कोई भूत धब्बे या अवशेषों थाली पर शेष हैं. अगर वहाँ भूत धब्बे होते हैं, विआयनीकृत जल के साथ थाली कुल्ला जबकि अपने दस्ताने हाथ (Kimwipes के साथ रगड़ मत) के साथ सतह रगड़. MeOH / एच 2 / हे MeOH चक्र सफाई दोहराएँ.
- धोने के बाद तुरंत प्लेट का उपयोग करें.
पतली परत के सब्सट्रेट समाधान की तैयारी
- मिक्स संतृप्त (2 ACN भागों, 1 हिस्सा पानी, और 0.1% अंतिम TFA) 4 - HCCA और 3 isopropanol भागों के भाग 1.
नोट: पतली परत के सब्सट्रेट समाधान बहुत ही स्थिर है, और कमरे के तापमान पर एक वर्ष के लिए अंधेरे में रखा जा सकता है है . यह भी 4 पर संग्रहीत किया जा सकता है है डिग्री सेल्सियस
पतली परत के सब्सट्रेट बनाना
- प्लेट के बीच छोड़ दिया, और एक विंदुक टिप के पक्ष के साथ प्रसार पर पतली परत के सब्सट्रेट समाधान के 20 50μL लागू. एक दिशा में स्वीप.
- समाधान dries, कार्बनिक विलायक बहुत जल्दी evaporates, थाली की सतह पर पानी की बूंदों मिनट के पीछे छोड़ने के रूप में. इस बिंदु पर, Kimwipe की प्लाई और शुरू धीरे इसके साथ थाली की सतह दाग के साथ अपने सूचकांक उंगली लपेटो.
- जब सतह पानी की बूँदों से मुक्त है, ऊनि दिशात्मक व्यापक Kimwipe का उपयोग गतियों के साथ पूरी थाली पोछ लो.
नोट: यदि समाधान काफी थाली की सतह भर में फैल नहीं है, ACN संरचना को बढ़ाने के लिए और पतली परत विश्राम. कुछ पैरामीटर है कि समाधान के प्रसार को प्रभावित कर सकता है परिवेश नमी और तापमान में शामिल हैं.
नोट: सोने की प्लेट के साथ, परत आमतौर पर एक पीले रंग के प्रतिबिंब के रूप में प्रकट होता है, देखने और प्रकाश कोण पर निर्भर करता है. स्टील प्लेट के साथ, केवल परत के किनारे आम तौर पर दिख रहा है. - यह थाली धारक में रखने के साधन contaminating से मैट्रिक्स को रोकने के पहले एक ताजा Kimwipe के साथ थाली के किनारों को साफ.
मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
- 4-HCCA संतृप्त (3 चींटी एसिड भागों, 1 हिस्सा पानी, 2 भागों isopropanol) FWI में दोनों झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन के विश्लेषण के लिए सिफारिश की है . यह भी बहुत hydrophobic बड़े पेप्टाइड्स (एम> ४००० यू) के विश्लेषण के लिए विशेष मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि मैट्रिक्स प्रोटीन खोलना करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान ~ 50% कार्बनिक सामग्री से अधिक नहीं करता है के रूप में यह पूरी तरह पतली परत के सब्सट्रेट भंग विधि के लाभ को हराने.
पतली परत के सब्सट्रेट का टेस्ट
- थाली पर मैट्रिक्स समाधान के स्पॉट 0.5μL. एक सफेद वेग पतली परत और छोटी बूंद के बीच इंटरफेस पर दिखाई देगा. जब इस परत की छोटी बूंद के नीचे पूरी तरह से शामिल किया गया है, आमतौर पर 10-15 सेकंड के भीतर, एक शून्य रेखा के साथ अतिरिक्त तरल aspirate. यदि यह फार्म करने के लिए वेग के लिए 30 सेकंड से अब लगता है, यह एक संकेत है कि वहाँ पतली परत के सब्सट्रेट और / या मैट्रिक्स समाधान के साथ एक समस्या हो सकती है.
नमूना अनुप्रयोग
- समाधान में शुरू analyte एकाग्रता 10 और 1000μM के भीतर होना चाहिए.
- मैट्रिक्स समाधान में 0.2 और 2μM के बीच अंतिम analyte एकाग्रता analyte समाधान पतला. उदाहरण के लिए, नमूना और मैट्रिक्स समाधान के 9μl 1μl के साथ शुरू करते हैं.
नोट: सुनिश्चित करें कि मैट्रिक्स के लिए अंतिम समाधान में संतृप्त होने के करीब है, अन्यथा तुम पतली परत के सब्सट्रेट redissolve जाएगा.
नोट: analyte सभ्य संकेतों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक सांद्रता अत्यधिक समाधान की जटिलता और संरचना (जैसे, contaminants) और analyte ionizability पर निर्भर हैं.
नोट: यदि एक एकल कदम कमजोर पड़ने अच्छे परिणाम उपज नहीं है, तो आप एक और कमजोर पड़ने कदम की कोशिश करनी चाहिए . हालांकि काउंटर सहज ज्ञान युक्त, अत्यधिक ध्यान केंद्रित analyte समाधान शायद ही कभी अच्छा स्पेक्ट्रा का उत्पादन.
नोट: झिल्ली प्रोटीन आमतौर पर बड़े dilutions की आवश्यकता है. - नमूना / मैट्रिक्स मिश्रण की थाली पर स्पॉट 0.5μl. एक सफेद तलछट पतली परत और छोटी बूंद के बीच इंटरफेस पर फार्म जाएगा. यह वेग मैट्रिक्स और analyte के cocrystallization है. जब इस परत की छोटी बूंद के नीचे पूरी तरह से शामिल किया गया अमूमन,सहयोगी 10-15 सेकंड के भीतर, एक शून्य रेखा के साथ अतिरिक्त तरल aspirate. यदि यह फार्म करने के लिए वेग के लिए 30 सेकंड से अब लगता है, यह एक contaminant मौजूद है, जो crystallization रोकता है, या अपने analyte भी ध्यान केंद्रित किया है की एक संकेत हो सकता है.
Calibrant आवेदन
- 0.1-0.5μM के बीच अंतिम calibrant एकाग्रता के साथ एक समान तरीके में calibrant / मैट्रिक्स मिश्रण तैयार करें.
- नमूना स्पॉट करने के लिए करीब निकटता में थाली पर स्पॉट 0.5μl / calibrant मैट्रिक्स मिश्रण. यह शारीरिक निकटता एक छद्म आंतरिक अंशांकन प्रक्रिया है जिसमें थाली नमूना जगह से नमूना अधिग्रहण के दौरान calibrant हाजिर, स्पेक्ट्रम के लिए कुछ लेजर calibrants के शॉट्स जोड़ने के लिए ले जाया जाता है में प्रयोग किया जाता है. यह दृष्टिकोण केवल बाहरी अंशांकन की तुलना में एक उच्च जन सटीकता अंशांकन की गारंटी देता है.
कदम धुलाई
- लगभग एक बर्फ का ठंडा 0.1% जलीय TFA समाधान के 2μL के साथ हर जगह धो लें. एक शून्य रेखा के साथ अतिरिक्त तरल Aspirate.
जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण
- अब आप जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के लिए तैयार हैं. यदि आप FWI मैट्रिक्स समाधान का उपयोग करते हैं, तो आप अपने स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के रूप में के रूप में जल्द से जल्द formylation जैसे analyte के लिए अपरिवर्तनीय संशोधन को रोकने के लिए चाहिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
