Biology

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Published: May 20, 2010 doi: 10.3791/1933

Sabrina Lin^1,2,3, Shawn Fonteno¹, Shruthi Satish^1,3, Bir Bhanu⁴, Prue Talbot^1,2

¹UCR Stem Cell Center, University of California, ²Department of Cell Biology and Neuroscience, University of California, ³Cell, Molecular, and Developmental Biology Graduate Program, University of California, ⁴Center for Research in Intelligent Systems, University of California

Summary

الفيديو المعلوماتية الحيوية هو التجهيز الآلي ، والتحليل ، والفهم ، واستخراج البيانات من البيانات المكانية والزمانية لالبيولوجي المستخرج من أشرطة الفيديو المجهرية. الغرض من هذه المقالة هو لشرح طريقة لقياس الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نمو مستعمرة المعلوماتية الحيوية باستخدام طريقة الفيديو.

Abstract

لأن بيانات الفيديو معقدة وتتكون من العديد من الصور والمعلومات من مواد التعدين الفيديو هو من الصعب القيام به دون مساعدة من برامج الكمبيوتر. الفيديو المعلوماتية الحيوية هي طريقة فعالة لاستخراج الكمية المكانية والزمانية البيانات من صور الفيديو باستخدام برامج الحاسوب لتنفيذ التعدين وتاريخها والتحليل. في هذه المقالة ، ونحن نقدم طريقة الفيديو المعلوماتية الحيوية لقياس نمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) عن طريق تحليل الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو التي تم جمعها في حاضنة نيكون CT BioStation مزودة كاميرا لتصوير الفيديو. في تجاربنا ، تم تصويره hESC المستعمرات التي كانت تعلق على Matrigel لمدة 48 ساعة في BioStation CT. لتحديد معدل نمو هذه المستعمرات ، وضعت وصفات باستخدام CL - كوانت البرمجيات التي تمكن المستخدمين من استخراج أنواع مختلفة من البيانات من صور الفيديو. لتقييم دقيق نمو مستعمرة ، أنشئت ثلاث وصفات. قياس أول صورة مجزأة الى مستعمرة والخلفية ، والثاني تعزيز صورة لتعريف المستعمرات في جميع أنحاء تسلسل الفيديو بدقة ، وثالثة لعدد البكسل في المستعمرة مع مرور الوقت. تم تشغيل وصفات ثلاثة في تسلسل على بيانات الفيديو التي تم جمعها في CT BioStation لتحليل معدل نمو المستعمرات hESC الفردية أكثر من 48 ساعة. للتحقق من صحة الوصفات CL - كوانت ، تم تحليل البيانات يدويا باستخدام نفس برنامج أدوبي فوتوشوب. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها عندما تكون البيانات وصفات باستخدام CL - كوانت وقورنت فوتوشوب ، متطابقة تقريبا ، مما يدل على وصفات CL - كوانت كانوا صادقين. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب هو موضح هنا إلى أية بيانات الفيديو لقياس معدلات نمو hESC أو الخلايا الأخرى التي تنمو في المستعمرات. بالإضافة ، يمكن وضع وصفات أخرى الفيديو المعلوماتية الحيوية في المستقبل لعمليات خلية أخرى مثل الهجرة ، وموت الخلايا المبرمج ، والتصاق الخلية.

Protocol

الجزء 1 : الإجراءات التجريبية

بيانات الفيديو تحتوي على وفرة من المعلومات. بيد أن هذه المعلومات غالبا ما يكون من الصعب استخراج وعندما يتم يدويا من قبل البشر ، وربما تتطلب ساعات طويلة من وقت الموظفين لإكمال. تحليل مختصر عن البشر يخضع أيضا للتفاوت في التفسير والخطأ. الفيديو المعلوماتية الحيوية تنطوي على استخدام برامج الحاسوب لاستخراج بيانات محددة من صور الفيديو. هذه الطريقة في التحليل السريع ويمكن القضاء على الخطأ الذي يحدث عندما يتم تحليل يدويا من قبل البشر. الغرض من هذه المقالة هو لشرح طريقة لتحديد كمية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نمو مستعمرة المعلوماتية الحيوية باستخدام طريقة الفيديو.

في هذه الورقة ، وجمعت صور الفيديو في الوقت الفاصل باستخدام حضانة نيكون CT BioStation الوحدة التي يسمح تصوير حقول متعددة من الخلايا على مر الزمن (الشكل 1). الأساليب المذكورة في هذا التقرير هي التي تنطبق على بيانات الفيديو التي تجمعها أي فيديو المجهرية اقامة.

لدينا في تصميم تجريبي ، ونحن مطلي H9 hESC في 12 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة. خلال هذه الفترة ، تم السماح لإرفاق المستعمرات بالكامل وانتشرت على Matrigel. ثم ، تم نقل لوحات مع المستعمرات hESC تعلق على CT BioStation والمحتضنة لمدة 48 ساعة إضافية. بينما في BioStation ، تم جمع الصور من المستعمرات في 7 دقائق وكانت تستخدم في وقت لاحق لخلق متواليات الفيديو مرور الزمن. ثم جرى تحليل أشرطة الفيديو لكل مستعمرة لقياس النمو مستعمرة استخدام الفيديو وصفات المعلوماتية الحيوية المتقدمة مع برنامج CL - كوانت. والتحاليل التي أجريت باستخدام الوصفات التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج تم التحقق CL - كوانت عن الصدق يدويا باستخدام أدوبي فوتوشوب.

الجزء 2 : إعداد المستعمرات hESC المرفقة

تنمو على hESC Matrigel مغلفة جيدا 6 لوحات ، والتوصل confluency مرة واحدة 70 ٪ ، replate بئر واحدة من لوحة الى جانب 6 - 5 آبار لوحة 12 - مغلفة جيدا Matrigel على النحو التالي.
نضح المتوسطة من hESC تحتوي أيضا.
شطف جيدا مع 2X 1ml من برنامج تلفزيوني.
إضافة 1ml من Accutase واحتضان لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
إضافة الخرز الزجاجي 10-12 في البئر ويهز لوحة بلطف حتى المستعمرات فصل تماما من قاع البئر.
تحييد Accutase باستخدام 1ml mTeSR المتوسطة أو المتوسطة MEF مكيفة.
الطرد المركزي تعليق خلية في أنبوب المخروطية في 15ml 200G لمدة 3 دقائق.
صب وطاف بيليه والقطيعة مع 500μl المتوسطة mTeSR الطازجة.
لوحة 100μl قطرة الحكيمة للتعليق hESC في كل بئر في صفيحة ال 12 أيضا.
لوحة الصخور ذهابا وإيابا بلطف واحترام الثقافات تحت المجهر الخفيفة. تأكد من أن يتم توزيعها بالتساوي كتل الخلايا في جميع أنحاء اللوحة.
مكان الظهر 12 لوحة جيدا في الحاضنة.
السماح لإرفاق hESC وتنمو لمدة 48 ساعة (يمكن استخدام أقصر وقت).
بعد 48 ساعة ، صب على المديين المتوسط وغسل الآبار مع 500ul من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير مرتبط.
إضافة 1ml المتوسطة mTeSR إلى كل بئر.
تعليق : لوحة المكان فورا الى الحاضنة / مجهر لتصوير الفيديو.
تبدأ بجمع الوقت الفاصل بين الصور. محاولة لتحديد الحقول واحد مع المستعمرات المنفصلة التي ليس من المرجح أن تتحول إلى مستعمرات أخرى.
ويمكن استخدام طرق أخرى للزراعة واقامة hESC بدلا من بروتوكول أعلاه.

الجزء 3 : فيديو المعلوماتية الحيوية

وقد استخدم CL - كوانت البرمجيات لإنشاء ثلاث "وصفات" أنه عندما يتم تشغيلها في تسلسل ستحدد عدد بكسل أو منطقة في ميكرون لكل مستعمرة على مر الزمن. مبنية على وصفات ثلاثة في تسلسل لهذا التطبيق وتشمل تجزئة ، وتعزيز ، والقياس.

تحليل hESC نمو مستعمرة باستخدام برنامج CL - كوانت / التنمية وصفة :

يتم إنشاء وصفة التقسيم الأول.
مسح كامل الفيديو للتأكد من أن شريط الفيديو هو صالحة للاستعمال. الاختيار للتأكد من أن مستعمرة كله يبقى في مجال الرؤية وغيرها من المستعمرات التي لا تدخل هذا المجال.
فتح المعالج تجزئة وانقر على زر "التالي".
حدد القناة الصورة الصحيحة (أي مرحلة ، أخضر ، أحمر ، الخ) وانقر على زر "التالي".
اختيار "مطابقة الناعمة" للخروج من الخيارات (3) وانقر على زر "التالي".
حدد "تريد ان" المناطق التي تدور حول المناطق على الصورة عادة الحافة الخارجية للمستعمرة في المنطقة الوسطى من مستعمرة.
- وينبغي أن تكون هذه المنطقة الصغيرة ممكن ولكن ينبغي أن يكون ممثلا لمستعمرة بكاملها.
- عند استخدام المرحلة المجهر النقيض من ذلك ، تأكد من تضمين الهالة حول مستعمرة لاختيار مستعمرة دقيقة بواسطة البرنامج.
- اختيار 1 أو 2 مناطق الفائدة التي قد تظهر مختلفةأنماط بكسل داخل مستعمرة ، ولكن لا يختار الكثير من "يريد" والذي قد يؤدي إلى تطبيق قناع دقيقة.
انقر فوق زر "التالي".
حدد "لا تريد ان" المناطق التي تدور حول المناطق على الصورة التي هي ليست جزءا من مستعمرة وليس جزءا من الخلفية. هذه هي المناطق التي ترغب في أنماط قمع وتشمل بكسل من التحف مثل الحطام والخلايا الميتة. انقر على زر "التالي".
حدد "الخلفية" التي تدور حول المناطق التي ترغب في قمع.
- يجب أن "لا يريدون" و "الخلفية" تختلف في المناطق التي تكون الخلفية موحدة ، ومن المرجح أن تظهر في كل إطار.
- عادة ما نختار خلفية رمادية حول مستعمرة.
انقر فوق زر "التالي".
يجب أن يتم عرض قناع ملون فوق منطقة اهتمامك (الشكل 2A).
إذا كان القناع لا تغطي المنطقة بدقة من الفائدة ، ويمكن زيادة مدى عتبة التجزئة (الموجود في الزاوية السفلى اليمنى من الشاشة البرمجيات) أو النقصان.
المعالج تجزئة يطالب مزيد من ضبط قناع منطقة غرامة إذا لزم الأمر.
إذا كنت ترغب في تغيير القناع الخاص بك ، حدد "تحديث المناطق مطابقة لينة". هذا يسمح لك بتغيير "يريدون" ، "لا نريد" ، أو "الخلفية" المناطق.
إذا كان القناع مرضية ، حدد "تطبيق العتبة وقناع انقاذ بلادي" ، وانقر على زر "التالي".
وبعد ذلك يتم عرض قناع في لون مختلف.
حدد "إنهاء".
يجب أن يتم عرض وصفة في الزاوية اليمنى العليا للبرنامج ، ويجب أن يطلق عليه "وصفة تقسيم".
إعادة تسمية الوصفة إذا كنت ترغب بالضغط الحق و "إعادة تسمية".
لفحص المكان ، والمكان المناسبين فوق الماوس فوق "تطبيق وصفة".
وسوف تظهر القائمة التي تسمح لك لتحديد عدد الإطارات التي تريد استخدامها عند التدقيق في بقعة وصفة. وصفة لتشغيل كل الأطر 10 إلى بقعة التحقق من دقة وضع القناع.
إذا كان القناع تلتقط أجزاء من المناطق غير المرغوب فيها أو صغيرة من الحطام ، يمكنك إنشاء "وصفة تعزيز" لتحسين المناسب من القناع إلى المنطقة للاهتمام.
وصفة لخلق التعزيزات ، انقر على الحق في "تعزيز وصفة" مجلد ، ثم انقر فوق "جديد". يجب أن يتم عرض وصفة تعزيز الجديدة.
من الميدان الأصلي لعرض (FOV) ، انقر على "تعزيز وحدة تبديل" الزر الموجود على يمين الصورة. الماوس فوق الرموز في شريط الأدوات لتحديد الصحيح.
حدد "الوسم" القائمة المنسدلة.
حدد "(4) وضع العلامات متصل".
حدد "وسم 4 connected2".
يجب أن يتم عرض شريط المهام الجديدة.
انتزاع القناع الأولي (mask0) من وصفة تقسيم وجرها إلى مربع "الإدخال".
وينبغي الآن عرض شريط "قناع الإدخال #".
اسحب الرمز مع "قناع الإدخال #" إلى قناع الرمز 0.
العثور على "دقيقة الحجم" في شريط المهام وضبط عدد حتى يتم عرض المنطقة الوحيدة المثيرة للاهتمام. تأكد من النقر على "تنفيذ" من خلال كل محاكمة المناسب.
ذات مرة كنت راضيا عن التعديل الخاص الحجم الأدنى ، انقر على "تعزيز وصفة" التي قمت بإنشائها مسبقا. (الشكل 2B)
في الجزء السفلي من الشاشة ، حدد "حفظ إلى وصفة".
برنامج يطالب الآن ب "وصفة الكتابة المختارة؟" ، حدد "نعم"
بقعة الاختيار وصفة تعزيز استخدام نفس الإجراءات أعلاه من أجل التحقق من بقعة تجزئة.
إذا كان راض عن التجزئة وتعزيز وصفات ، حدد "إنشاء قالب القياس" على شريط الأدوات اليد اليمنى.
إعادة تسمية القالب إذا كنت ترغب في ذلك.
في إطار قالب القياس ، حرك المؤشر فوق الرقم الخلية المرسومة. الاستمرار على مفتاح Ctrl وتحديد الخلية.
ازل "الافتراضي المعلمة" و "المعلمة المنطقة" الاختيار تحت عنوان "مورفولوجيا".
خروج "قالب" نافذة.
حدد رمز إنشاؤها في صفة القياس.
إعادة تسمية وصفة.
الانتقال إلى وحدد "قالب" علامة في الزاوية اليمنى العليا.
سحب وإسقاط قالب القياس التي تم إنشاؤها مسبقا على إطار القياس.
انقر فوق "نعم" للمتابعة.
في إطار قياس صفة ، وحدد "تعيينات قناة' ، 'خلية الجامعة' ثم.
حدد "قناع تعيينات".
ثم "خلية كاملة" حدد خيار قناع المحسنة.
حدد "وصفة القياس" تحت علامة التبويب وصفة في النافذة الرئيسية.
حدد "حفظ" رمز ضمن إطار قياس الوصفة.
ثم أغلق النافذة.
الآن ، وثيقة وإعادة فتح 'FOV.
انقر على الحق في "وصفة" رمز "قائمة قفل صفة" تحديد وتشغيل وصفات بالتتابع على بيانات الفيديو.

الجزء 4 : التحقق من دقة وصفه باستخدام برنامج فوتوشوب

من أجل التحقق من صحة الوصفة التي تم إنشاؤها باستخدام (CL - كوانت تحديثات برامج المزودو) ، يمكن تحليل البيانات نفسها يدويا مع أدوبي فوتوشوب. لهذا التحليل ، تم تحليل كل إطار 10 (70 دقيقة في كل مرة نقطة) لقياس حجم مستعمرة أكثر من 48 ساعة.

فتح إطار صورة مستعمرة في أدوبي فوتوشوب.
انقر على أداة العصا السحرية في شريط الأدوات.
انقر على محيط مستعمرة بحيث يتم تغطية الحقل بأكمله ما عدا المنطقة مستعمرة.
انقر على "تحرير في وضع القناع السريع" في شريط الأدوات وانقر على مستعمرة حتى يتم تحديد مستعمرة.
تأكد من وجود خط منقط حول مستعمرة يناسب الحق حول محيط مستعمرة وليس داخلها. إذا كان الخط المتقطع هو ليس حول محيط ، وتغير قيمة التسامح في شريط الأدوات العلوي وفقا لذلك.
انتقل إلى "إطار" القائمة المنسدلة وانقر فوق "الرسم البياني.
كتابة قيمة البيكسل عند التخزين المؤقت = 1. إذا كان التخزين المؤقت هو 2 ، انقر فوق '!' للتغيير إلى مخبأ 1 ، ومن ثم لاحظ القيمة بكسل.
تكرار العملية المذكورة أعلاه عن كل إطار 10. ويمكن استخدام عدد أقل من مجموع الأطر إذا رغبت في ذلك.
ويمكن استخدام البيانات التي تم جمعها فوتوشوب وبرامج CL - كوانت ثم يمكن رسم معا. إذا كانت الوصفات CL - كوانت صادقين ، يجب أن منحنيات لتحليل فوتوشوب وCL - كوانت تكون مشابهة جدا (الشكلان 3-5).
إذا كان وضعها مع وصفات CL - كوانت صادقين ، ويمكن تطبيقها بشكل موثوق لبيانات الفيديو وغيرها.
القيمة في استخدام الفيديو المعلوماتية الحيوية في هذا التحليل هو أنه بمجرد أن يتم تطويرها لتجزئة ، وتعزيز ، والقياس والتحقق وصفات ، فإنها سوف تؤدي في التحليل بسرعة أكبر وبدقة أكثر من الإنسان باستخدام برنامج فوتوشوب.

ممثل النتائج

الشكل 1 : الشريط السينمائي من مستعمرة hESC عرض الإطارات في أوقات مختلفة خلال 48 ساعة من النمو في BioStation CT. وقد اتخذت الإطارات في 7 دقائق.

الشكل 2 : (أ) صورة من hESC مع قناع يوضع على مستعمرة من قبل وصفة التجزئة. هي أيضا مجالات الملثمين من الحطام والخلفية مشيرا إلى أن هناك حاجة لتعزيز صفة لتحسين دقة التقييم. (ب) وقد أجريت صورة للمستعمرة نفسه كما هو موضح في "A" بعد تعزيزها. قناع يختار الآن فقط مستعمرة ، ولقد تم التخلص من الضوضاء من التحديد.

الشكل 3 : رسم بياني يظهر الزيادة في حجم مستعمرة (بالبكسل) على مدى 48 ساعة كما هو محدد باستخدام CL - كوانت البرمجيات وفوتوشوب. هذا الرسم البياني المؤامرات البيانات الخام ، ويبين أن تبدأ في مستعمرات مختلفة الأحجام. لكنه يظهر أيضا أن كلا من أساليب القياس في اتفاق جيد.

الشكل 4 : رسم بياني يظهر نفس البيانات كما في الشكل 3 بعد التطبيع لإظهار الزيادة في المئة في حجم مستعمرة أكثر من 48 ساعة. هذا يدل على أن معدلات نمو متشابهة بغض النظر عن حجم مستعمرة البداية وأن كلا من تحليل التدابير تعطي نتائج مماثلة.

الشكل 5 : رسم بياني يبين الوسائل لتطبيع البيانات في الشكل 4. هذا الرسم البياني يبين بوضوح اتفاق جيد بين التحاليل التي أجريت باستخدام الفيديو المعلوماتية الحيوية (CL - كوانت البرمجيات) وفوتوشوب وينص على أن وصفة غير صحيحة. التراجع الطفيف في المنطقة لتأمين البيانات فوتوشوب في الإطار 325 هو نتيجة لعدة أشرطة فيديو لم يتم تضمينها في التحليل فوتوشوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الفيديو أدوات المعلوماتية الحيوية هي قوية لاستخراج البيانات بسرعة من صور الفيديو. بروتوكول لدينا لقياس النمو hESC مستعمرة يوضح تطبيق واحد من الفيديو المعلوماتية الحيوية لمشكلة بيولوجية. هذا الأسلوب الكمي ويحتوي على ميزة مثيرة للاهتمام لكشف البيانات من المستعمرات hESC الفردية. ويمكن تطوير المعلوماتية الحيوية وصفات فيديو لمراقبة العمليات الخلوية الأخرى ، مثل انتشار الخلايا ، والهجرة ، والتعلق الخلية إلى الركيزة ، والتعلق خلية إلى الخلايا المجاورة. طور دقة وصفات باستخدام CL - كوانت البرمجيات والتحقق من صحة استخدام Photoshop وجدت لتكون صادقة. حالما يتم وضع الوصفات المناسبة ، يمكن تحليل بيانات الفيديو من أي مصدر بسرعة كبيرة. الوقت اللازم لتحليل البيانات الفيديو باستخدام الفيديو المعلوماتية الحيوية الأدوات هو أقل بكثير من الوقت اللازم لتحليل أداء من ناحية استخدام فوتوشوب. وعلاوة على ذلك ، فإن التحليل الذي قام به الكمبيوتر هو أقل عرضة للخطأ ، مثل الكمبيوتر وتحليل البيانات بنفس الطريقة في كل مرة ، في حين أن أداء الإنسان تحليلا قد يرتكب أخطاء أو أحكام مختلفة قليلا في كل مرة يتم تحليل صورة. على الرغم من عدم مناقشته كجزء من هذا البروتوكول ، يمكن أن تدرس أيضا أشرطة فيديو عن تغيرات شكلية في المستعمرة. وهذه المعلمة أن تكون مفيدة في الحالات التي يتم تضمين مجموعات العلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

تم تطوير هذا الأسلوب ممكنا بفضل تمويل من كاليفورنيا ذات الصلة بالتبغ برنامج بحوث الأمراض ، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي ، وجبهة الخلاص الوطني منحة IGERT المعلوماتية الحيوية على الفيديو (# 0903667) في UCR ( http://www.cris.ucr .edu / IGERT / أنشئ حسابا ). معتمد من قبل سابرينا لين زمالة أطروحة من شعبة الدراسات العليا ، ويدعم من قبل شون Forteno زمالة مارك المعاهد الوطنية للصحة ، وذلك بدعم من قبل ساتيش Shruthi زمالة قسم الدراسات العليا. ونحن ممتنون لTrtchounian آنا لمساعدتها على إعداد الأرقام. ونحن نشكر أيضا وسام Alworth Jastromb نيد ليعلمنا كيفية استخدام البرنامج CL - كوانت.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca²⁺ and Mg²⁺
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).