Summary
וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה / אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).
Abstract
וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה / אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS) 1, 2. השיטה דקים שכבת כולל ייצור של שכבת המצע של גבישים מטריקס (אלפא cyano-4-hydroxycinnamic חומצה) על הצלחת המדגם, אשר משמש קרקע זריעת לגיבוש הבאות של תערובת מטריצה / אנליטי. יתרונות השיטה דקים שכבת פני גישות אחרות בתצהיר מדגם (טיפה מיובשים למשל) הם שהוא מספק (i) סובלנות גדולה יותר זיהומים כמו מלחים דטרגנטים, (ii) רזולוציה טובה יותר, וכן (iii) אחידות מרחבית גבוהה יותר. שיטה זו שימושית במיוחד לקביעת המסה המדויקת של החלבונים. פרוטוקול פותחה בתחילה אופטימיזציה עבור ניתוח של חלבונים בממברנה ומשמש בהצלחה לנתח תעלות יונים, מובילי המטבוליט, ואת הקולטנים, המכיל בין 2 ל 12 תחומים הטרנסממברני 2. מאז פרסום מקורי, הוא הראה גם להיות שימושי באותה מידה לניתוח חלבונים מסיסים. אכן, יש לנו השתמשתי בה עבור מספר גדול של חלבונים בעל מגוון רחב של תכונות, כולל אלה עם ההמונים מולקולרי גבוה ככל 380 kDa 3. עכשיו שיטת הבחירה שלנו לצורך ניתוח המסה המולקולרית של כל החלבונים. ההליך המתואר באופן עקבי מייצרת באיכות גבוהה ספקטרה, והוא רגיש, חזק, וקל ליישום.
Protocol
חשוב מאוד ללבוש אבקת ללא כפפות במהלך תקופת ההכנה של שכבת דק.
ניקוי הצלחת מדגם
- השתמש נירוסטה או ציפוי זהב MALDI המדגם.
- לשטוף עם MeOH ולנגב בעדינות עם Kimwipe. אל תשפשפו או תגרדו את פני השטח עם Kimwipe, כדי למנוע מגרד את פני השטח.
- לשטוף עם H 2 O ולנגב בעדינות עם Kimwipe.
- לשטוף עם MeOH ולנגב בעדינות עם Kimwipe.
- אם יש צורך, חזור MeOH / H 2 O / MeOH מחזור ניקוי, תמיד וכלה MeOH.
- ודא כי אין כתמים רפאים או שאריות שנותרו על הצלחת. אם יש כתמים רפאים, לשטוף את הצלחת במים deionized תוך שפשוף פני השטח עם יד בכפפה שלך (לא לשפשף עם Kimwipes). חזור על MeOH / H 2 O / MeOH מחזור הניקוי.
- השתמש צלחת מיד לאחר הכביסה.
הכנת הפתרון שכבה דקה המצע
- לערבב 1 חלק רווי 4-HCCA (2 חלקים ACN, 1 חלק מים, ו - 0.1% TFA סופי) ו 3 חלקים isopropanol.
הערה: פתרון דק שכבת המצע הוא יציב מאוד, אפשר לשמור בטמפרטורת החדר בחושך במשך שנה. זה עשוי גם להיות מאוחסן ב -4 ° C.
ביצוע המצע שכבה דקה
- החל 20-50μL של הפתרון המצע שכבה דקה על מרכז שמאל של הצלחת, ופרש עם הצד של הטיפ פיפטה. טאטא בכיוון אחד.
- ככל מתייבש פתרון, מתאדה ממס אורגני מהר מאוד, והותיר אחריו טיפות זעירות של מים על פני הצלחת. בשלב זה, לעטוף את האצבע המורה עם רובדי של Kimwipe ובתחילה כתם בעדינות את פני השטח של צלחת עם זה.
- כאשר פני השטח הוא משתחרר מן טיפות מים, לנגב את הצלחת עם כל חד כיוונית תנועות רחבות באמצעות Kimwipe.
הערה: אם הפתרון אינו מספיק להתפשט בכל רחבי השטח צלחת, להגדיל את הרכב ACN ו מחדש את שכבה דקה. כמה פרמטרים שעשויים להשפיע על התפשטות של הפתרון כוללים חום ולחות הסביבה.
הערה: עם צלחות זהב, שכבת מופיע בדרך כלל כהשתקפות צהבהב, תלוי זוויות צפייה אור. עם לוחות פלדה, רק את הקצה של השכבה גלוי בדרך כלל. - נקו את הקצוות של צלחת עם Kimwipe טרי לפני הצבת אותו מחזיק את הצלחת כדי למנוע זיהום של מטריקס מכשיר.
הכנת התמיסה מטריקס
- רווי 4-HCCA ב FWI (3 חלקים חומצה פורמית, 1 חלק מים, 2 חלקים isopropanol) מומלץ ניתוח קרום והן חלבונים מסיסים. זה יכול לשמש גם במקרים מיוחדים לצורך ניתוח של פפטידים גדולים מאוד הידרופובי (M> 4000 u). ודא כי פתרון מטריצה המשמשת תצפית החלבונים אינו עולה ~ תוכן אורגניים 50%, כפי שהוא לחלוטין לפזר את המצע שכבה דקה, להביס את היתרונות של השיטה.
מבחן של המצע שכבה דקה
- ספוט 0.5μL מהפתרון מטריקס על הצלחת. משקע לבנבן יופיעו בממשק שבין שכבת דק ואת רביב. כאשר שכבה זו מכסה את החלק התחתון של אגל לחלוטין, בדרך כלל בתוך 10-15 שניות, לשאוב את הנוזל העודף עם קו ריק. אם זה לוקח יותר זמן מאשר 30 שניות לזרז את הטופס, הוא אינדיקציה לכך שאולי יש בעיה עם המצע שכבה דקה ו / או פתרון מטריקס.
לדוגמה יישום
- ריכוז אנליטי של פתרונות המוצא צריכה להיות בטווח של 10 ו 1000μM.
- לדלל את פתרון אנליטי בפתרון מטריצה כדי ריכוז אנליטי הסופי בין 0.2 ל 2μM. למשל, להתחיל עם 1μl של מדגם 9μl של פתרון מטריקס.
הערה: ודא כי המטריצה קרוב להיות רווי הפתרון הסופי, אחרת אתה תהיה redissolve המצע שכבה דקה.
הערה: ריכוזים אנליטי נדרש לקבל אותות הגון הם תלויים במידה רבה על מורכבותו פתרון הרכב (למשל, מזהמים) ו ionizability אנליטי.
הערה: אם דילול בשלב יחיד אינו להניב תוצאות טובות, כדאי לך לנסות עוד צעד דילול. למרות נגדית אינטואיטיבי, פתרונות אנליטי מרוכז מאוד נדירות לייצר ספקטרום טוב.
הערה: חלבונים ממברנה בדרך כלל דורשים דילולים גדולים יותר. - ספוט 0.5μl תערובת מדגם / מטריצה על הצלחת. משקע לבנבן יהוו בממשק שבין שכבת דק ואת רביב. משקע זה cocrystallization של מטריקס אנליטי. כאשר שכבה זו מכסה את החלק התחתון של אגל לחלוטין, usuברית בתוך 10-15 שניות, לשאוב את הנוזל העודף עם קו ריק. אם זה לוקח יותר מ -30 שניות עבור לזרז את הטופס, זה עשוי להיות אינדיקציה להציג המזהם, אשר מונע התגבשות, או אנליטי שלך מרוכז מדי.
Calibrant יישום
- מכינים את תערובת calibrant / מטריצה באופן דומה עם ריכוז calibrant הסופי בין 0.1-0.5μM.
- ספוט 0.5μl calibrant / מטריצה התערובת על הצלחת בסמיכות הנקודות המדגם. קרבה פיזית זו משמש הליך מדומה כיול פנימי שבו צלחת מועבר מן המקום מדגם למקום calibrant במהלך הרכישה המדגם, כדי להוסיף כמה יריות לייזר calibrants כדי הספקטרום. גישה זו מבטיחה דיוק גבוהה יותר מאשר המסה כיול כיול חיצוני בלבד.
כביסה צעד
- לשטוף עם כל נקודה כ 2μL של פתרון קרים כקרח 0.1% TFA מימית. לשאוב נוזל עודף עם קו ריק.
רכישת ספקטרום המונית
- כעת אתה מוכן לרכוש ספקטרה המונית. אם אתה משתמש בפתרון מטריצה FWI, עליך לרכוש ספקטרה שלך בהקדם האפשרי כדי למנוע שינוי בלתי הפיך אנליטי, כגון formylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
