וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Summary

וידאו ביואינפורמטיקה הוא עיבוד וניתוח אוטומטי, הבנה, כריית נתונים של במרחב ובזמן נתונים ביולוגי המופק וידאו מיקרוסקופיים. מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה למדידת תא גזע עובריים אנושיים צמיחה המושבה בשיטה ביואינפורמטיקה וידאו.

Abstract

מאחר שהנתונים וידאו מורכבים מורכבות תמונות רבות, כריית מידע מתוך חומר וידאו קשה לעשות ללא סיוע של תוכנות מחשב. וידאו ביואינפורמטיקה היא גישה כמותית עוצמה לחילוץ במרחב ובזמן נתונים תמונות וידאו באמצעות תוכנת מחשב כדי לבצע כריית היכרויות וניתוח. במאמר זה, אנו מציגים שיטה וידאו ביואינפורמטיקה לכימות את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) על ידי ניתוח זמן לשגות קטעי וידאו שנאספו BioStation Nikon CT חממה מצויד במצלמת וידאו עבור הדמיה. בניסויים שלנו, מושבות hESC כי צורפו Matrigel צולמו במשך 48 שעות ב-CT BioStation. כדי לקבוע את קצב הגידול של מושבות אלו, המתכונים פותחו באמצעות CL-קוואנט תוכנה אשר מאפשרת למשתמשים להפיק סוגים שונים של נתוני תמונות וידאו. על מנת להעריך במדויק את הצמיחה המושבה, שלושה מתכונים שנוצרו. התמונה הראשונה מפולח לתוך המושבה ואת הרקע, התמונה השנייה משופרת להגדיר מושבות לאורך רצף וידאו במדויק, והשלישי מדדו את מספר הפיקסלים במושבה לאורך זמן. שלושת המתכונים נוהלו ברצף על נתונים שנאספו וידאו CT BioStation לנתח את קצב הגידול של מושבות hESC בודדים מעל 48 שעות. כדי לוודא את אמיתותם של CL-קוואנט מתכונים, נתונים באותו נותחו באופן ידני באמצעות תוכנת Adobe Photoshop. כאשר הנתונים שהתקבלו באמצעות CL-קוואנט מתכונים Photoshop הושוו, התוצאות היו כמעט זהים, המציין את CL-קוואנט המתכונים היו אמת. השיטה המתוארת כאן יכול להיות מיושם על כל הנתונים וידאו למדוד את שיעורי הצמיחה של hESC או תאים אחרים הגדלים במושבות. בנוסף, אחרים וידאו מתכונים ביואינפורמטיקה ניתן לפתח בעתיד תהליכים תאים אחרים כמו הגירה, אפופטוזיס, וכן הידבקות התא.

Protocol

חלק 1: נוהל ניסיוני

נתוני וידאו מכילים שפע של מידע. עם זאת, מידע זה לעתים קרובות קשה לחלץ כאשר נעשה באופן ידני על ידי בני האדם עשויים לדרוש שעות רבות של אנשי זמן כדי להשלים. ניתוח ידני על ידי בני אדם כפוף גם וריאציה בפרשנות וטעייה. וידאו ביואינפורמטיקה כרוך בשימוש בתוכנות מחשב לשלי נתונים ספציפיים של תמונות וידאו. שיטה זו של הניתוח הוא מהיר והוא יכול לחסל שגיאה המתרחשת כאשר הניתוח מתבצע באופן ידני על ידי בני אדם. מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לכימות תא גזע עובריים אנושיים צמיחה המושבה בשיטה ביואינפורמטיקה וידאו.

במאמר זה, זמן לשגות תמונות וידאו נאספו באמצעות BioStation Nikon יחידת CT הדגירה המאפשר שדות מרובים של תאים להיות צילמו לאורך זמן (איור 1). השיטות שתוארו בדו"ח זה החלות על נתונים שנאספו על ידי וידאו וידאו כלשהו מיקרוסקופיים להגדיר.

בתכנון הניסוי שלנו, אנו מצופה H9 hESC ב 12 גם תרבות צלחות הרקמה למשך 48 שעות. במהלך ההפסקה הזו, מושבות הורשו במלואו לצרף ולהתפשט על Matrigel. ואז, צלחות עם מושבות hESC מצורף הועברו CT BioStation וטופחו עבור 48 שעות נוספות. בעוד BioStation, תמונות של המושבות נאספו 7 מרווחי דקה מאוחר יותר שימשו ליצירת זמן לשגות sequences וידאו. סרטוני הדרכה של המושבה כל נותחו אז לכמת צמיחה המושבה באמצעות וידאו מתכונים ביואינפורמטיקה פותח עם תוכנה CL-קוואנט. הניתוחים נעשה באמצעות מתכונים שנוצרו עם התוכנה CL-קוואנט נבדקו על אמת באופן ידני באמצעות Adobe Photoshop.

חלק 2: הכנת מושבות hESC מצורף

1. לגדול hESC על Matrigel מצופה 6-גם צלחות, ופעם confluency 70% הוא הגיע, replate באר אחת של צלחת 6-5 היטב לתוך בארות צלחת 12-באר מצופה Matrigel כדלקמן.
2. לשאוב מן המדיום hESC המכיל היטב.
3. יש לשטוף היטב עם 2x 1ml של PBS.
4. הוסף 1ml של Accutase ו דגירה במשך דקה 1 ב 37 ° C ו 5% CO _2.
5. הוסף 10-12 חרוזי זכוכית לתוך הבאר לטלטל את הצלחת בעדינות עד מושבות לחלוטין לנתק מתחתית הבאר.
6. לנטרל Accutase באמצעות 1ml של mTeSR בינוני או בינוני MEF מותנה.
7. צנטריפוגה ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ב 200 גרם במשך 3 דקות.
8. למזוג supernatant ואת גלולה לשבור עם 500μl של המדיום mTeSR טריים.
9. ירידה פלייט 100μl חכם של ההשעיה hESC לתוך זה גם בצלחת של 12 באר.
10. צלחת רוק קדימה ואחורה בעדינות ולבחון תרבויות תחת מיקרוסקופ אור. ודא כי גושים תא מחולקים באופן שווה על פני הצלחת.
11. מניחים את הגב 12-היטב לתוך צלחת החממה.
12. אפשר hESC לצרף ולגדול למשך 48 שעות (זמן קצר ניתן להשתמש).
13. לאחר 48 שעות, למזוג הבינוני לשטוף בארות עם 500ul של PBS להסיר תאים פנויים.
14. הוסף 1ml של המדיום mTeSR היטב כל אחד.
15. הערה: מיד למקום את הצלחת לתוך החממה / מיקרוסקופ הדמיה וידאו.
16. בגין איסוף זמן לשגות תמונות. נסו לבחור שדות עם מושבות יחיד בדידה כי לא צפויות לגדול לתוך מושבות אחרות.
17. שיטות אחרות culturing והקמת hESC יכול לשמש במקום בפרוטוקול לעיל.

חלק 3: וידאו ביואינפורמטיקה

CL-קוואנט תוכנה נעשה שימוש כדי ליצור שלושה "מתכונים" כי כאשר לרוץ ברצף תקבע את מספר האזור פיקסל או מיקרון עבור המושבה כל הזמן. שלושת המתכונים בנויים ברצף עבור יישום זה כוללים פילוח, שיפור, ומדידה.

ניתוח המושבה hESC צמיחה באמצעות תוכנת CL-קוואנט / פיתוח מתכון:

1. המתכון פילוח נוצר לראשונה.
2. סרוק את הווידאו כולו על מנת לוודא כי הוידאו הוא שמיש. בדוק כדי לוודא את המושבה כולה נשארת בתחום להציג כי במושבות אחרות לא להיכנס לתחום.
3. פתח את אשף פילוח ולחץ על כפתור "הבא".
4. בחר ערוץ תמונה נכונה (כלומר, שלב, ירוק, אדום, וכו ') ולחץ על כפתור "הבא".
5. בחר "התאמה רך" מתוך 3 האפשרויות ולחץ על "הבא".
6. בחר "רוצה" על ידי אזורים מקיפים אזורים בתמונה בדרך כלל את הקצה החיצוני של המושבה לאזור המרכזי של המושבה.
   • אזור זה צריך להיות קטן ככל האפשר, אבל צריך להיות נציג של המושבה כולה.
   • לעומת זאת בעת שימוש במיקרוסקופ שלב, הקפד לכלול את ההילה סביב המושבה לבחירה המושבה מדויק על ידי התוכנה.
   • פיק 1 או 2 אזורים של עניין זה עשוי להראות שונהדפוסי פיקסל בתוך המושבה, אבל לא לקחת יותר מדי "רוצה", אשר עלול לגרום יישום מסכה לא מדויק.
7. לחץ על כפתור "הבא".
8. בחר "לא רוצה" אזורים על ידי מקיפים אזורים בתמונה שאינם חלק של המושבה ולא חלק מן הרקע. אלה הם אזורים בעלי דפוסי ברצונך לדכא כוללים פיקסלים של חפצים כגון פסולת תאים מתים. לחץ על "הבא".
9. בחר "רקע" על ידי מקיפים אזורים אתה רוצה לדכא.
   • "לא רוצה" אזורים "רקע" הבדלים ברקע שאמור להיות אחיד עלול להופיע כל מסגרת.
   • בדרך כלל אנו בוחרים את הרקע האפור ברחבי המושבה.
10. לחץ על כפתור "הבא".
11. מסכה בצבע אמורה להיות מוצגת מעל אזור העניין שלך (איור 2 א).
12. אם המסכה אינה מדויקת לכסות את האזור של עניין, סף פילוח טווח (הממוקם בפינה הימנית התחתונה של התצוגה תוכנה) ניתן להגדיל או להקטין.
13. אשף פילוח בקשות עבור כוונון אזור נוסף מסכת בסדר אם יהיה צורך.
14. אם ברצונך לשנות את המסכה שלך, בחר באפשרות "עדכון האזורים התאמת רך". זה מאפשר לך לשנות את "רוצה", "לא רוצה", או אזורים "רקע".
15. אם המסכה היא משביעת רצון, בחר "להחיל סף ולשמור המסכה שלי", ולחץ על כפתור "הבא".
16. המסכה לאחר מכן יוצג בצבע שונה.
17. בחר "סיום".
18. המתכון צריך להיות מוצג בפינה הימנית העליונה של התוכנה, ואת זה צריך להיקרא "מתכון פילוח".
19. שנה את שם המתכון אם אתם רוצים על ידי לחיצה ימנית ו "לשנות".
20. עבור בדיקת המקום, קליק ימני במקום את העכבר מעל "חלות מתכון".
21. התפריט יציג המאפשר לך לבחור את מספר מסגרות ברצונך להשתמש כאשר במקום לבדוק את המתכון. הפעל את המתכון כל 10 מסגרות למקום לבדוק את דיוק מיקום מסכה.
22. אם המסכה מרימה חלקים לא רצויים של אזורים קטנים או פסולת, באפשרותך ליצור "מתכון שיפור" כדי לשפר את התאמת המסכה לאזור של עניין.
23. כדי ליצור מתכון שיפור, קליק ימני על "מתכון שיפור" תיקייה ולאחר מכן לחץ על "חדש". מתכון שיפור החדש אמורה להיות מוצגת.
24. מן השדה המקורי של תצוגה (FOV), לחץ על "מודול מחליפה שיפור" כפתור בצד ימין של התמונה. עכבר סמלים בסרגל הכלים לזהות את הנכונה.
25. בחר "תיוג" התפריט הנפתח.
26. בחר "4 תיוג מחובר".
27. בחר "תיוג 4 connected2".
28. סרגל המשימות החדש אמורה להיות מוצגת.
29. תפוס את המסכה הראשונית (mask0) מן המתכון פילוח ולגרור אותו לתיבת "קלט".
30. הבר אמור כעת להציג "מסכה קלט #".
31. גרור את הסמל עם "מסיכת הזנה #" לסמל את המסכה 0.
32. מצא את "גודל דקות" בשורת המשימה ולהתאים מספר עד לאזור רק עניין מוצג. ודא שאתה לוחץ על "הוצאה להורג" באמצעות ניסוי זה מתאים.
33. ברגע שאתה מרוצה עם התאמת הגודל המינימלי שלך, לחץ על "מתכון שיפור" שיצרת קודם לכן. (איור 2B)
34. בתחתית המסך, בחר "להציל את המתכון".
35. התוכנה כרגע ההנחיות "המתכון שנבחר להחליף?", בחר "כן"
36. ספוט לבדוק את המתכון שיפור באמצעות נהלים כנ"ל עבור פילוח במקום לבדוק.
37. אם מרוצה פילוח ומתכונים שיפור, בחר "ליצור תבנית מדידה" בסרגל הכלים של יד ימין.
38. שנה את שם התבנית אם תרצה.
39. בחלון תבנית מדידה, להזיז את הסמן על דמות תא קליפ ארט. החזק את מקש Ctrl לחוץ ובחר את התא.
40. "פרמטר ברירת המחדל" בטל ו 'פרמטר שטח "לבדוק תחת" מורפולוגיה ".
41. "תבנית" יציאה החלון.
42. בחר את הסמל שנוצר מתכון המדידה.
43. שנה את המתכון.
44. מעבר ובחר הכרטיסייה 'תבנית "בפינה הימנית העליונה.
45. גרור ושחרר את התבנית שנוצרה בעבר שלך המדידה על חלון המדידה.
46. לחץ על 'כן' כדי להמשיך.
47. בחלון מתכון מדידה, בחר 'ערוץ מיפויי "," תא שלם "אז.
48. בחר "מסכת מיפויי".
49. ואז באפשרות 'תא שלמים "לבחור עבור מסכה משופרת.
50. בחר את "המתכון מדידה" תחת הלשונית מתכון בחלון הראשי.
51. בחר 'שמור' סמל בתוך חלון מתכון מדידה.
52. ואז לסגור את החלון.
53. עכשיו, לסגור ולפתוח מחדש את "FOV".
54. קליק ימני על "מתכון" סמל, בחר "מתכון נעל רשימת ולהפעיל את המתכונים ברצף על נתוני הווידאו.

חלק 4: בדיקת דיוק מתכון באמצעות תוכנת פוטושופ

על מנת לאמת את המתכון נוצר עם softw (CL-קוואנטהם), הנתונים ניתן לנתח אותו ידנית עם Adobe Photoshop. לניתוח זה, כל מסגרת 10 (70 בכל נקודת זמן min) נותח כדי למדוד את גודל המושבה במשך 48 שעות.

1. פתיחת מסגרת של תמונה המושבה ב Adobe Photoshop.
2. לחץ על הכלי שרביט קסמים בסרגל הכלים.
3. לחץ על האזור סביב המושבה כך את השדה כולו מכוסה למעט באזור המושבה.
4. לחץ על 'ערוך במצב מסיכה מהירה' בסרגל הכלים ולחץ על המושבה כל כך את המושבה נבחרה.
5. ודא קו מקווקו סביב המושבה מתאים ממש מעבר לפריפריה של המושבה ולא בתוכו. אם הקו המקווקו לא בסביבה בפריפריה, לשנות את ערך הסובלנות בסרגל הכלים העליון בהתאם.
6. עבור "חלון" לנתץ התפריט ולחץ על 'היסטוגרמה'.
7. רשמו את ערך פיקסל כאשר המטמון = 1. אם המטמון הוא 2, לחץ על '! " כדי לשנות את המטמון 1, ולאחר מכן ציין את הערך פיקסל.
8. חזור על התהליך הנ"ל עבור כל מסגרת 10. מסגרות הכולל פחות ניתן להשתמש אם תרצה בכך.
9. נתונים שנאספו באמצעות Photoshop ו CL-קוואנט תוכנה אז יכול להיות זממו יחד. אם CL-קוואנט המתכונים הם אמת, את הקימורים לניתוח Photoshop ו CL-קוואנט צריך להיות דומה מאוד (איורים 3-5).
10. אם את המתכונים פותח עם CL-קוואנט הם אמת, הם יכולים להיות מיושמים בצורה אמינה לנתונים וידאו אחרים.
11. הערך באמצעות וידאו ביואינפורמטיקה בניתוח זה היא כי לאחר פילוח, שיפור, ומתכונים מדידה מפותחים תוקף, הם יבצעו את הניתוח הרבה יותר מהר יותר ומדויק יותר אנושי באמצעות Photoshop.

נציג תוצאות

איור 1: רצועת הסרטים של מושבה hESC מראה מסגרות בזמנים שונים במהלך 48 שעות של גידול CT BioStation. מסגרות צולמו 7 דקות intervals.

איור 2: (א) מקדימה של hESC עם מסכה דגש על המושבה על ידי המתכון פילוח. תחומי פסולת והרקע הם רעולי פנים המציין כי גם מתכון שיפור הוא זקוק כדי לשפר את הדיוק של ההערכה. (ב) תמונה של המושבה אותו כמוצג "א" אחרי שיפור שבוצעה. המסכה עכשיו בוחר רק את המושבה ורעש מוגר מהרשימה.

איור 3: מראה גרף עלייה גודל המושבה (בפיקסלים) מעל 48 שעות כפי שנקבע באמצעות CL-קוואנט תוכנת Photoshop. גרף זה מגרשים את הנתונים הגולמיים ומראה כי מושבות להתחיל בגדלים שונים. הוא גם מראה כי הן שיטות המדידה הן בהסכם טוב.

איור 4: גרף המציג את הנתונים כמו באיור 3 לאחר נורמליזציה להראות את אחוז גידול בגודל המושבה מעל 48 שעות. זה מראה כי שיעורי צמיחה דומים ללא קשר לגודל המושבה ההתחלה כי הן באמצעים של ניתוח לתת תוצאות דומות.

איור 5: גרף המראה את האמצעים הנתונים מנורמל באיור 4. גרף זה מראה בבירור הסכם טוב בין הניתוחים נעשה באמצעות וידאו ביואינפורמטיקה (CL-קוואנט תוכנה) Photoshop ו קובע כי המתכון הוא דובר אמת. ההאטה קלה באזור עבור הנתונים Photoshop בבית מסגרת 325 היא בשל כמה קטעי וידאו לא להיכלל בניתוח Photoshop.

Discussion

וידאו כלי ביואינפורמטיקה חזקים עבור במהירות לחילוץ נתונים תמונות וידאו. פרוטוקול שלנו לכימות המושבה צמיחה hESC מדגים יישום אחד של וידאו ביואינפורמטיקה לבעיה ביולוגית. שיטה זו היא כמותית יש תכונה מעניינת של הנתונים מגלה ממושבות hESC בודדים. וידאו מתכונים ביואינפורמטיקה ניתן לפתח כדי לפקח על תהליכים תאיים אחרים כגון, אפופטוזיס התפשטות, הגירה מצורף התא למצע, וכן מצורף תא לתאים סמוכים. הדיוק של המתכונים פותח באמצעות תוכנת CL-קוואנט היה תוקף באמצעות Photoshop ו נמצאה אמת. לאחר מתכונים המתאימים מפותחים, נתונים ווידאו מכל מקור ניתן לנתח מהר מאוד. את הזמן הדרוש כדי לנתח את הנתונים וידאו באמצעות וידאו ביואינפורמטיקה כלים קטנה משמעותית מזו של הזמן הדרוש לניתוח שבוצע על ידי יד באמצעות Photoshop. יתר על כן, הניתוח נעשה על ידי המחשב הוא נוטה פחות שגיאות, כמו המחשב יהיה לנתח את הנתונים באותה דרך בכל פעם, ואילו אדם ביצוע ניתוח עלול לגרום לטעויות או פסקי דין שונה במקצת בכל פעם תמונה מנותח. למרות שלא נדון במסגרת פרוטוקול זה, קטעי וידאו ניתן גם לבחון שינויים מורפולוגיים במושבה. פרמטר זה יהיה שימושי במקרים בהם קבוצות הטיפול כלולות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).