Summary
Denna video visar att förbereda en ultratunn matris / analyt lagret för att analysera peptider och proteiner av Matrix-assisterad laser desorption Ionization masspektrometri (MALDI-MS).
Abstract
Denna video visar att förbereda en ultratunn matris / analyt lagret för att analysera peptider och proteiner av Matrix-assisterad laser desorption Ionization masspektrometri (MALDI-MS) 1, 2. Den ultra-tunna skikt metoden innebär produktion av ett substrat lager av matris kristaller (alfa-cyano-4-hydroxycinnamic acid) på provet plattan, som fungerar som en seedning grund för efterföljande kristallisation av en matris / analyt blandning. Fördelar med ultra-tunna skikt metod under andra metoder prov nedfall (t ex torkad droppe) är att det ger (i) en större tolerans mot föroreningar som salter och rengöringsmedel, (ii) bättre upplösning, och (iii) högre spatial enhetlighet. Denna metod är speciellt användbar för noggrann bestämning av massan av proteiner. Protokollet utvecklades från början och optimerad för analys av membranproteiner och används för att framgångsrikt analysera jonkanaler, metabolit transportörer och receptorer, som innehåller mellan 2 och 12 transmembrane domäner 2. Sedan den ursprungliga publiceringen, har det också visat sig vara lika användbart för analys av lösliga proteiner. Vi har faktiskt använt den för ett stort antal proteiner som har ett brett utbud av fastigheter, inklusive de med molekylära massorna så hög som 380 kDa 3. Det är för närvarande vår metod för val för molekylmassa analys av alla proteiner. Det beskrivna förfarandet ger konsekvent hög kvalitet spektra, och det är känsligt, robust och lätt att genomföra.
Protocol
Det är mycket viktigt att bära puderfria handskar under utarbetandet av den tunna skikt.
Rengöring av provet plattan
- Använd en rostfri eller guld MALDI prov plattan.
- Tvätta med MeOH och torka försiktigt med en Kimwipe. Gnugga inte eller skrubba ytan med Kimwipe, för att förhindra repor på ytan.
- Tvätta med H 2 O och torka försiktigt med en Kimwipe.
- Tvätta med MeOH och torka försiktigt med en Kimwipe.
- Vid behov, upprepa MeOH / H 2 O / MeOH rengöring, alltid slutar med MeOH.
- Se till att det inte finns några spöke fläckar eller rester kvar på tallriken. Om det finns spöken fläckar, spola plattan med avjoniserat vatten medan gnugga ytan med behandskade hand (Gnugga inte med Kimwipes). Upprepa MeOH / H 2 O / MeOH rengöringscykeln.
- Använd plattan omedelbart efter tvätt.
Beredning av tunna skikt substratlösningen
- Blanda 1 del mättad 4-HCCA (2 delar ACN, 1 del vatten, och 0,1% sista TFA) och 3 delar isopropanol.
Obs: tunt lager substrat lösning är mycket stabil och kan förvaras i rumstemperatur i mörker under ett år. Det kan också förvaras vid 4 ° C.
Göra det tunna lagret substratet
- Applicera 20-50μL av tunt lager substrat lösningen på vänster-mitten av plattan, och spred med sidan av en pipettspetsen. Sopa i en riktning.
- Eftersom lösningen torkar, den organiska lösningsmedel avdunstar mycket snabbt och lämnar efter sig små droppar av vatten på ytan av plattan. Vid denna punkt, slå in pekfingret med ett skikt av Kimwipe och inledningsvis försiktigt blot ytan av plattan med det.
- När ytan är fri från vattendroppar, torka hela plattan med enkelriktad svepande rörelser med hjälp av en Kimwipe.
Observera: Om lösningen inte sprider nog hela plåtytan, öka ACN sammansättning och återskapa tunt lager. Vissa parametrar som kan påverka spridningen av lösningen inkluderar luftfuktighet och temperatur.
Obs: Med guld tallrikar, lagret vanligtvis visas som en gulaktig reflektion, beroende på visning och ljus vinklar. Med stålplattor, är bara kanten av lagret normalt synligt. - Rengör kanterna av plattan med en ny Kimwipe innan du lägger den i hållare för att förhindra matris förorenar instrumentet.
Beredning av matrisen lösningen
- Mättade 4-HCCA i FWI (3 delar myrsyra, 1 del vatten, 2 delar isopropanol) rekommenderas för analys av både membranet och lösliga proteiner. Det kan också användas i särskilda fall för analys av mycket hydrofoba stora peptider (M> 4000 U). Se till att matrisen lösning som används för att upptäcka de proteiner som inte överstiger ~ 50% organiskt innehåll, eftersom det kommer att helt lösa upp det tunt substrat, besegra fördelarna med metoden.
Test av tunt lager substrat
- Spot 0.5μL i matrisen lösningen på plattan. En vitaktig fällning kommer att visas i gränssnittet mellan det tunna lagret och droppen. När detta lager täcker botten av droppen helt, oftast inom 10-15 sekunder, aspirera överflödig vätska med ett vakuum linje. Om det tar längre tid än 30 sekunder för fällningen till form är det en indikation på att det kan finnas ett problem med tunt lager substrat och / eller matrisen lösningen.
Exempel på tillämpning
- Analytkoncentrationen i startelvan lösningar ska inom 10 och 1000μM.
- Späd analyten lösningen i matrisen lösning till en slutlig analytkoncentrationen mellan 0,2 och 2μM. Till exempel börja med 1μl prov och 9μl av matris lösning.
Obs: Se till att matrisen är nära att mättat i den slutliga lösningen, annars kommer du lös upp det tunna lagret substrat.
Obs: analyten koncentrationer krävs för att få anständig signaler är starkt beroende av lösningen komplexitet och sammansättning (t.ex. föroreningar) och analyt ionizability.
Obs: Om ett enda steg utspädning får inte ge goda resultat, bör du prova en annan utspädning steg. Även om counter-intuitivt, högkoncentrerad analyt lösningar ger sällan bra spektra.
Obs: Membranproteiner oftast kräver större spädningar. - Spot 0.5μl av prov / matris blandning på tallriken. En vitaktig fällning bildas i gränssnittet mellan det tunna lagret och droppen. Denna fällning är cocrystallization av matris och analyt. När detta lager täcker botten av droppen helt, vanligenallierade inom 10-15 sekunder, aspirera överflödig vätska med ett vakuum linje. Om det tar längre tid än 30 sekunder för fällningen till formen kan det vara en indikation på föroreningar som kan finnas, som förhindrar kristallisering, eller din analyt är alltför koncentrerad.
Kalibreringsstandard ansökan
- Förbered kalibreringsvätska / matris blandningen på ett liknande sätt med en slutlig kalibreringsvätska koncentration mellan 0,1-0.5μM.
- Spot 0.5μl kalibreringsvätska / matris blandningen på plattan i närheten av provet fläckar. Denna fysiska närhet används i en pseudo-intern kalibrering där plattan flyttas från provet plats till kalibreringsvätska plats under prov förvärv, för att lägga till ett par laser skott i kalibreringsstandarderna till spektrum. Denna metod garanterar en högre kalibrering massa noggrannhet än extern kalibrering bara.
Tvätt steg
- Tvätta varje plats med cirka 2μL av en iskall 0,1% vattenlösning TFA lösning. Aspirera överflödig vätska med ett vakuum linje.
Förvärv av masspektra
- Du är nu redo att skaffa masspektra. Om du använder FWI matris lösning, måste du skaffa ditt spektra så snart som möjligt för att förhindra oåterkalleliga ändringar av analyten som formylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
