비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Summary

비디오 생물 정보학은 자동 처리, 분석, 이해하고, 미세한 동영상에서 추출한 생물 spatio - 시간적 데이터의 데이터 마이닝이다. 이 문서의 목적은 비디오 생물 정보학 방법을 사용하여 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 측정하는 방법을 설명하는 것입니다.

Abstract

비디오 데이터는 복잡하며 여러 이미지, 동영상 자료에서 광산 정보로 구성되어 있기 때문에 컴퓨터 소프트웨어의 도움없이 할 어렵습니다. 비디오 생물 정보학 데이트 마이닝 및 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 비디오 이미지 spatio - 시간적 데이터를 추출하기위한 강력한 양적 접근 방식이다. 이 문서에서는, 우리는 비디오 이미지를위한 카메라가 장착된 니콘 BioStation 중부 표준시 인큐베이터에서 수집한 시간 경과 비디오 분석을 통해 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 성장을 quantifying위한 비디오 생물 정보학 방법을 소개합니다. 우리의 실험에서, Matrigel에 첨부된되었습니다 hESC 식민지는 BioStation 중부 표준시에 48 시간 동안 촬영했다. 이러한 식민지의 성장 속도를 확인하려면, 조리법은 사용자가 비디오 이미지의 데이터의 다양한 유형을 추출할 수 있도록 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 개발되었습니다. 정확하게 식민지의 성장을 평가하는 세 요리법이 만들어졌습니다. 식민지와 배경, 정확하게 비디오 시퀀스에 걸쳐 식민지를 정의하는 두 번째 강화된 이미지, 세 번째로 첫 번째 세그먼트 이미지가 시간이 지남에 따라 식민지의 픽셀의 개수를 측정했습니다. 세 조리법은 48 시간 이상의 개별 hESC 식민지의 성장의 속도를 분석 BioStation 중부 표준시에서 수집한 영상 데이터를 차례로 실행되었습니다. CL - 퀀트 조리법의 신뢰를 확인하려면 동일한 데이터는 어도비 포토샵 소프트웨어를 사용하여 수동으로 분석했다. 데이터가 CL - 퀀트 조리법을 사용하고 포토샵을 비교했다 얻은 때, 결과는 CL - 퀀트 조리법은 진실했다 나타내는 거의 동일했다. 여기에서 설명한 방법은 hESC 또는 식민지에서 성장의 다른 세포의 성장 속도를 측정하는 모든 동영상 데이터에 적용 수 있습니다. 또한, 다른 비디오 생물 정보학의 조리법은 이러한 마이 그 레이션, apoptosis와 세포 유착과 같은 다른 세포 프로세스의 미래에 개발할 수 있습니다.

Protocol

1 부 : 실험 절차

비디오 데이터는 정보의 풍부가 포함되어 있습니다. 그러나,이 정보는 자주 추출하기 어려운 인간에 의해 수동으로 수행하고 완료하기 위해 개인 시간의 많은 시간이 필요할 수 있습니다 때. 인간의 수동 분석도 해석 및 오류의 변화에​​ 따라 달라질 수 있습니다. 동영상 생물 정보학 비디오 이미지에서 특정 데이터를 나와 컴퓨터 소프트웨어의 사용을 포함한다. 분석의이 방법은 신속하고 분석 인간에 의해 수동으로 완료되면 발생하는 오류를 제거할 수 있습니다. 이 문서의 목적은 비디오 생물 정보학 방법을 사용하여 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 quantifying하는 방법을 설명하는 것입니다.

본 논문에서는, 시간 저속 영상은 세포의 여러 분야는 (그림 1) 시간이 지남에 따라 몇 군데있을 수있는 니콘 BioStation 중부 표준시의 배양 장치를 사용하여 수집되었습니다. 이 보고서에서 설명하는 방법은 설정 현미경 모든 동영상 의해 수집된 영상 데이터에 적용됩니다.

우리의 실험 계획법, 우리는 48 시간 동안 12 잘 조직 배양 플레이트에 H9 hESC를 도금. 이 간격 동안 식민지 완전히 첨부하여 Matrigel에 확산하기 위해 허용되었다. 그런 다음, 첨부 hESC 식민지와 접시는 BioStation 중부 표준시로 전송하여 추가로 48 시간 동안 incubated되었습니다. BioStation에있는 동안, 식민지의 이미지는 7 분 간격으로 수집된 나중에 시간 저속 비디오 시퀀스를 생성하는 데 사용되었습니다. 각 식민지에 대한 동영상은 다음 CL - 퀀트 소프트웨어와 함께 개발한 동영상 생물 정보학의 조리법을 사용하여 식민지의 성장을 수치 분석했다. 분석은 CL - 퀀트 소프트웨어가 어도비 포토샵을 사용하여 수동으로 신뢰에 대한 확인되었습니다 만든 요리법을 사용 할.

2 부 : 첨부 hESC 식민지의 작성

1. Matrigel에 코팅 6 자 번호판을 hESC를 성장하고, 한 70 % confluency에 도달, 다음과 같이 12 잘 Matrigel 코팅 강판의 5 우물에 6 자 판 잘 하나를 replate.
2. 잘 포함 hESC에서 매체를 대기음.
3. PBS의 1ml와 2X 잘 씻어.
4. 37 1 분 Accutase과 부화의 1ml을 추가 ° C와 5% CO _2.
5. 우물에 10-12 유리 구슬을 추가하고 식민지 완전히 우물의 바닥에서 분리까지 부드럽게 접시를 흔들.
6. mTeSR 중간 또는 mEF 에어컨 매체의 1ml를 사용하여 Accutase를 무력화.
7. 3 분 200g에서 15ml 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 원심 분리기.
8. 신선한 mTeSR 매체의 500μl로 뜨는 및 휴식 펠렛을 가만히 따르다.
9. 12 잘 플레이트의 각 우물에 hESC 서스펜션의 플레이트 드롭 현명 100μl.
10. 록 플레이트 앞뒤로 부드럽게하고 가벼운 현미경 문화를 관찰합니다. 세포 대단히 짧은 시간이 균일하게 접시에 걸쳐 분산되어 있는지 확인합니다.
11. 인큐베이터에 12 잘 플레이트를 다시 넣으십시오.
12. hESC 48 시간 (짧은 시간 사용할 수있다)를 첨부하고 성장할 수 있습니다.
13. 48 시간 후, PBS의 500ul로 가만히 따르다 매체와 세척 우물은 무소속의 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오.
14. 각 잘하는 mTeSR 매체의 1ml을 추가합니다.
15. 코멘트 즉시 보육 / 비디오 이미징에 대한 현미경으로 접시를 놓습니다.
16. 시간이 경과 이미지를 수집하기 시작. 다른 식민지로 성장 가능성이없는 개별 단일 식민지와 필드를 선택하려고합니다.
17. culturing 및 hESC를 설정하는 다른 방법은 위의 프로토콜 대신에 사용할 수 있습니다.

3 부 : 비디오 생물 정보학

CL - 퀀트 소프트웨어는 순서대로 실행하면 시간이 지남에 따라 각 식민지에 대한 미크론의 픽셀 번호 또는 영역을 결정하는 세 마리 "조리법"를 만드는 데 사용되었다. 세 가지 조리법이 순서에서이 응용 프로그램 빌드가 세분화, 향상 및 측정을 포함합니다.

CL - 퀀트 소프트웨어 / 제조법 개발을 사용하여 hESC 콜로니 성장을 분석 :

1. 세분화 제조법을 먼저 만들어집니다.
2. 동영상 사용할 수 있는지 확인하기 위해 전체 비디오를 검사합니다. 전체 식민지 볼 분야에서 다른 식민지의 필드를 입력하지 않도록 유지 반드시 확인하십시오.
3. 분할 마법사를 열고 "다음"버튼을 클릭하십시오.
4. 올바른 이미지 채널을 (즉, 위상, 녹색, 붉은 색 등)을 선택하고 "다음"버튼을 클릭하십시오.
5. 3 선택에서 "부드러운 일치"를 선택하고 "다음"을 클릭하십시오.
6. 일반적으로 이미지 식민지의 중심지로 식민지의 바깥쪽 가장자리에 지역 순회하여 "싶다"영역을 선택합니다.
   • 이 지역은 가능한 작게해야하지만 전체를 식민지의 대표해야합니다.
   • 위상 콘트라스트 현미경을 사용하는 경우, 소프트웨어에 의해 정확한 식민지 선택에 대한 식민지 주변의 후광을 포함해야합니다.
   • 다른 나타날 수 있습니다 관심을 1 또는 2 지역을 선택픽셀 식민지 내의 패턴 있지만 정확 마스크 응용 프로그램에서 발생할 수 있습니다 너무 많은 "원하는"를 선택하지 않습니다.
7. "다음"버튼을 클릭하십시오.
8. 배경의 일부 식민지의 일부가 아닌 아니라 이미지에 영역을 둘러싼하여 영역을 "싫어"를 선택하십시오. 이들은 당신이 파편과 죽은 세포와 같은 유물을 픽셀을 억제하고 포함하고자하는 패턴을 가지고 지역입니다. "다음"을 클릭하십시오.
9. 당신이 억제하고자하는 지역을 순회하여 "배경"을 선택합니다.
   • "싶지 않다"와 "배경"지역에 그 배경에 차이가 균일 모든 프레임에 표시 가능성이 있어야합니다.
   • 일반적으로 우리는 식민지 주변의 회색 배경을 선택합니다.
10. "다음"버튼을 클릭하십시오.
11. 컬러 마스크는 관심의 영역 (그림 2A)을 통해 표시되어야합니다.
12. 마스크 정확하게 관심의 영역을 커버하지 않는 경우, 분할 임계값 범위 (소프트웨어 화면의 하단 오른쪽 구석에 위치) 증가 또는 감소 될 수 있습니다.
13. 세분화 마법사가 추가로 마스크 영역 미세 조정 필요한 경우 메시지가 나타납니다.
14. 당신이 마스크를 변경하고자하는 경우, "소프트와 일치하는 지역을 업데이트"를 선택합니다. 이것은 "싶지 않다", "원하는"또는 "배경"영역을 변경할 수 있습니다.
15. 마스크가 만족하는 경우, 선택 "임계값을 적용하고 내 마스크를 저장"과 "다음"버튼을 클릭하십시오.
16. 마스크 그런 다음 서로 다른 색상으로 표시됩니다.
17. "Finish"를 선택합니다.
18. 제조법은 소프트웨어의 오른쪽 상단 구석에 표시되어야하고, 그것은 "세분화 제조법"라고해야합니다.
19. 당신은 오른쪽 클릭하여 "이름 바꾸기"로하고자하는 경우 그 제조법의 이름을 바꿉니다.
20. 현장 검사의 경우, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "제조법을 적용"위에 마우스를 놓습니다.
21. 메뉴를 당신이 원하는 프레임의 수를 선택 지점이 제조법을 확인할 때 사용할 수 있습니다는 것을 보여줄 것입니다. 마스크 배치의 정확성을 확인하는 자리 매 10 프레임에 대한 제조법을 실행합니다.
22. 마스크 작은 원치 않는 지역이나 파편의 일부를 집어들고있다면, 당신은 관심의 영역에 마스크의 피팅 향상을 위해 '개선 제조법 "을 만들 수 있습니다.
23. 강화 제조법을 만들려면 마우스 오른쪽 "강화 제조법"폴더를 누른 다음 "새"를 클릭하십시오. 새로운 개선 제조법이 표시되어야합니다.
24. 뷰 (FOV)의 원래의 분야에서 이미지의 오른쪽에있는 '전환 향상 모듈 "버튼을 클릭하십시오. 올바른 하나를 식별 도구 모음에서 아이콘 위로 마우스.
25. '라벨'드롭 다운 메뉴를 선택합니다.
26. "상표 4 연결"을 선택하십시오.
27. 선택 "4 connected2을 라벨."
28. 새로운 작업 표시줄이 표시되어야합니다.
29. 분할의 제조법에서 초기 마스크 (mask0)를 잡고 "입력"상자로 끌어옵니다.
30. 바 이제 "# 입력 마스크"를 표시해야합니다.
31. 마스크 0 아이콘 "# 입력 마스크"로 아이콘을 드래그하십시오.
32. 작업 표시줄에서 "분 크기"를 찾아 관심을 단 영역이 표시될 때까지 숫자를 조정합니다. 당신은 각각의 피팅 재판을 통해 "실행"을 클릭 있는지 확인하십시오.
33. 일단 귀하의 최소 크기 조정 만족, 당신이 이전에 만든 '강화 제조법 "을 클릭하십시오. (그림 2B)
34. 화면 하단의 "조리법에 저장"을 선택합니다.
35. 이 소프트웨어는 이제 "선택된 제조법을 덮어 쓰시겠습니까?", "예"를 선택하라는 메시지가 나타납니다
36. 현장 확인 세분화에 대해서는 위와 같은 절차를 사용하여 강화 제조법을 확인 스팟.
37. 세분화 및 향상 요리법에 만족하는 경우, 오른쪽 도구 모음에서 '측정 템플릿 만들기'를 선택합니다.
38. 원하는 경우에 템플릿 이름을 바꿉니다.
39. 측정 템플릿 창에서 클립 아트 전지 그림 위에 커서를 이동합니다. Ctrl 키를 누른 상태에서 셀을 선택합니다.
40. 선택을 취소 '기본 매개 변수'와 '형태'아래 체크 '영역 매개 변수.
41. 종료 '템플릿'창.
42. 측정 제조법에서 만든 아이콘을 선택합니다.
43. 제조법의 이름을 바꿉니다.
44. 로 이동하고 오른쪽 상단에있는 '템플릿'탭을 선택합니다.
45. 드래그 앤 측정 창에 이전에 만들어진 측정 템플릿을 놓습니다.
46. '예'를 클릭 계속합니다.
47. 측정 제조법 창에서, 선택한 다음 '전체 셀', '채널 매핑.
48. 선택 '마스크 매핑.
49. 강화된 마스크를 선택한 다음 '전체 세포'옵션.
50. 메인 윈도우의 레시피 '탭 아래에있는'측정 제조법 '을 선택하십시오.
51. 측정 제조법 창 내에있는 '저장'아이콘을 선택하십시오.
52. 다음 창을 닫습니다.
53. 이제 닫고 'FOV'를 다시 엽니다.
54. 오른쪽 '레시피'아이콘 선택 '잠금 요리법 목록'을 클릭하여 비디오 데이터를 순차적으로 조리법을 실행합니다.

파트 4 : 포토샵 소프트웨어를 사용하여 조리법의 정확성을 확인

(CL - 퀀트의 softw과 제조법의 유효성을 검사하기 위해서는)입니다, 같은 데이터는 어도비 포토샵과 함께 수동으로 분석할 수 있습니다. 이 분석을 위해, 모든 열번째 프레임 (매주 70 분 시점) 48 시간 동안 식민지 크기를 측정하는 분석했다.

1. 어도비 포토샵의 식민지 이미지의 프레임을 엽니다.
2. 도구 모음의 마술 지팡이 도구를 클릭하십시오.
3. 전체 필드 식민지 지역 제외 덮여 있으므로 식민지 주변을 클릭합니다.
4. 도구 모음에서 '빠른 마스크 모드에서 수정'과 식민지가 선택되어 있으므로 식민지를 누릅니다.
5. 식민지 주변의 점선은 식민지의 주변 권리 맞는 아니라 안에 있는지 확인합니다. 점선은 주변 않을 경우, 적절하게 상단 도구 모음에서 허용 오차 값을 변경합니다.
6. '창'으로 이동 풀다운 메뉴를하고 '히스토그램'을 클릭하십시오.
7. 때 캐시 = 1 픽셀 값을 적어 둡니다. 캐시가 2면, 클릭 '을! " 캐시 1로 변경하고 다음 픽셀 값을 참고합니다.
8. 모든 열번째 프레임에 대해 위의 과정을 반복합니다. 원하는 경우 적은 총 프레임은 사용할 수 있습니다.
9. 데이터 포토샵과 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 수집하면 다음 함께 꾸몄다 수 있습니다. CL - 퀀트 조리법이 진실 경우, 포토샵 및 CL - 퀀트 분석을위한 곡선은 (Figs. 3-5) 매우 유사합니다.
10. CL - 퀀트 개발된 조리법은 진실 경우, 그들은 안정적으로 다른 비디오 데이터에 적용할 수 있습니다.
11. 이 분석에서 비디오 생물 정보학를 사용하여 값을 세분화, 향상 및 측정 요리법이 개발되고 유효성이 확인되면, 그들은 훨씬 더 빠르게 더 정확하게 포토샵을 사용하는 인간보다 분석을 수행할 것입니다.

대표 결과

그림 1 : BioStation 중부 표준시 성장 48 시간 동안 다양한 시간에 프레임을 보여주는 hESC 콜로니의 필름 스트립. 프레임는 7 분 간격으로 찍은.

그림 2 : 분할의 제조법에 의해 식민지에 위치 마스크 hESC의 (A) 이미지. 파편과 배경 영역도 향상 제조법은 평가의 정확성을 향상시키기 위해 필요한 것을 나타내는 마스크입니다. (B) 개선 후 "A"에 표시된 것과 같은 식민지의 이미지가 수행되었습니다. 마스크 지금은 식민지를 선택하고 소음이 선택에서 제거되었습니다.

그림 3 : 48 시간 동안 식민지 크기 증가 (픽셀)를 보여주는 그래프로 CL - 퀀트 소프트웨어와 포토샵을 사용하여 결정됩니다. 이 그래프는 플롯 원시 데이터와 식민지가 다른 크기에서 시작 프로그램을. 또한 측정의 두 가지 방법 좋은 계약에 있는지 보여줍니다.

그림 4 : 48 시간 동안 식민지 크기 % 증가를 표시 정상화 후 그림 3과 같은 데이터를 보여주는 그래프. 이것은 성장 속도에 관계없이 시작 식민지 크기 및 분석의 두 조치 비슷한 결과를주는 유사한 것을 보여줍니다.

그림 5 : 그림 4에있는 정규화된 데이터에 대한 의미를 보여주는 그래프. 이 그래프는 명확하게 동영상 생물 정보학 (CL - 퀀트 소프트웨어)와 포토샵을 사용하여 조리법이 진실입니다 구축 할 분석 사이 좋은 계약을 보여줍니다. 프레임 325에서 포토샵 데이터 영역에서 약간의 침체는 포토샵 분석에 포함되지 않는 여러 개의 동영상을 때문입니다.

Discussion

비디오 생물 정보학 도구는 빠른 속도로 비디오 이미지로부터 데이터를 추출하기위한 강력한 있습니다. hESC 콜로니 성장을 quantifying위한 프로토콜은 생물 학적 문제에 대한 비디오 생물 정보학의 한 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 양적이며 개별 hESC의 식민지에서 공개 데이터의 재미있는 기능이 있습니다. 비디오 생물 정보학의 조리법은 이러한 확산, 마이 그 레이션, apoptosis, 그리고 기판에 세포 부착과 인접 세포에 세포 부착 등 다른 세포 프로세스를 모니터하기 위해 개발된 수 있습니다. 조리법의 정확성은 포토샵을 사용하여 검증되었습니다 CL - 퀀트 소프트웨어를 사용하여 개발하고 솔직 발견되었습니다. 적절한 조리법이 개발되면, 어떤 소스로부터 비디오 데이터는 매우 신속하게 분석할 수 있습니다. 동영상 생물 정보학 도구를 사용하여 비디오 데이터를 분석하는 데 필요한 시간은 포토샵을 사용하여 수작업으로 수행 분석에 필요한 시간보다 훨씬 적습니다. 분석을 수행하는 인간은 이미지 분석 때마다 오류 또는 약간 다른 판단을 내릴 수도 있지만 컴퓨터가, 매번 같은 방식의 데이터를 분석하므로 또한, 컴퓨터에 의해 수행 분석, 오류가 적은 경향이있다. 이 프로토콜의 일부로 논의하지 않지만, 영화도 식민지에서 형태학의 변화에​​ 대한 검사를하실 수 있습니다. 이 매개 변수는 치료 그룹이 포함된 경우에 유용하게 사용될 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).